萬 榮，黃 劍，蘇桂梅，陳錦德，楊鄭州，岑 宇

（百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院；百色學(xué)院亞熱帶特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)學(xué)院；廣西芒果生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西百色 533000）

種桑養(yǎng)蠶傳統(tǒng)生產(chǎn)模式僅采葉養(yǎng)蠶，占桑樹生物產(chǎn)量一半以上的桑枝沒有得到充分利用，資源利用率極低，據(jù)廖森泰等（2009）測算，僅占其生物學(xué)產(chǎn)量的1%～3%。而開展桑樹飼料化利用則是提高其利用率和經(jīng)濟(jì)效益的有效途徑。桑葉及其嫩莖的粗纖維含量高達(dá)8%以上（李有業(yè)和耿鳳琴，2009），如經(jīng)微生物發(fā)酵處理（朱佳文等，2021；朱佳文等，2020；唐慶鳳等，2018；董志浩等，2016），能有效降低粗纖維含量，提升粗蛋白質(zhì)含量，營養(yǎng)價(jià)值改善明顯。

青貯發(fā)酵成功與否的關(guān)鍵因素之一就是益生菌數(shù)量。王林等（2011）報(bào)道，乳酸菌青貯發(fā)酵苜蓿與玉米混合物的最低有效濃度應(yīng)為原料鮮重的105CFU/g。單獨(dú)添加106CFU/g桑葉鮮重的枯草芽孢桿菌明顯提高了發(fā)酵品質(zhì)（董志浩等，2016）。朱佳文等（2021、2020）研究表明，5×106CFU/g枯草芽孢桿菌和107CFU/g枯草芽孢桿菌與地衣芽孢桿菌復(fù)配菌提高了發(fā)酵桑葉粗蛋白質(zhì)含量。但關(guān)于益生菌數(shù)量對桑枝葉發(fā)酵品質(zhì)影響卻鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以桑枝葉為原料，探究添加不同濃度布氏乳桿菌或枯草芽孢桿菌對桑枝葉發(fā)酵品質(zhì)的影響，旨在為桑葉發(fā)酵飼料開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)用的桑枝葉采自廣西百色鑫桂科技有限公司，剔除主桿和發(fā)黃葉片，保留綠葉和尾端50 cm左右嫩枝。布氏乳桿菌和枯草芽孢桿菌購自南昌綠創(chuàng)生物技術(shù)有限公司。發(fā)酵飼料袋規(guī)格30 cm×40 cm，22絲。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 布氏乳桿菌或枯草芽孢桿菌發(fā)酵試驗(yàn)均采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每種益生菌均設(shè)4個(gè)處理組，每個(gè)處理組6個(gè)重復(fù)。對照組不添加任何益生菌；試驗(yàn)組使用布氏乳桿菌或枯草芽孢桿菌，添加量均分別為桑枝葉鮮重的1×106、1×108、1×1010CFU/g（見表 1）。

表1 添加不同益生菌對桑枝葉發(fā)酵品質(zhì)影響試驗(yàn)設(shè)計(jì) CFU/g

1.2.2 發(fā)酵料調(diào)制 帶嫩枝50 cm的桑枝葉刈割后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，流水沖洗去除表面污物，置于陰涼處晾曬過夜，將其水分控制在50%～60%。用切碎機(jī)切碎至2.0～3.0 cm，將已切碎的原料隨機(jī)分為6等份，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將益生菌干粉使用超純水溶解后均勻噴灑到發(fā)酵原料上，對照組使用等量的超純水進(jìn)行噴灑，混合均勻。按照每袋原料500 g裝入帶放氣閥的專用薄膜發(fā)酵飼料袋，人工壓實(shí)后采用電熱封口機(jī)密封袋口，在常溫、避光條件下發(fā)酵15 d。隨后開袋，分析發(fā)酵桑枝葉飼料各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.3 樣品制備 試驗(yàn)料發(fā)酵15 d后打開發(fā)酵袋，取出全部樣品充分混勻，用四分法稱取20 g放入三角燒瓶中，加入80 mL超純水，4℃浸提24 h，然后用雙層紗布和濾紙過濾，測定濾液pH。剩余的發(fā)酵桑枝葉樣品收集起來65℃烘干，稱重，用于干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的常規(guī)測定。

