李榮妮，王賽賽，田仲，孫硯勝，張博，張欣*

(1.北京市農(nóng)林科學院 國家淡水漁業(yè)工程技術研究中心，北京 100068；2.漁業(yè)生物重點實驗室，北京 100097；3.中國農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，北京 100193)

金魚Carassiusauratus享有中國 “國魚”之稱，是世界上最早被人工養(yǎng)殖的觀賞魚類之一，也是研究遺傳育種和種內(nèi)演化的適宜試驗素材[1]。作為觀賞魚，金魚多姿多彩的體色是觀賞的亮點，而一般金魚在幼苗階段觀賞性不強，因其呈現(xiàn)出野生鯽體色——青灰色或銀灰色(五花、透明和紫色金魚除外)。隨著其生長會逐漸呈現(xiàn)出變色過程，最后才表現(xiàn)出具有觀賞性的多彩體色，如紅、橙、黃、白、青、藍、紫、墨，或由幾種單色組成的復色等。在金魚發(fā)育生長期間，變色過程較為復雜, 其變色程度和速度因品種、養(yǎng)殖水體環(huán)境和餌料等因素的不同而呈現(xiàn)出明顯的差異[2]。然而，人們對金魚變色的研究多限于生產(chǎn)經(jīng)驗的表型觀察記錄[2-4]，尚未有通過轉錄組水平研究金魚變色的相關報道。

RNA-Seq技術是以二代高通量測序技術為基礎，在特定情況下研究某個物種或特定組織的轉錄組，并通過轉錄組分析實現(xiàn)從整體水平對基因結構和功能的研究，進而揭示疾病發(fā)生過程和特定生物學過程中的分子機理，這也是研究基礎生物學及疾病機理必用的技術方法之一。RNA-Seq主要用于差異表達基因分析、基因表達譜構建、mirco RNA表達譜構建和新基因的發(fā)現(xiàn)等方面[5]。目前，采用RNA-seq技術研究魚類變色的研究主要集中在雙冠麗魚Midascichlids[6]和紅鯽Carassiusauratus[7]等。本研究中，使用RNA-seq技術對不同發(fā)育變色期的紅望天眼金魚皮膚(帶鱗片)進行高通量轉錄本測序，得到了轉錄水平的基因表達信息，通過比較分析這3個不同變色組皮膚組織的差異表達基因，以及差異表達基因的GO功能富集、KEGG通路富集，以期從轉錄組學水平解析金魚的變色機制，為揭示金魚體色發(fā)育調控機制提供分子遺傳學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用金魚取自北京市農(nóng)林科學院水產(chǎn)科學研究所小湯山水產(chǎn)良種繁育基地，品種為蛋種絨球紅望天眼金魚，均為全同胞家系并養(yǎng)殖在同一環(huán)境下。

1.2 方法

1.2.1 養(yǎng)殖管理與樣品采集 于繁殖季節(jié)選擇一雌一雄親魚，人工濕法受精繁殖孵化出苗后，養(yǎng)殖于室內(nèi)玻璃水族箱(130 cm×60 cm×45 cm)中，采用曝氣裝置結合XY-380生化棉過濾器，室內(nèi)自然溫度，自然光照下每天用燈光照射約8 h，養(yǎng)殖用水為晾曬超過48 h的地下水。孵化出的幼魚，15 d內(nèi)投喂活豐年蝦蟲卵，15～60 d內(nèi)投喂由混合紅蟲和粉料加水制成粒徑約4 cm的餅狀飼料，60 d后投喂粒徑2.0 mm的浮性顆粒飼料。每天用吸便器吸出糞便等臟物，視魚攝食情況靈活投喂，以保證魚體健康為主。使用DR900水質檢測儀檢測水質狀況，控制水體的pH為7.0～8.4，溶氧為7.70～9.70 mg/L，亞硝酸鹽<0.02 mg/L，氨氮<0.15 mg/L，視水質狀況靈活換水。

