石佳，徐爽，王博，謝曉晨，李晨，方蕾

(大連海洋大學(xué) 海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連 116023)

鹽地堿蓬Suaedasalsa別名嚴(yán)蒿、黃須菜，又名翅堿蓬，隸屬于藜科Chenopodiaceae堿蓬屬Suaeda，一年生草本植物，主要生長(zhǎng)于海濱、湖邊、荒漠等鹽堿地[1]。鹽地堿蓬成熟株高為20～80 cm，莖和葉為綠色或紫紅色，有典型的葉片肉質(zhì)化現(xiàn)象[1]。鹽地堿蓬是可食用的食材，具有較好的藥用價(jià)值[2-4]。此外，鹽地堿蓬還是修復(fù)改良受污染鹽堿土壤的重要植物資源，具有重要的生態(tài)價(jià)值[5-6]。

中國(guó)的渤海、黃海和東海沿岸分布著大面積鹽地堿蓬濕地[7]。作為陸地和海洋生態(tài)系統(tǒng)間的過(guò)渡地帶，鹽地堿蓬濕地具備多重生態(tài)服務(wù)功能，能夠固定和降解污染物，滯留營(yíng)養(yǎng)物，保護(hù)海岸免受侵蝕，且能夠繁衍大量底棲動(dòng)物，為鳥(niǎo)類(lèi)提供棲息地，此外，其還具有極高的景觀價(jià)值，是生態(tài)旅游的極佳場(chǎng)所[7]。受土壤鹽漬化、水體污染及人類(lèi)過(guò)度開(kāi)發(fā)(筑壩、修路)等因素影響，自2000年起，遼河口灘涂出現(xiàn)鹽地堿蓬大面積群落退化現(xiàn)象，使得鹽地堿蓬濕地原本具備的防洪抗旱、調(diào)節(jié)氣候和控制污染等環(huán)境功能逐步喪失[8-9]。因此，開(kāi)展遼河口鹽地堿蓬濕地修復(fù)相關(guān)研究具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。

研究表明，植物能夠選擇性地招募對(duì)其生長(zhǎng)和抗逆有益的微生物群系并與之共生[10-11]。在植物組織內(nèi)部普遍定殖內(nèi)生細(xì)菌，其中一部分就是植物促生菌，其促生機(jī)制與植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria)相似，能夠改變宿主植物激素水平，促進(jìn)宿主植物吸收營(yíng)養(yǎng)鹽，誘導(dǎo)宿主植物產(chǎn)生“系統(tǒng)抗性”以對(duì)抗生物和非生物脅迫等[10-14]。植物內(nèi)生菌在植物促生和生防保育中的應(yīng)用一直是研究熱點(diǎn)[10]。目前，已報(bào)道的有促生作用的植物內(nèi)生菌種類(lèi)繁多，宿主來(lái)源廣泛，促生機(jī)制多樣。分離自水稻OryzasativaL.根部的芽孢桿菌屬內(nèi)生細(xì)菌Bacillusparalicheniformis能夠促進(jìn)宿主固氮[15]；分離自大豆不同組織的多株內(nèi)生細(xì)菌，包括腸桿菌屬細(xì)菌Enterobacterludwigii、根癌農(nóng)桿菌Agrobacteriumtumefaciens、黏質(zhì)沙雷菌Serratiamarcescens等，能夠拮抗宿主致病真菌和致病細(xì)菌[16]；分離自鷹嘴豆CicerarietinumL.根瘤的一株內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis能夠顯著改善宿主在鹽漬土壤中的生長(zhǎng)狀況和抗病能力[17]。但有關(guān)鹽地堿蓬內(nèi)生細(xì)菌對(duì)宿主的促生作用鮮有報(bào)道。

本研究中，從遼河口濕地野生鹽地堿蓬葉片中分離可培養(yǎng)細(xì)菌并從中篩選出能夠產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)ACC脫氨酶的潛在促生菌，通過(guò)定植接種水培鹽地堿蓬幼苗試驗(yàn)，篩選出一株能夠顯著促進(jìn)植物根系伸長(zhǎng)和株高增長(zhǎng)的內(nèi)生細(xì)菌，首次報(bào)道了鹽地堿蓬內(nèi)生細(xì)菌的促生作用，可望為遼河口鹽地堿蓬植被恢復(fù)提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用鹽地堿蓬植株于2020年8月采自遼寧省盤(pán)錦市紅海灘國(guó)家風(fēng)景廊道，鹽地堿蓬種子于2020年11月采自遼河口潮灘濕地?；ㄍ临?gòu)自大連市花市。