1.3 測定指標(biāo)及方法 pH采用便攜式pH計(jì)測定（型號HANNA HI-8424）；水分含量測定參照GB/T 6435-2014《飼料中水分的測定》；粗蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法，參照GB/T 6432-2018《飼料中粗蛋白質(zhì)的測定方法》；粗脂肪含量測定采用索氏抽取法，利用脂肪測定儀進(jìn)行分析檢測（型號SOX606，購自山東海能科學(xué)儀器有限公司）；中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量測定參照 Van Soest法（Van Soest等，1991），利用纖維測定儀進(jìn)行分析檢測（型號F800，購自山東海能科學(xué)儀器有限公司）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理后，采用SAS9.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA程序），采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度布氏乳桿菌和枯草芽孢桿菌對桑枝葉發(fā)酵過程中pH的影響 由表2可知，隨著布氏乳桿菌添加量的增加pH不斷降低，分別顯著下降32.56%、34.88%和36.63%（P＜0.05）。而枯草芽孢桿菌組的pH僅106水平比對照組顯著下降12.65%（P＜0.05），其余各組差異不顯著（P＞0.05）。從試驗(yàn)結(jié)果看，枯草芽孢桿菌組pH下降幅度僅為布氏乳桿菌組的1/3左右，說明布氏乳桿菌的產(chǎn)酸能力明顯強(qiáng)于枯草芽孢桿菌。

表2 不同濃度布氏乳桿菌和枯草芽孢桿菌對桑枝葉發(fā)酵過程中pH的影響

2.2 不同濃度布氏乳桿菌和枯草芽孢桿菌對桑枝葉發(fā)酵過程中粗蛋白質(zhì)的影響 由表3可知，發(fā)酵15 d后，與對照組相比，不同濃度布氏乳桿菌組的粗蛋白質(zhì)含量均顯著高于對照組（P＜ 0.05），分別提高 11.38%、12.32% 和 13.56%。與對照組相比，枯草芽孢桿菌組也分別提高10.73%、10.17%和12.91%，但4個(gè)處理組之間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同濃度布氏乳桿菌和枯草芽孢桿菌對桑枝葉發(fā)酵過程中粗蛋白質(zhì)的影響

2.3 不同濃度布氏乳桿菌和枯草芽孢桿菌對桑枝葉發(fā)酵過程中中性洗滌纖維的影響 由表4可知，與對照組相比，布氏乳桿菌或枯草芽孢桿菌處理桑枝葉均顯著降低了中性洗滌纖維含量（P＜0.05）；其中，布氏乳桿菌組分別下降32.08%、28.52%和30.47%，枯草芽孢桿菌組下降27.99%、28.73%和31.42%。從下降幅度分析，布氏乳桿菌降解纖維的能力略強(qiáng)于枯草芽孢桿菌。

表4 不同濃度布氏乳桿菌和枯草芽孢桿菌對桑枝葉發(fā)酵過程中中性洗滌纖維的影響 %

2.4 不同濃度布氏乳桿菌和枯草芽孢桿菌對桑枝葉發(fā)酵過程中酸性洗滌纖維的影響 由表5可知，添加布氏乳桿菌或枯草芽孢桿菌均未顯著降低發(fā)酵桑枝葉的酸性洗滌纖維含量，僅呈現(xiàn)略微下降的趨勢，所有處理組間差異不顯著（P＞0.05）。

表5 不同濃度布氏乳桿菌和枯草芽孢桿菌對桑枝葉發(fā)酵過程中酸性洗滌纖維的影響 %

2.5 不同濃度布氏乳桿菌和枯草芽孢桿菌對桑枝葉發(fā)酵過程中粗脂肪的影響 由表6可知，與對照組相比，布氏乳桿菌或枯草芽孢桿菌處理桑枝葉均顯著降低了粗脂肪含量（P＜0.05），其中，布氏乳桿菌組分別下降73.02%、58.20%和57.41%，枯草芽孢桿菌組則下降68.78%、52.12和62.17%。以上結(jié)果說明，布氏乳桿菌和枯草芽孢桿菌均具有很強(qiáng)的降解粗脂肪的能力。