145日齡時，魚平均體長約6 cm，這些全同胞個體變色程度不同呈現(xiàn)出3種狀態(tài)。將這些全同胞個體根據(jù)不同變色程度分為3組：未變色組標記為C(caesious，青灰色)，過渡色組標記為V(variant，過渡色即青灰色和橙紅色的漸近色)，全變色組標記為Y(orange red，橙紅色)(圖1)。從每組隨機取3尾魚，用丁子香酚麻醉，解剖剝?nèi)∶课掺~的全部皮膚(帶鱗片)，隨后立即放入5 mL凍存管中，置于液氮中保存待用。

圖1 全變色組(Y)、過渡色組(V)和未變色組(C)紅望天眼金魚的體色

1.2.2 總RNA 提取和質量檢測 取3組魚的皮膚組織樣品，采用RNA提取試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA,USA)，按照說明書操作分別提取每個樣品的總RNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠分析所提取總RNA的完整性及是否存在DNA污染；采用核酸蛋白測定分光光度計(IMPLEN,USA)檢測RNA的純度；采用Agilent 2100 bioanalyzer 精確檢測RNA的完整性和總量。

1.2.3 文庫構建和測序 采用建庫試劑盒(NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit，Illumina)，依說明書操作建庫，通過磁珠富集法合成cDNA，經(jīng)過對cDNA末端修復、加A 尾并連接測序接頭和擴增純化，得到紅望天眼皮膚組織cDNA 文庫。每個樣品建立一個測序文庫，對建好的文庫進行質檢并精準定量，以保證文庫有效濃度高于2 nmol/L后，在Illumina HiSeq4000 測序平臺進行測序。

1.2.4 測序原始數(shù)據(jù)質控、序列拼接和轉錄本注釋 通過去除含N、帶接頭和低質量reads，實現(xiàn)對原始數(shù)據(jù)過濾，并計算clean data 的GC 含量、Q20和Q30。從NCBI基因組網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Carassius+auratus+(goldfish))下載參考基因組和基因模型注釋文件,進行轉錄組測序數(shù)據(jù)的有參分析。采用HISAT2 2.0.5軟件構建參考基因組索引，并比對配對末端clean reads 和參考基因組[8]，利用StringTie軟件組裝新轉錄本[9]，然后對新轉錄本進行Pfam、SUPERFAMILY、GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫注釋，同時對新基因進行預測。

1.2.5 差異表達基因的比較分析 采用FeatureCounts程序，對映射到每個基因的讀數(shù)進行計算[10]，并基于基因長度計算每個基因的FPKM(每百萬堿基對測序的轉錄本序列片段的每千個堿基片段的預期數(shù)量)[11]。

1.2.6 差異表達基因的富集分析 采用ClusterProfile軟件，對篩選所得差異表達基因進行GO功能富集分析[12]和KEGG通路富集分析[13]，顯著性富集閾值為padj<0.05，篩選出差異表達基因富集參與到變色的主要生化代謝途徑及信號轉導途徑。

1.2.7 qPCR驗證測序結果 以β-actin為內(nèi)參基因，所得差異表達基因中隨機選擇10個基因，設計qPCR引物，采用實時熒光定量儀(MA-6000)對轉錄組數(shù)據(jù)進行驗證。首先采用PrimeScriptTM1st stand cDNA Synthesis逆轉錄試劑盒，將測序剩余的每個樣品總RNA 逆轉錄成cDNA。實際操作時，每個基因進行3個技術重復和3個生物學重復。PCR反應程序：95 ℃下預變性5 min；95 ℃下循環(huán)變性15 s，60 ℃下退火復性30 s，共進行40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct方法計算每個基因的相對表達量，計算兩組間基因表達量倍數(shù)的log2值，并與RNA-seq測序結果進行趨勢比較。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過DESeq 21.20.0軟件計算基因和轉錄本表達水平[14]，并計算3組金魚各3個重復樣品基因表達的平均值，對兩兩組之間的差異表達基因進行比較分析。為了控制錯誤率，利用Hochberg和Benjamini方法調整P值，篩選標準為padj<0.05。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序數(shù)據(jù)的組裝和有參比對