試驗(yàn)用2216E瓊脂(HB0132)、2216E培養(yǎng)基(HB0132-1)購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色液試劑盒購(gòu)自北京索萊寶(Solarbio)科技有限公司；PCR反應(yīng)試劑盒為寶日醫(yī)(TaKaRa)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的TaKaRa PCR Amplification Kit(R011)，PCR引物及測(cè)序引物使用通用引物27F(5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3′)和 1492R(5′TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3′)。

試驗(yàn)用改良霍格蘭培養(yǎng)液配方：A類(lèi)溶液(無(wú)菌純水配制)包含四水硝酸鈣 945 mg/L、硝酸鉀 506 mg/L和硝酸銨80 mg/L;B類(lèi)溶液(無(wú)菌純水配制)包含磷酸二氫鉀 136 mg/L、七水硫酸鎂 493 mg/L、鐵鹽溶液 2.5 mL和微量元素溶液 5 mL(pH 6.0)，其中，鐵鹽溶液中包含七水硫酸亞鐵 2.78 g、乙二胺四乙酸二鈉 3.73 g和蒸餾水 500 mL(pH 5.5)，微量元素溶液(無(wú)菌純水配置)中包含碘化鉀 0.83 mg/L、硼酸 6.2 mg/L、硫酸錳 22.3 mg/L、硫酸鋅 8.6 mg/L、氯化鈷 0.025 mg/L和硫酸銅 0.025 mg/L。取A類(lèi)、B類(lèi)溶液各100 mL，定容至1 L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 方法

1.2.1 鹽地堿蓬葉片內(nèi)生細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將采集自盤(pán)錦紅海灘國(guó)家風(fēng)景廊道的鹽地堿蓬植株由冰盒帶回，將植株地上部分用無(wú)菌水沖洗3次，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇浸泡1 min，再用無(wú)菌水沖洗一次，用無(wú)菌鑷子取幾片鹽地堿蓬葉子，置于無(wú)菌研砵中加20 mL無(wú)菌海水研成勻漿。再將勻漿液用無(wú)菌海水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6。對(duì)稀釋至10-3、10-4、10-5和10-6的勻漿液，分別取0.1 mL涂布到2216E瓊脂平板上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后用接種環(huán)挑取形態(tài)不一樣的菌落繼續(xù)劃線(xiàn)培養(yǎng)，重復(fù)多次后得到單一菌落。將單菌落用接種環(huán)挑取到裝有無(wú)菌2216E液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，25 ℃下以120 r/min搖床培養(yǎng)，每隔4 h取1 mL菌液，用721分光光度計(jì)測(cè)定OD600 nm(有效讀數(shù)為0.1～0.8，讀數(shù)超過(guò)0.8的菌液需進(jìn)行稀釋使得讀數(shù)在0.1～0.8)，至菌液OD600 nm不再增長(zhǎng)即細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)停止取樣，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。取0.75 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液(OD600 nm=0.6～0.8)置于凍存管中，加入0.25 mL滅菌甘油，混勻后置于-80 ℃超低冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鹽地堿蓬可培養(yǎng)葉片內(nèi)生細(xì)菌的分子鑒定 取1 μL分離獲得的鹽地堿蓬可培養(yǎng)葉片內(nèi)生細(xì)菌新鮮菌液，加入9 μL無(wú)菌水，混勻后于100 ℃下煮沸10 min，取0.5 μL煮沸的菌液作為PCR擴(kuò)增模板，用通用引物27F和1492R擴(kuò)增16S rRNA基因。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃下預(yù)變性3 min；95 ℃下循環(huán)變性30 s，55 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸90 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下總體延伸7 min，16 ℃下保存。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增出一條明晰條帶后，將PCR產(chǎn)物直接送至華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。將16S rRNA基因序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Nucleotide BLAST(BLASTn)比對(duì)，查找同源序列，進(jìn)行分類(lèi)鑒定。

