林 俊，劉 鑫，楊飛云，齊仁立*

（1.重慶市農(nóng)業(yè)學(xué)校，重慶九龍坡 401329；2.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶榮昌 402460；3.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶榮昌 402460）

成年動(dòng)物的肌肉蛋白長期處于合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡。促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)合成，減少蛋白降解是維持正常肌肉體積和生理功能的主要途徑。鈣蛋白酶系統(tǒng)在骨骼肌細(xì)胞的蛋白降解和代謝周轉(zhuǎn)中發(fā)揮重要調(diào)控作用，影響了肌肉發(fā)育和生理穩(wěn)態(tài)，也對(duì)動(dòng)物宰后的肉品嫩度有重要影響（王勝軍等，2016；Tipton和 Wolfe，2001）。

1 鈣蛋白酶系統(tǒng)的組成

鈣蛋白酶系統(tǒng)由多種鈣蛋白酶（Calpain，CAPN）和鈣蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin，CAST）組成。CAPN是一類胱氨酸蛋白酶，可催化不同類型的蛋白底物水解（Hyatt等，2020）。CAPN的活化和蛋白水解功能發(fā)揮都依賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。最主要的CAPN可被分為μ-鈣蛋白酶（1-鈣蛋白酶，CAPN 1）和m-鈣蛋白酶（2-鈣蛋白酶，CAPN 2），它們分別需要微摩爾和毫摩爾Ca2+的激活，在不同組織都有廣泛表達(dá)分布（Huang等，1998）。此外，被發(fā)現(xiàn)了還有13種CAPN同工酶，它們參與了眾多鈣離子調(diào)節(jié)的細(xì)胞活動(dòng)，如信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化等（Du等，2019；Leloup等，2011；張勇等，2007）。

CAST是生物內(nèi)源性專一抑制CAPN活性的蛋白質(zhì)，位于細(xì)胞的胞質(zhì)溶液中，與CAPN共存（Du等，2019；張勇和鄧科，2011）。CAPN與Ca2+結(jié)合后會(huì)產(chǎn)生蛋白結(jié)構(gòu)的變化，CAST能準(zhǔn)確識(shí)別這種變化并與之結(jié)合，抑制CAPN的催化活性（Wendt等，2004）。

骨骼肌組織中主要存在CAPN 1、CAPN 2、CAPN 3和 CAPN 10（Hata等，2020；許梓榮，2002）。CAPN 3在骨骼肌中特異性表達(dá)，在肌原纖維形成方面具有重要作用。CAPN 3基因的突變會(huì)引起肌肉發(fā)育不健全和多種肌營養(yǎng)不良癥，特別是肢帶肌營養(yǎng)不良2A癥也被稱為鈣蛋白酶?。↙asa-Elgarresta等，2019）。還有研究指出，CAPN 3可能參與了骨骼肌細(xì)胞的生成和細(xì)胞凋亡調(diào)控（Dargelos等，2002）。

2 鈣蛋白酶家族結(jié)構(gòu)和激活機(jī)制

2.1 鈣蛋白酶的結(jié)構(gòu) 多數(shù)CAPN都是異源二聚體結(jié)構(gòu)，由序列不同的80kda催化亞基（大亞基）和序列相同的30kda調(diào)節(jié)亞基（小亞基）組成。典型大亞基包括4個(gè)結(jié)構(gòu)域（Ⅰ-Ⅳ），而小亞基包括2個(gè)（Ⅴ、Ⅵ）結(jié)構(gòu)域（圖1）（許梓榮等，2002；Huang等，1998）。

位于氨基端的結(jié)構(gòu)域Ⅰ在CAPN活化后會(huì)發(fā)生自溶，對(duì)維持CAPN空間結(jié)構(gòu)及對(duì)酶活化所需的空間構(gòu)象變化發(fā)揮重要作用。結(jié)構(gòu)域Ⅱ是蛋白酶水解活性的關(guān)鍵部位，由2個(gè)子域組成（Ⅱa和Ⅱb）。構(gòu)象發(fā)生變化后，結(jié)構(gòu)子域Ⅱa上的氨基酸殘基Cys-105和結(jié)構(gòu)子域Ⅱb上的His-262和Asn-286會(huì)接近，并形成催化活性中心（催化三聚體），是蛋白酶的主要水解活性位點(diǎn)。結(jié)構(gòu)域Ⅲ上有1個(gè)由8～10個(gè)酸性氨基酸殘基組成的酸性環(huán)，是結(jié)構(gòu)域Ⅳ和Ⅵ的調(diào)節(jié)中心。酸性氨基酸殘基的數(shù)量越少，Ca2+結(jié)合能力越弱。位于大亞基羧基端的結(jié)構(gòu)域Ⅳ和小亞基上同樣位于羧基端的結(jié)構(gòu)域Ⅵ是鈣離子結(jié)合域，都含有5個(gè)EF-手型鈣離子連接序列。小亞基的另1個(gè)結(jié)構(gòu)域Ⅴ位于氨基末端且富含甘氨酸（約60%左右），具有強(qiáng)疏水作用，對(duì)維持大亞基的正確空間構(gòu)型不可或缺（Reverter等，2001）。