通過Illumina HiSeq4000測序平臺對9個金魚皮膚樣品分別進行測序，過濾接頭、低質量和短序列reads后得到數(shù)據(jù)，并與參考基因組進行比對(表1)。在去除接頭、低質量和短序列后，共獲得高質量序列385 389 146條，共產(chǎn)生過濾后堿基量57.8 Gb，每個樣品的堿基量均達到5.85 Gb以上。每個樣品的測序堿基錯誤率均小于0.03%，GC含量為45.52%～48.52%，Q30大于93.72%，表明測序數(shù)據(jù)質量可靠，可繼續(xù)組裝分析。

9個樣本與參考基因組總比對率均在91.11%以上，比對到唯一位置率在82.57%以上，比對到基因組外顯子區(qū)域的reads數(shù)及其占clean reads數(shù)的比例為89.68%～93.09%(表1)。

表1 紅望天眼金魚樣品轉錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.2 基于金魚皮膚轉錄組測序數(shù)據(jù)的新基因預測

紅望天眼金魚是非模式物種，其基因注釋信息通常不是很完善。比對完成后，尋找基因組未被注釋的轉錄區(qū)，將比對的序列進行組裝，從而挖掘該物種的新轉錄本或新基因。本研究中，對轉錄組測序數(shù)據(jù)進行了新轉錄本組裝，以及Pfam、SUPERFAMILY、GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫注釋，同時共預測新基因1 629個，并對其進行了GO、KEGG注釋。

2.3 不同變色組金魚皮膚轉錄組的差異表達基因

通過兩兩比較不同變色組中存在的差異表達基因，在C與Y組的比較中，篩選出3 955個差異表達基因，其中2 249個基因上調，其余下調；在V與C組的比較中，篩選出2 894個差異表達基因，其中1 287個基因上調，其余下調；在V與Y組的比較中，篩選出927個差異表達基因，其中658個基因上調，其余下調(圖2)。Y和V 組比較中篩選出的差異基因最少，Y與C組比較中篩選出的差異基因最多，而V與C組比較中篩選出的差異基因中等。從圖1可見，Y和V 組在視覺上體色更接近，Y與C組在視覺上反差最大，V組有少部分與C組體色接近，這與篩選出差異基因數(shù)目的趨勢一致。

圖2 3個變色組皮膚轉錄組兩兩比較的差異表達基因

統(tǒng)計不同變色組間差異基因的重疊情況，結果顯示，有25個差異基因屬于3組間共有差異基因，964個差異基因屬于V和C組獨有，有2 021個差異基因屬于C和Y組獨有，有466個差異基因屬于V和Y組獨有(圖3)。

圖3 3個變色組皮膚轉錄組兩兩比較的差異表達基因韋恩圖

將3個不同變色組的差異表達基因取并集后作為差異表達基因集進行聚類分析，聚在一起的為表達模式相近的基因。從圖4可見,V和Y組差異基因集首先聚在一起，C組與其他兩組的差異基因集聚類位置較遠。綜合圖1結果，Y和V 組在視覺上體色更接近，兩者與C組相比視覺上反差更大，與聚類熱圖比較吻合。

圖4 3個變色組皮膚轉錄組差異表達基因聚類熱圖

2.4 差異表達基因的GO富集分析

差異基因GO功能富集分析顯示，3組共有1 417個差異表達基因得到歸類注釋。從GO富集分析結果中，按生物過程、細胞組分和分子功能3大類別(每類選最顯著的10個Term)及差異基因上調和下調分類繪制柱狀圖，結果如圖5～圖7所示。