1.2.3 鹽地堿蓬可培養(yǎng)葉片內(nèi)生細(xì)菌溶磷、解鉀和固氮能力的定性試驗(yàn)

1)細(xì)菌溶磷能力的定性試驗(yàn)。采用PKO(溶磷菌篩選培養(yǎng)基)平板檢測(cè)法[18]，取1 μL活化好的菌液，將其點(diǎn)種在PKO無(wú)機(jī)培養(yǎng)基平板中央，28 ℃下倒置培養(yǎng)。7 d后取出平板，觀察水解圈的有無(wú)，并測(cè)量水解圈的直徑。具有溶磷功能的細(xì)菌會(huì)在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生水解圈，且溶磷能力越強(qiáng)水解圈越大。

2)細(xì)菌解鉀能力的定性試驗(yàn)。采用解鉀菌篩選培養(yǎng)基平板檢測(cè)法[19]，取1 μL活化好的菌液，將其點(diǎn)種在解鉀菌篩選培養(yǎng)基平板的中央，培養(yǎng)及觀察過(guò)程同細(xì)菌溶磷能力定性試驗(yàn)。

3)細(xì)菌固氮能力的定性試驗(yàn)。采用阿須貝氏平板檢測(cè)法[20]，取1 μL活化好的菌液，將其點(diǎn)種在阿須貝氏培養(yǎng)基平板中央，28 ℃下倒置培養(yǎng)。7 d后取出平板，觀察菌落大小和形態(tài)。具有固氮能力的細(xì)菌會(huì)長(zhǎng)出黏稠、半透明、白色或褐色的菌落。

1.2.4 鹽地堿蓬可培養(yǎng)葉片內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)鐵載體能力的定性試驗(yàn) 采用鉻天青(Chrome azurol S，CAS)平板法[21]，用接種環(huán)挑取菌落接種于 CAS 平板中央，28 ℃下倒置培養(yǎng)2 d。產(chǎn)鐵載體菌株表現(xiàn)為在菌苔周?chē)纬沙赛S色暈圈，若無(wú)橙黃色暈圈產(chǎn)生則表示該菌株無(wú)產(chǎn)鐵載體能力。

1.2.5 鹽地堿蓬可培養(yǎng)葉片內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)ACC(1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸，1-aminocyclopropane-1-carboxylate)脫氨酶能力測(cè)定 參照Penrose等[22]的方法，用接種環(huán)挑取菌落接種至50 mL PAF(Pseudomonasagar F)培養(yǎng)基中，28 ℃下以200 r/min振蕩培養(yǎng) 24 h，吸取1 mL菌懸液接種至 50 mL DF(Dwrokin and Foster medium)培養(yǎng)基中，28 ℃下以200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。按相同方法將DF培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接培養(yǎng) 3 次得菌懸液。梯度稀釋該菌懸液(取1 mL菌液加入19 mL無(wú)菌ddH2O中，重復(fù)3次得到的梯度稀釋液)，分別取1 mL不同稀釋倍數(shù)的菌液涂布于 ADF 平板，28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察生長(zhǎng)情況。在ADF平板有菌落長(zhǎng)出的細(xì)菌，表示能產(chǎn)ACC脫氨酶，反之則不產(chǎn)ACC脫氨酶。

1.2.6 鹽地堿蓬的栽培 于2021年3月，挑選籽粒飽滿(mǎn)的鹽地堿蓬種子，用自來(lái)水浸泡過(guò)夜后，將種子撒在裝好花土的圓形花盆(直徑為20 cm，高為20 cm)中，每盆撒約100粒種子，種子上覆蓋0.5～1.0 cm厚度的花土，初次澆水澆透，室外栽培，隔天澆水一次。種子發(fā)芽后繼續(xù)土培3周左右。

1.2.7 水培鹽地堿蓬定植接種試驗(yàn) 取-80 ℃下保存的鹽地堿蓬可培養(yǎng)葉片內(nèi)生細(xì)菌，接種到1 mL 2216E液體培養(yǎng)基中，25 ℃下以120 r/min搖床培養(yǎng)24 h至菌液渾濁。用接種環(huán)取菌液接種至2216E瓊脂平板，連續(xù)劃線(xiàn)后置于25 ℃下培養(yǎng)24 h得到單菌落。取單菌落接種至2216E液體培養(yǎng)基中，25 ℃下以120 r/min搖床培養(yǎng)得到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液(OD600 nm=0.6～0.8)，以3 000g離心5 min，收集菌體，棄上清液，將菌體重懸于適量無(wú)菌改良霍格蘭培養(yǎng)液至終濃度為106cells/mL，供定植接種鹽地堿蓬幼苗用。