CAPN 3是由單體蛋白組成，增加了3個(gè)獨(dú)立序列結(jié)構(gòu)單元：NS、IS1和IS2，分子量達(dá)到 94KDa（圖 1）（Hata等，2020；Hiroyuki和Yasuko，2012）。CAST 并不能有效結(jié)合和抑制CAPN 3，相反還是CAPN 3的水解底物（齊曾鑫等，2013）。

2.2 鈣蛋白酶抑制蛋白的結(jié)構(gòu) CAST含有5個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域，包括有4個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)單位（I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）和1個(gè)L結(jié)構(gòu)區(qū)。位于氨基末端的L區(qū)是Ca2+的通道調(diào)節(jié)區(qū)，而每個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)單位又包含3個(gè)序列保守區(qū)（A區(qū)、B區(qū)、C區(qū)），是CAPN的抑制區(qū)（圖 1）；楊雪梅等，2007；Wendt等，2004）。

圖1 鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖

2.3 鈣蛋白酶的激活機(jī)制 Moldveanu等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中游離的Ca2+濃度不足時(shí)，CAPN的子結(jié)構(gòu)域IIa和IIb之間的裂縫由于結(jié)構(gòu)域間的相互吸引而被封閉。結(jié)構(gòu)域IIa上和IIb上構(gòu)成酶活性中心的3個(gè)氨基酸殘基Cys105、His262和Asn286彼此分離。當(dāng)細(xì)胞中的Ca2+濃度快速上升到一定程度后會(huì)結(jié)合并誘發(fā)CAPN的結(jié)構(gòu)域構(gòu)象發(fā)生改變，大亞基上的結(jié)構(gòu)域I發(fā)生自溶，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)域IIa和IIb之間的裂縫封閉移除，氨基酸殘基相互接近并形成催化三聚體（酶活中心），CAPN開始發(fā)揮蛋白水解催化活性（Nakagawa等，2001）。

3 鈣蛋白酶調(diào)控的骨骼肌蛋白降解

3.1 骨骼肌蛋白降解的不同途徑 人和動(dòng)物的骨骼肌細(xì)胞中肌原纖維蛋白占肌肉蛋白總量的55%～60%，其中肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白是最主要的兩種（Goll等，2008）。在肌細(xì)胞內(nèi)存在3種主要的蛋白降解途徑：溶酶體途徑、鈣蛋白酶途徑和泛素-蛋白酶體途徑（Neti等，2009）。由于哺乳動(dòng)物的肌原纖維尺寸較大（粗1～3 μm，長 1～ 40 μm），無法進(jìn)入溶酶體（直徑通常0.2～0.8 μm）進(jìn)行分解。而泛素-蛋白酶體只能降解單個(gè)肌原纖維蛋白，當(dāng)肌原纖維交聯(lián)時(shí)就不能被降解（Solomon，1996）。CAPN可能是骨骼肌蛋白降解的發(fā)起者和主要限速步驟，它首先催化肌細(xì)胞中大量肌原纖維解聯(lián)、降解并釋放出粗肌絲和細(xì)肌絲，然后肌絲及其組分蛋白又被其他蛋白水解途徑單獨(dú)或協(xié)同分解。

3.2 鈣蛋白酶系統(tǒng)介導(dǎo)的骨骼肌蛋白降解 CAPN在骨骼肌細(xì)胞中催化的蛋白降解通常只針對(duì)肌原纖維。CAPN參與并調(diào)控了肌原纖維降解并釋放出肌絲的過程（Neti等，2009；趙紅艷，2008）。肌細(xì)胞中的CAPN主要存在于肌原纖維Z線（z-line）附近。CAPN活化后，首先會(huì)迅速分解Z線附近的肌聯(lián)蛋白和伴肌動(dòng)蛋白，然后繼續(xù)分解中間絲蛋白及肌纖維膜上的索蛋白，隨后α-輔肌動(dòng)蛋白等被釋放出來，直至Z線消失（Sorichter等，1999）。分解下來的肌聯(lián)蛋白、肌球蛋白等進(jìn)一步降解還需要泛素蛋白酶體、溶酶體、線粒體蛋白酶等其他水解酶的參與。