C和Y組GO功能富集分析顯示：有260個差異基因顯著富集，生物學過程(biological process，BP)中，基因富集顯著的有肽交聯(lián)、氨基酸跨膜轉運、氨基酸轉運、有機酸跨膜轉運、羧酸跨膜轉運、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、離子跨膜轉運、細胞周期阻滯、免疫反應、細胞凋亡調控、細胞凋亡過程的調控、細胞程序性凋亡的調節(jié)、生理節(jié)律等；在細胞組分(cellular component, CC)中，基因富集顯著的有肌球蛋白復合體、肌動蛋白細胞骨架、細胞骨架部分等；分子功能(molecular function, MF)中，基因富集顯著的有轉移酶活性、谷氨酰胺轉移酶蛋白活性、核酸結合調節(jié)區(qū)、細胞因子間受體結合、DNA結合轉錄調控、轉運受體蛋白酪氨酸激酶活性、有機酸跨膜轉運體活性、有機陰離子跨膜轉運體活性、氨基酸跨膜轉運體活性、羧酸跨膜轉運體活性、特異序列的DNA結合和跨膜受體蛋白激酶活性等(圖5)。

圖5 C和Y組金魚差異表達基因的GO功能富集

V和C組GO功能富集分析顯示，有162個差異基因顯著富集，生物學過程中基因富集顯著的有陰離子轉運和動物器官發(fā)育等，細胞組分和分子功能中基因富集的顯著性均不高(圖6)。

圖6 V和C組金魚差異表達基因的GO功能富集

V和Y組GO富集分析顯示，有90個差異基因顯著富集，生物學過程中基因富集的顯著性不高，細胞組分中基因富集顯著的有肌球蛋白復合體、肌動蛋白細胞骨架和細胞骨架部分等，分子功能中基因富集顯著的有肌動活動、蛋白質谷氨酰胺轉移酶活性、轉移酶活性、電壓門控氯離子通道活性、離子通道活動、氯離子通道活動和電壓門控陰離子通道活性等(圖7)。

圖7 V和Y組金魚差異表達基因的GO功能富集

2.5 差異表達基因的KEGG通路富集分析

將3個不同變色組金魚的差異表達基因分別比對到KEGG 數(shù)據(jù)庫中，進行KEGG通路富集分析。選取富集最顯著的20 個通路條目分別繪制KEGG 富集散點圖，結果如圖8～圖10所示。C和Y組差異表達基因主要富集在FoxO信號通路、C型凝集素受體信號通路、mTOR信號通路、胰島素信號通路、細胞因子間受體相互作用、toll樣受體信號通路、P53信號通路、細胞衰老和黑色素生成等通路(圖8)。V和C組差異表達基因主要富集在C型凝集素受體信號通路、P53信號通路、細胞因子間受體相互作用、toll樣受體信號通路、mTOR信號通路、煙酸鹽與煙酰胺代謝、果糖與甘露糖代謝、FoxO信號通路、NOD樣受體信號通路、黑色素生成和細胞衰老等通路(圖9)。V和Y組差異表達基因主要富集在糖酵解/糖異生、酪氨酸代謝和糖代謝信號通路等(圖10)。這些結果反映了紅望天眼金魚變色過程中，可能由多種信號通路共同參與。

圖8 C和Y組金魚差異表達基因的KEGG富集

圖9 V和C組金魚差異表達基因的KEGG富集

圖10 V和Y組金魚差異表達基因的KEGG富集

2.6 3個變色組的共有表達基因

本研究中，對不同變色組間差異表達基因的重疊情況進行統(tǒng)計，結果有25個差異表達基因屬于3組間共有(表2)。查閱這些基因相關研究報道和綜述，主要分為3類：1)調控細胞增殖分化，抑制細胞增殖和促進凋亡的基因，主要包括BTG2、生理節(jié)奏相關轉錄因子、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶轉錄因子、原癌基因c-Fos、P53、真核延伸因子2激酶(e EF2K)、鋅指蛋白等；2)與炎癥反應、適應性有關的基因，主要包括egl 9同源物3樣、磷酸甘露糖變位酶(manB)、類似誘導型一氧化氮合酶、FAM13A蛋白等；3)與色素形成有關的基因，主要包括二羥基吲哚羧酸氧化酶等。從這25個共有差異表達基因可以看出，大部分與細胞增殖分化和凋亡有關，小部分與免疫炎癥反應和適應性有關，僅少數(shù)與黑色素形成有關。