取3周齡鹽地堿蓬土培幼苗，用無(wú)菌水小心洗凈泥土，插置于上覆無(wú)菌牛皮紙、下裝100 mL無(wú)菌改良霍格蘭培養(yǎng)液的18個(gè)燒杯中，每個(gè)燒杯放置10株幼苗，置于光照培養(yǎng)箱(12 h光照∶12 h 黑暗，照度12 000 lx)25 ℃下暫養(yǎng) 1 d,分別測(cè)量幼苗根長(zhǎng)和株高，再將幼苗轉(zhuǎn)移至含5種鹽地堿蓬葉片內(nèi)生菌的改良霍格蘭培養(yǎng)液中，同時(shí)設(shè)置不加菌的空白對(duì)照組。試驗(yàn)共設(shè)6組，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，置于光照培養(yǎng)箱(12 h光照：12 h 黑暗，照度12 000 lx)25 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)14 d，再次測(cè)量幼苗根長(zhǎng)和株高，并計(jì)算根長(zhǎng)伸長(zhǎng)值和株高增長(zhǎng)值。通過(guò)T檢驗(yàn)判斷感染組幼苗根長(zhǎng)伸長(zhǎng)值、株高增長(zhǎng)值與對(duì)照組是否有顯著性差異。

1.2.8 鹽地堿蓬潛在促生細(xì)菌的形態(tài)觀察 挑取鹽地堿蓬潛在促生菌單菌落，接種至1 mL 2216E液體培養(yǎng)基中，25 ℃下以120 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600 nm=0.6～0.8)，取適量菌液涂布于潔凈載玻片上，按照索萊寶提供的革蘭氏染色液使用說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行固定、初染、媒染、脫色、復(fù)染，在油鏡下鏡檢。

1.2.9 基于鹽地堿蓬潛在促生細(xì)菌16S rRNA序列的進(jìn)化分析 基于鹽地堿蓬潛在促生菌16S rRNA基因序列的BLASTn比對(duì)結(jié)果，選擇覆蓋度大于91%、一致性大于99.7%且已鑒定到種的同屬細(xì)菌，同時(shí)選擇同源性較低的同屬其他種細(xì)菌，使用MEGA 7軟件，用Clustal W對(duì)其16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，再使用鄰位相接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，自展檢驗(yàn)(bootstrap)1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽地堿蓬可培養(yǎng)葉片內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定和生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定

通過(guò)2216E瓊脂平板劃線(xiàn)，從野生鹽地堿蓬葉片分離得到6株可培養(yǎng)細(xì)菌，編號(hào)分別為JY21、JY24、JY32、BJY111、BJY223和BJY323，分別對(duì)單株細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA基因全長(zhǎng)擴(kuò)增及測(cè)序?；?6S rRNA基因序列的BLASTn結(jié)果表明：JY21菌與LarsenimonassalinaL1-16、Chromohalobactersp.BG-1-R4菌的同源性最高，在90%覆蓋度下一致性均為99.39%，與L.suaedaeST307在90%覆蓋度下一致性為99.23%(該細(xì)菌是同樣分離自鹽地堿蓬葉片和莖組織的內(nèi)生菌[19])；JY24菌與Kushneria屬細(xì)菌同源性最高，在98%覆蓋度下一致性高于98.50%，包括K.konosiri、K.marisflavi和K.sp.ET2115等；JY32菌未能比對(duì)到同源屬，與基因庫(kù)中多株不可培養(yǎng)細(xì)菌高度同源；BJY111菌與多株P(guān)seudoalteromonas屬細(xì)菌在99%覆蓋度下一致性高于99.00%，包括P.sp.CF11-6、P.sp.CF14-5和P.ganghwensisWAB2129等；BJY223菌與多株P(guān)seudoalteromonas屬細(xì)菌在91%覆蓋度下一致性均為99.85%，包括P.sp.C82、P.sp.C73和P.lipolyticaQS176等，但是BJY223菌與BJY111菌的16S rRNA序列并不一致，推測(cè)二者可能是同屬不同種的細(xì)菌；BJY323菌與多株Enterobacter屬細(xì)菌在99%覆蓋度下一致性高于99.50%，包括E.ludwigii、E.cloacae等。