表6 不同濃度布氏乳桿菌和枯草芽孢桿菌對桑枝葉發(fā)酵過程中粗脂肪的影響 %

2.6 不同濃度布氏乳桿菌和枯草芽孢桿菌對桑枝葉發(fā)酵過程中干物質(zhì)的影響 由表7可知，枯草芽孢桿菌組發(fā)酵桑枝葉干物質(zhì)含量顯著高于對照組（P＜ 0.05），分別升高 50.47%、56.79% 和57.49%（P＜0.05）。而布氏乳桿菌組的干物質(zhì)含量僅106水平比對照組顯著升高16.33%（P＜0.05），其余各組差異不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌具有增加發(fā)酵桑枝葉干物質(zhì)含量的能力，而布氏乳桿菌沒有。

表7 不同濃度布氏乳桿菌和枯草芽孢桿菌對桑枝葉發(fā)酵過程中干物質(zhì)的影響 %

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，布氏乳桿菌能明顯降低桑枝葉青貯發(fā)酵飼料pH，隨著布氏乳桿菌添加量的增加，pH不斷降低，這與何瑋等（2021）研究結(jié)果一致，當(dāng)布氏乳桿菌添加量大于105CFU/g（鮮重）時(shí)，玉米青貯發(fā)酵飼料品質(zhì)穩(wěn)定性明顯增強(qiáng)，直到503 h才發(fā)霉變質(zhì)。但枯草芽孢桿菌試驗(yàn)組pH僅106水平比對照組顯著下降12.65%，下降幅度僅為布氏乳桿菌組1/3左右。pH是衡量發(fā)酵飼料品質(zhì)優(yōu)劣的關(guān)鍵指標(biāo)之一，說明布氏乳桿菌產(chǎn)酸能力明顯強(qiáng)于枯草芽孢桿菌。布氏乳桿菌在發(fā)酵過程中能將糖類轉(zhuǎn)化成乳酸等，從而明顯改變發(fā)酵桑枝葉pH，提高有氧穩(wěn)定性防止變質(zhì)（玉柱和孫啟忠，2011；洪梅等，2011）。添加布氏乳桿菌的發(fā)酵桑枝葉粗蛋白質(zhì)含量顯著升高，中性洗滌纖維和粗脂肪含量顯著降低，這與布氏乳桿菌在雜交狼尾草（何瑋等，2021）、玉米秸稈（劉輝等，2021）、高粱（孫向麗等，2021）和馬鈴薯藤（劉齊光，2021）中的青貯發(fā)酵結(jié)果類似。由此可見，布氏乳桿菌能改善原料青貯的發(fā)酵品質(zhì)，提升其營養(yǎng)價(jià)值。添加枯草芽孢桿菌的桑枝葉，粗蛋白質(zhì)含量分別提高10.73%、10.17%和12.91%，粗脂肪顯著降低，與朱佳文等（2020，2021）的試驗(yàn)結(jié)果一致，但統(tǒng)計(jì)上不如布氏乳桿菌的差異顯著?？赡苁且?yàn)榭莶菅挎邨U菌缺乏產(chǎn)酸能力，隨著桑枝葉發(fā)酵時(shí)間延長至15 d時(shí)，發(fā)酵飼料pH偏高，難以抑制有害微生物生長，導(dǎo)致枯草芽孢桿菌自身活性受到嚴(yán)重影響，其產(chǎn)酶能力下降，限制了其提高粗蛋白質(zhì)的能力。

此外，本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加枯草芽孢桿菌能明顯提高發(fā)酵桑枝葉的干物質(zhì)含量，這與朱佳文等（2020）的研究結(jié)果一致。添加布氏乳桿菌則影響很小，僅106水平比對照組顯著升高16.33%，升高幅度也只是枯草芽孢桿菌組的1/3左右。這可能是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌在發(fā)酵繁殖過程中能產(chǎn)生眾多次級代謝產(chǎn)物和菌體蛋白，使得干物質(zhì)含量明顯增多。另一方面原因是布氏乳桿菌本身會造成發(fā)酵飼料的干物質(zhì)損失。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種益生菌106CFU/g（鮮重）添加水平就能顯著改善桑枝葉的發(fā)酵品質(zhì)；布氏乳桿菌的產(chǎn)酸能力和提升粗蛋白質(zhì)含量的能力均明顯強(qiáng)于枯草芽孢桿菌，添加布氏乳桿菌處理桑枝葉的發(fā)酵品質(zhì)優(yōu)于枯草芽孢桿菌。