表2 3個變色組魚共有差異表達基因

2.7 測序結果的qPCR驗證

從篩選出的差異表達基因中隨機選擇10個基因，經(jīng)qPCR分析顯示，基本與本研究中RNA-seq轉錄本測序得到的基因表達高低趨勢相吻合，說明本研究轉錄組測序數(shù)據(jù)較為可靠，且對不同組間的差異表達基因能較準確地檢測并篩選出來(圖11)。

圖11 不同組間差異表達基因在RNA-seq和q-PCR中的表達趨勢比較

3 討論

3.1 紅望天眼金魚轉錄組組裝

本研究中，采用Illumina HiSeq4000 測序平臺對紅望天眼金魚轉錄組文庫進行高通量測序，共得到過濾后堿基量57.8 Gb, 樣品Q30堿基百分比均大于93.72%，比多個已發(fā)表的魚類轉錄組測序質量要高，包括斑馬魚Danicrerio(91.93%)[15]、草金魚Carassiusauratus(93.16%)[16]等。與參考基因組比對，各樣品的clean reads總比對率在91.11%以上，且通過qPCR驗證基本與測序結果一致，這說明本研究中測序質量較為可靠。

3.2 紅望天眼金魚不同變色組差異表達基因數(shù)目與體色的關系

本研究中，紅望天眼金魚變色前(C)為青灰色，變色后(Y)全身為橙紅色，視覺差異較大，而過渡色組(V)體色介于兩者之間，更偏向于變色后體色(圖1)。從篩選出的差異表達基因數(shù)目看，金魚變色過程中體色視覺上差異越大，所篩選出的差異表達基因越多；對其聚類分析顯示，V和Y組差異基因集聚在一起，而C組與其他兩組差異基因集的聚類位置較遠，這也與視覺上體色差異大小趨勢一致。本研究結果與對雙冠麗魚[6]不同變色組的轉錄本差異表達基因聚類分析結果相同。由此可見，總體上在金魚變色中體色差異越大，相應篩選出的差異表達基因也越多，參與體色變化的調控基因差異也越大。

3.3 紅望天眼金魚不同變色組差異表達基因的GO功能富集和KEGG通路富集分析

3.3.1 GO功能富集 本研究中，通過對3組差異基因的GO功能富集可知，C和Y組比較富集顯著的差異表達基因較多，V和Y組比較，富集顯著的較少，這與視覺上金魚變色期差異大小趨勢一致。C和Y組比較，GO富集條目在生物學過程、細胞組分和分子功能上均有顯著分布，可見變色前和變色后體表色素細胞分布差別極大；V和C組比較，GO富集條目顯著集中在生物學過程，細胞組分和分子功能中基因富集差別不大；V和Y組比較，GO富集條目顯著集中在細胞組分和分子功能上。本研究中GO富集到的細胞結構與虹彩細胞的細胞結構吻合，這是因為虹彩細胞中色素顆粒的定向運動與微管、肌動蛋白有關[17]。本研究中金魚差異基因的GO富集結果與劉肖蓮等[16]對透明草金魚RNA-seq差異基因GO分析部分條目較為一致，也富集到肌球蛋白復合體、肌動蛋白細胞骨架、細胞骨架部分中。而Henning等[6]對雙冠麗魚3種不同體色階段的轉錄組研究顯示，部分差異表達基因富集在免疫早期反應中，與本研究中GO富集到免疫反應的結果一致。本研究中GO富集的跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路與黑色素形成有關[18]。