這6株菌在2216E液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖1所示。JY21菌生長(zhǎng)延遲期不明顯，4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液OD600 nm為0.5～2.0(圖1(a));JY24菌生長(zhǎng)延遲期較長(zhǎng)，至24 h才進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，32 h進(jìn)入穩(wěn)定期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液OD600 nm為0.4～2.0(圖1(b));JY32菌生長(zhǎng)延遲期長(zhǎng)，至28 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，40 h進(jìn)入穩(wěn)定期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液OD600 nm為0.5～3.0(圖1(c));BJY111菌生長(zhǎng)延遲期短，4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16 h進(jìn)入穩(wěn)定期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液OD600 nm為0.4～2.5(圖1(d));BJY223菌培養(yǎng)4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液OD600 nm為0.3～2.5(圖1(e));菌株BJY323培養(yǎng)4～12 h，OD600 nm增長(zhǎng)較快，從0.23增至1.105，之后增長(zhǎng)幅度放緩，但仍持續(xù)增長(zhǎng)，至44 h進(jìn)入穩(wěn)定期(圖1(f))。

圖1 鹽地堿蓬葉片可培養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)(25 ℃)

2.2 鹽地堿蓬潛在促生菌的體外試驗(yàn)篩選

為篩選鹽地堿蓬促生菌，首先用體外平板法檢測(cè)分離獲得的6株鹽地堿蓬葉片內(nèi)生細(xì)菌溶磷、解鉀、固氮、產(chǎn)鐵載體和產(chǎn)ACC脫氨酶能力，結(jié)果如表1所示。

表1 鹽地堿蓬葉片內(nèi)生細(xì)菌促生潛力的檢測(cè)結(jié)果

受試細(xì)菌在PKO平板和解鉀菌篩選培養(yǎng)基平板分別培養(yǎng)7 d后，均未觀察到水解圈的產(chǎn)生，顯示其不具備溶磷、解鉀能力。受試細(xì)菌在阿須貝氏平板培養(yǎng)7 d后，均未觀察到黏稠、半透明的白色或褐色菌落，說(shuō)明其不具備固氮能力。

受試細(xì)菌在CAS平板培養(yǎng)2 d后，有4株細(xì)菌在菌苔周?chē)a(chǎn)生較明顯橙黃色暈圈(圖2)，編號(hào)分別為JY21(圖2A)、JY24(圖2B)、BJY223(圖2E)和BJY323(圖2F)，表明其具備產(chǎn)鐵載體的能力；而編號(hào)為JY32(圖2C)和BJY111(圖2D)的兩株細(xì)菌未在菌苔周?chē)a(chǎn)生橙黃色暈圈，表明其不具備產(chǎn)鐵載體的能力。

A—JY21；B—JY24；C—JY32；D—BJY111；E—BJY223；F—BJY323.

受試細(xì)菌經(jīng)富集培養(yǎng)，在ADF平板培養(yǎng)24 h后，涂布JY32(圖3A)和BJY323(圖3B)細(xì)菌的ADF平板有單菌落長(zhǎng)出，表明其具有產(chǎn)ACC脫氨酶的能力；而涂布其他4株細(xì)菌的ADF平板未見(jiàn)菌落長(zhǎng)出，說(shuō)明其不具備產(chǎn)ACC脫氨酶的能力。

A—JY32；B—BJY323.