3.3 鈣蛋白酶影響動(dòng)物肉品嫩度 CAPN催化的肌原纖維降解也是動(dòng)物肌肉宰后嫩度提高和肉品成熟的主要原因（Huang等，2019；Huff 等，2010；王媛媛等，2006）。正常狀態(tài)下，動(dòng)物肌細(xì)胞中Ca2+濃度較低，不足以激活鈣蛋白酶，而在動(dòng)物處死后，肌漿網(wǎng)上的Ca2+大量外泄，CAPN（主要是CAPN1）被激活，啟動(dòng)肌纖維蛋白降解。動(dòng)物死后肌肉中CAPN 1的活性大概在24h后基本消失。

4 營養(yǎng)對(duì)鈣蛋白酶系統(tǒng)的影響

4.1 營養(yǎng)水平對(duì)鈣蛋白酶系統(tǒng)的影響 日糧營養(yǎng)素或營養(yǎng)水平變化會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物肌肉生理特性的改變與鈣蛋白酶系統(tǒng)存在緊密的聯(lián)系。一些研究認(rèn)為，肌肉中的CAST更容易被日糧營養(yǎng)所影響。Helman等（2003）犬類研究表明，日糧營養(yǎng)水平僅對(duì)CAST產(chǎn)生明顯的影響，但是對(duì)CAPN的催化活性影響不顯著。相似地，Du等（2004）在牛上的試驗(yàn)結(jié)果表明限飼并不影響肌肉中CAPN的活性，但顯著降低了CAST的調(diào)控影響，導(dǎo)致肌肉塊減小。但還有一些研究指出，CAPN也會(huì)受到營養(yǎng)水平的影響。Ilian等（1992）研究發(fā)現(xiàn)，長期禁食使兔的肌肉蛋白降解程度增加2倍，CAPN 1，CAPN 2和CAST的mRNA水平分別提高4.2倍、4.5倍和3.2倍，這使肌肉體積減小并導(dǎo)致骨骼肌萎縮。Tang等（2010）在豬上的研究指出，適度降低營養(yǎng)水平會(huì)增加育肥豬肉品嫩度，增加肌肉中CAPN的mRNA水平。

4.2 功能性營養(yǎng)素對(duì)鈣蛋白酶系統(tǒng)的影響 一些功能性營養(yǎng)物質(zhì)也可影響和調(diào)控鈣蛋白酶系統(tǒng)。使用富含亮氨酸（3%）的食物飼喂帶有癌癥腫瘤的的妊娠母鼠，能強(qiáng)化其子代小鼠肌肉的蛋白周轉(zhuǎn)，保持肌肉組織中CAPN的活性（Miyaguti等，2019）。Choi等（2012）給小鼠補(bǔ)充維生素D3三周發(fā)現(xiàn)，背最長肌中的脂肪含量明顯增加，并提高肌肉中CAPN 1含量，減少CAST含量。給大鼠補(bǔ)充大豆提取蛋白可顯著提高其運(yùn)動(dòng)能力，對(duì)抗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致腿部肌肉損傷，抑制CAPN 1和CAPN 2的激活，提高CAST的蛋白活性（Nikawa等，2002）。Tang等（2008）發(fā)現(xiàn)，在屠宰前 5 d給商品豬補(bǔ)充天冬氨酸鎂（2000 mg/kg）可顯著提高宰后豬肉中CAST含量，減輕運(yùn)輸和屠宰應(yīng)激對(duì)肉嫩度的負(fù)面影響。顯然，研究并建立以鈣蛋白酶系統(tǒng)為靶點(diǎn)的精準(zhǔn)營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)可提高動(dòng)物產(chǎn)肉性狀和改善肉品質(zhì)。

5 小結(jié)

鈣蛋白酶系統(tǒng)在肌細(xì)胞蛋白降解過程中扮演了重要的調(diào)控角色，影響肌肉生長與生理穩(wěn)態(tài)，且對(duì)動(dòng)物肉品質(zhì)具有重要影響。研究并利用精準(zhǔn)營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)靶向調(diào)控CAPN和CAST的表達(dá)與活性，可能是未來提高動(dòng)物產(chǎn)肉量和改善肉品質(zhì)的一種新的調(diào)控措施。