3.3.2 KEGG通路富集 本研究中，3組變色程度不同的紅望天眼金魚差異表達基因KEGG通路富集到的通路主要與細胞增殖分化和凋亡、免疫反應及色素等相關。涉及細胞增殖分化和凋亡的信號通路，如FoxO、BTG2、P53、mTOR、Hedgehog(Hh)和酪氨酸激酶等；涉及免疫反應的信號通路，如FoxO、C型凝集素受體信號通路和toll樣受體信號通路等；涉及色素相關的信號通路，如酪氨酸通過一系列氧化還原反應生成的黑色素[18]；涉及糖代謝的通路，如胰島素信號通路、糖異生及果糖與甘露糖代謝等，而有報道顯示，糖代謝與虹彩細胞有關[19]。本研究中，紅望天眼金魚變色過程的差異表達基因KEGG通路富集與紅鯽[7]有部分相同，紅鯽變色過程差異表達基因也有富集在黑色素信號通路、酪氨酸代謝信號通路、脂肪信號通路、細胞自噬信號通路和細胞凋亡信號通路等。金魚起源于野生鯽，由紅黃色野生鯽演化成金鯽[1]，后經(jīng)人工飼養(yǎng)繁育而成。有報道顯示，紅鯽的演變與紅色金魚相似，均經(jīng)過變色過程，初為銀灰色，經(jīng)60 d左右變?yōu)榧t色[3]。由此推測，調控紅望天眼金魚與紅鯽變色的生理和分子機制也有相同之處。本研究中，KEGG通路富集結果與對雙冠麗魚變色研究中富集到黑色素合成信號通路和免疫早期反應的結果一致。這些結果反映了紅望天眼金魚在變色過程中，與紅鯽、雙冠麗魚變色過程中所涉及的很多通路相同，推測可能由多種信號通路共同參與完成。

3.4 紅望天眼金魚變色機制分析

3.4.1 鯽屬魚類變色過程觀察 魚類的變色過程比較復雜，其速度和程度可因品種、水體環(huán)境和餌料品種等有明顯不同[2]。伍惠生[3]報道顯示，紅鯽的演變與紅色金魚相似，由銀灰色經(jīng)過60 d左右變?yōu)榧t色。也有對紅白金魚變色記載：紅白金魚45 d開始少數(shù)變色，60 d變色比例增加，120 d體色基本穩(wěn)定下來，剩余的青灰色個體在較長一段時間內(nèi)不會再變色，魚苗變色均開始于魚的腹部，逐漸到頭部，再逐漸到魚背部及尾部，最后到達全身[4]。也有研究者發(fā)現(xiàn)，有些黑色個體金魚在2～3年后易褪色成為紅色個體[3]。本試驗中，金魚為全同胞的紅望天眼金魚且養(yǎng)殖在同一環(huán)境中，一年內(nèi)變色完成，魚苗變色也是從腹部開始，慢慢到頭、背和尾，最后到全身。可見，品種不同，變色速度和程度也不同，這說明變色現(xiàn)象受遺傳影響，其本質上是受基因調控。

3.4.2 飼料對魚類變色的影響 飼料是魚類生長和維持正常生命活動所必需的營養(yǎng)來源，尤其是魚類自身不能合成類胡蘿卜素等色素物質，必須從飼料中獲取。一方面，飼料中的營養(yǎng)對魚類體色的影響直接通過色素細胞或色素物質發(fā)揮作用；另一方面通過影響魚類整體生理機能，使魚類正常生理活動出現(xiàn)障礙，造成魚類體色發(fā)生改變[20]。這可以解釋魚類在營養(yǎng)豐富的情況下，變色速度較快，體色也出現(xiàn)較為明艷的現(xiàn)象。本研究中，紅望天眼金魚KEGG通路部分富集到胰島素信號通路、糖異生、果糖與甘露糖等糖代謝，以及脂肪酸合成和氨基酸合成通路等，這說明變色過程中糖類等能量營養(yǎng)的重要性。目前，國內(nèi)外學者對魚類早期體色褪黑這一復雜生物學過程的研究相對較少，其調控機制尚無明確定論[21]。