根據(jù)體外試驗(yàn)結(jié)果，鹽地堿蓬葉片內(nèi)生細(xì)菌JY21、JY24、JY32、BJY223和BJY323可能具備促生潛力，因此，選取這5株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行鹽地堿蓬幼苗定植接種試驗(yàn)以驗(yàn)證其促生性能。

2.3 定植接種試驗(yàn)篩選鹽地堿蓬潛在促生菌

取上述5株具有產(chǎn)鐵載體或產(chǎn)ACC脫氨酶能力的鹽地堿蓬內(nèi)生菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液(菌液OD600 nm=0.6～0.8)，分別定植接種水培鹽地堿蓬，定植接種14 d后測(cè)定根長(zhǎng)伸長(zhǎng)值和株高增長(zhǎng)值。從表2可見(jiàn)：水培鹽地堿蓬幼苗培養(yǎng)14 d后，與對(duì)照組相比，定植接種這5株內(nèi)生菌的鹽地堿蓬根長(zhǎng)伸長(zhǎng)平均值均有提高，其中定植接種JY32、BJY223、BJY323菌的3個(gè)試驗(yàn)組鹽地堿蓬根長(zhǎng)伸長(zhǎng)值較高，且定植接種BJY223菌的試驗(yàn)組有極顯著差異(P<0.01)；與對(duì)照組相比，定植接種這5株內(nèi)生菌的鹽地堿蓬株高增長(zhǎng)平均值均有提高，其中定植接種JY24、JY32、BJY223菌的試驗(yàn)組鹽地堿蓬株高增長(zhǎng)較高，且接種JY32、BJY223菌的試驗(yàn)組有極顯著差異(P<0.01)?？傮w來(lái)看，分離自野生鹽地堿蓬葉片的內(nèi)生菌BJY223促進(jìn)水培鹽地堿蓬地下部分和地上部分的生長(zhǎng)效果最好，是鹽地堿蓬潛在促生菌。

表2 鹽地堿蓬幼苗根長(zhǎng)伸長(zhǎng)值和株高增長(zhǎng)值

2.4 鹽地堿蓬潛在促生菌的形態(tài)觀察和分子鑒定

對(duì)BJY223菌進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察其細(xì)胞呈紅色、短桿狀或曲桿狀，據(jù)此推斷其為革蘭氏陰性桿菌(圖4)。

圖4 鹽地堿蓬潛在促生菌BJY223的革蘭氏染色圖

假交替單胞菌屬細(xì)菌在1995年作為單獨(dú)的一個(gè)屬?gòu)慕惶鎲伟鷮賱澐殖鰜?lái)，為革蘭氏陰性桿菌[24]。選擇12株P(guān)seudoalteromonas屬不同種細(xì)菌與BJY223菌基于16S rRNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖5)，其中包括與BJY223菌高度同源的P.lipolytica和P.donghaensis，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示的親緣遠(yuǎn)近，在已鑒定到種的假交替單胞菌屬細(xì)菌中，BJY223菌與P.lipolytica親緣關(guān)系最為接近，其次是P.donghaensis、P.shioyasakiensis等。

圖5 基于16S rRNA基因序列的假交替單胞菌屬細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

結(jié)合BJY223菌的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果與16S rRNA基因序列的親緣發(fā)育分析結(jié)果，推斷BJY223為假交替單胞菌屬細(xì)菌，且在已鑒定到種的該屬細(xì)菌中，與P.lipolytica親緣關(guān)系最為接近，同源性最高(一致性99.85%)

3 討論

3.1 堿蓬屬植物可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性

目前，有關(guān)堿蓬屬植物內(nèi)生菌的研究尚不多見(jiàn)。崔春曉等[25]從山東東營(yíng)濱海鹽地堿蓬秋季植株中分離獲得15株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，基于16S rRNA基因序列的BLASTn結(jié)果顯示，其與Halomonas屬(5株)、Chromohalobacter屬(4株)、Harerehalobacter屬(3株)、Kushneria屬(2株)和Bacillus屬(1株)細(xì)菌最為相似。其中，1株與Chromohalobacter屬細(xì)菌相似的內(nèi)生細(xì)菌被Xia等[23]于2016年正式鑒定為L(zhǎng)arsenimonassuaedae。田銳等[26]系統(tǒng)研究了遼寧盤(pán)錦三角洲翅堿蓬Suaedaheteroptera根系可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性，分離獲得可培養(yǎng)根系內(nèi)生菌12株，基于16S rRNA基因序列的BLASTn結(jié)果推測(cè)，其分別與Zhihengliuella屬(3株)、Pseudomonas屬(2株)、Kusherneria屬(2株)、Planococlus屬(1株)、Salinicola屬(1株)、Microbulbifer屬(1株)、Arthrobacter屬(1株)和Paracoccus屬(1株)細(xì)菌最為相似。