3.4.3 魚類變色過程中黑色素細胞的增殖與凋亡 目前，對觀賞魚體色研究大部分均從色素細胞代謝、色素沉積與形成等方面進行探討。在魚類中已鑒定出6 種色素細胞，包括黑色素細胞、黃色素細胞、紅色素細胞、虹彩細胞、白色素細胞和藍色素細胞[22]。對黑色素細胞的相關研究較多，對黃、紅色素和虹彩細胞的研究相對較少，對魚類早期體色褪黑現(xiàn)象也主要從黑色素形成和凋亡通路方面報道較多，而對其他色素細胞增殖和分化通路極少報道。紅鯽[7]和雙冠麗魚[6]早期體色發(fā)育變色過程，主要由皮膚和鱗片中色素變遷，黑色素細胞的消退，以及紅黃色素細胞的增加所造成的。而紅色金魚體色的演變與紅鯽相似，均經(jīng)歷變色過程，結合本研究中對紅望天眼金魚變色過程的觀察，推測紅望天眼金魚也與以上魚類的變色過程相同。在哺乳類動物中也有褪色現(xiàn)象，有報道顯示，有一種灰色馬，剛出生時毛色是灰黑色，6～7年后逐漸褪色成白馬，但皮膚終生為灰黑色，同時伴隨著老年時易發(fā)生黑色素瘤的現(xiàn)象，這是由STX17基因的第6內(nèi)含子一個4.6 kb序列的加倍所致[23]，但該研究并未明確解釋具體原因。魚類和哺乳類褪色現(xiàn)象有明顯的不同，紅望天眼金魚、紅鯽和雙冠麗魚變色過程中，明顯可觀察到鱗片和皮膚均同步褪黑變色，且在紅鯽和雙冠麗魚變色過程中，觀察到黑色素細胞逐漸凋亡直到消失[6-7]。有學者認為，可能是黑色素顆粒在細胞發(fā)育過程中無法繼續(xù)合成，從而導致黑色素細胞消失，這種現(xiàn)象可能與紅鯽的生長發(fā)育過程中各種信號通路調控黑色素細胞有關[7]。

3.4.4 紅望天眼金魚變色機制推測 本研究中，對紅望天眼金魚3個不同變色時期的RNA-Seq數(shù)據(jù)進行3組共有差異表達基因、GO和KEGG富集分析，結果均涉及細胞增殖分化與凋亡、免疫反應和色素形成等相關信號調控。通過在實際生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中觀察，紅望天眼金魚體色越臨近變色，體色發(fā)黑越濃，隨后黑色逐漸褪去，體色變?yōu)槌燃t，結合紅鯽色素細胞變遷規(guī)律[7]，筆者初步推測，紅望天眼金魚變色的機制是：紅金魚變色初期黑色素細胞大量增殖，隨后開始逐漸凋亡，其他色素細胞則同時逐漸分化增殖，直至完全取代黑色素細胞，期間發(fā)生免疫炎癥反應，直至變色完成。本研究中，KEGG富集到的通路部分與細胞增殖分化和凋亡有關，如FoxO、BTG2、P53、mTOR、Hh等信號通路，可能這些通路共同參與了調節(jié)黑色素細胞增殖凋亡和其他色素細胞的增殖分化過程。在紅鯽體色細胞變遷中，發(fā)育初期黑色素細胞和其他色素細胞是共存于魚鱗片和皮膚中的，變色開始后，僅黑色素細胞逐漸發(fā)生凋亡[7]。本試驗中，紅望天眼金魚發(fā)育初期體色也是同紅鯽相同為青灰色，不同的是越臨近變色，體色發(fā)黑越濃，隨后黑色逐漸褪去，體色變?yōu)槌燃t。由此推測，紅望天眼金魚極可能也是發(fā)育初期黑色素細胞與其他細胞共存，臨近變色黑色素細胞增殖更多，隨后開始大量凋亡，同時其他色素細胞增殖分化逐漸取代黑色素細胞。

臨近紅望天眼金魚變色時是何原因導致了鱗片和皮膚黑色素細胞大量增殖且隨后凋亡直至消失，變色過程中為何會伴隨著免疫反應，這些問題還需進一步分析。蔣燕玲[24]報道顯示，大部分的硬骨魚類黑色素細胞最先發(fā)育，黃色素細胞發(fā)育比黑色素細胞晚，紅色素細胞發(fā)育又晚于黃色素細胞，虹彩色素細胞發(fā)育晚于黑色素細胞和黃色素細胞。據(jù)此推測，可能是黑色素細胞先發(fā)育后，隨著魚類機體整體生長發(fā)育的進行，相對于其他色素細胞，營養(yǎng)物質優(yōu)先供應黑色素細胞生成通路，使得黑色素細胞增殖過快，黑色素含量過高，引發(fā)了免疫反應。而魚類體內(nèi)適當?shù)暮谏乜梢员Ｗo皮膚免受輻射, 還可抵抗環(huán)境污染等因素帶來的危害, 但體內(nèi)過多或過少的黑色素會導致一些疾病如霉病等發(fā)生[25]。本研究中，經(jīng)過RNA-seq測序分析表明，變色前、中、后共有差異表達基因中有5，6-二羥基吲哚羧酸氧化酶，而該酶是黑色素合成的中間體, 可將5，6-二羥基吲哚羧酸(DHICA)氧化脫羧成5，6-二羥基吲哚(DHI)，DHI是一種比DHICA毒性更強的中間體,其濃度過高時可降低體內(nèi)黑色素細胞數(shù)量[26]，從而促進黑色素細胞凋亡。

本研究中，從紅望天眼金魚3個變色組25個共有差異表達基因中挑選參與黑色素形成、細胞增殖與凋亡的相關基因：基因LOC113044200和LOC113106593均涉及二羥基吲哚羧酸氧化酶，該酶在黑色素的形成中具有十分重要的作用[18]；基因LOC113056313與e EF2K有關，e EF2K的表達水平或者活性的改變影響細胞周期、分化、凋亡及自噬等生理進程[27]；基因LOC113120002涉及生理節(jié)奏相關的轉錄抑制因子，而生理節(jié)奏相關轉錄因子參與代謝、內(nèi)分泌、細胞增殖分化與凋亡及免疫等方面[28]；基因LOC113097315與c-Fos原癌基因有關，而c-Fos作為轉錄調節(jié)因子是核內(nèi)重要的癌蛋白(Fos)，能夠瞬時誘導觸發(fā)其他特異基因的表達,其在細胞的分化、增殖及凋亡生理過程中起到重要的調節(jié)作用[29]。由此可見，基因LOC113044200和LOC113106593參與黑色素形成，基因LOC113056313、LOC113120002和LOC11309-7315參與細胞增殖和凋亡，這5個基因可作為紅金魚變色的候選基因進行后續(xù)研究。

4 結論

1)采用RNA-Seq技術對紅望天眼金魚不同變色組轉錄組文庫進行高通量測序，共得到過濾后堿基量57.8 Gb，構建新轉錄本并預測新基因1 629個，通過差異表達分析篩選出25個共有差異表達基因，通過GO功能富集和KEGG通路富集分析，差異表達基因主要富集到細胞增殖分化與凋亡、免疫反應和黑色素形成等相關通路。

2)初步推測紅望天眼金魚變色的生理機制是紅望天眼金魚變色初期黑色素細胞大量增殖，期間發(fā)生免疫炎癥反應，隨后開始逐漸凋亡，同時其他色素細胞逐漸分化增殖，直至完全取代黑色素細胞，完成變色過程。本試驗結果有利于人們進一步理解紅金魚體色變遷的原因，同時為下一步開展調控金魚變色的功能基因試驗和金魚變色的分子機理研究提供科學參考。