本研究從夏季遼河口濕地野生鹽地堿蓬葉片內(nèi)共分離獲得6株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，其分別與Pseudoalteromonas屬細(xì)菌(2株)、L.suaedae或Chromohalobacter屬細(xì)菌(1株)、Chromohalobacter屬細(xì)菌(1株)、Kushneria屬細(xì)菌(1株)和Enterobacter屬細(xì)菌(1株)最為相似，還有1株為不可培養(yǎng)細(xì)菌。本研究與前人的研究既有一致性又有獨(dú)特性，與山東東營(yíng)鹽地堿蓬植株內(nèi)生細(xì)菌類(lèi)似，本研究從遼河口鹽地堿蓬葉片內(nèi)部也分離出與L.suaedae、Chromohalobacter屬和Kusherneria屬細(xì)菌同源性最高的細(xì)菌。值得注意的是，與Kusherneria屬細(xì)菌高度同源的細(xì)菌，既能從鹽地堿蓬植株內(nèi)部分離獲得，又能從翅堿蓬植株內(nèi)部分離獲得，提示其可能是廣布于堿蓬屬植物體內(nèi)的內(nèi)生細(xì)菌。本研究中也分離獲得了與其他屬細(xì)菌高度同源的可培養(yǎng)鹽地堿蓬葉片內(nèi)生菌。

3.2 植物內(nèi)生細(xì)菌的促生長(zhǎng)作用

植物組織內(nèi)部存在一類(lèi)有益于植物生長(zhǎng)且抗逆的內(nèi)生細(xì)菌，可用于植物的生防保育。在農(nóng)業(yè)上，植物促生菌因其可開(kāi)發(fā)成綠色安全的生物肥料，部分或者全部替代傳統(tǒng)的化學(xué)制劑，近年來(lái)備受關(guān)注[27-28]。一方面，植物促生菌通過(guò)溶磷、解鉀、固氮、產(chǎn)鐵載體等能力促進(jìn)植物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高植物在不利環(huán)境中對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，使植物獲得更高的存活率；另一方面，植物促生菌可以通過(guò)生產(chǎn)生長(zhǎng)素及ACC脫氨酶促進(jìn)植物生長(zhǎng)，在激素及酶類(lèi)代謝方面賦予逆境中的植物更強(qiáng)的抗逆能力。Alishahi 等[29]從堿蓬屬植物根部分離了多株耐鹽且能夠固氮的內(nèi)生細(xì)菌，但針對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的植物促生功能僅做了體外平板試驗(yàn)。

本研究中，對(duì)從鹽地堿蓬植株中分離出的內(nèi)生菌進(jìn)行了溶磷、解鉀、固氮、產(chǎn)鐵載體及產(chǎn)ACC脫氨酶能力檢測(cè)試驗(yàn)，試驗(yàn)雖在可培養(yǎng)鹽地堿蓬內(nèi)生菌中未檢測(cè)出溶磷、解鉀、固氮功能，但檢測(cè)出有幾株內(nèi)生菌具有產(chǎn)鐵載體和產(chǎn)ACC脫氨酶能力，其中，具有產(chǎn)鐵載體能力的BJY223在定植接種水培鹽地堿蓬幼苗試驗(yàn)中，可顯著促進(jìn)幼苗根長(zhǎng)伸長(zhǎng)和植株生長(zhǎng)。由此推測(cè)，本研究中分離出的潛在促生菌可能通過(guò)產(chǎn)生鐵載體來(lái)提高植株對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率，進(jìn)而促進(jìn)植株生長(zhǎng)。這也是首次報(bào)道了可培養(yǎng)鹽地堿蓬葉片內(nèi)生菌在水培鹽地堿蓬體內(nèi)試驗(yàn)中有促生作用。

3.3 假交替單胞菌屬細(xì)菌的來(lái)源和用途

假交替單胞菌屬細(xì)菌是海洋細(xì)菌，多與真核寄主(包括海洋動(dòng)物和海洋植物)共生，能產(chǎn)生一系列活性代謝產(chǎn)物，發(fā)揮抗菌、溶菌、水解瓊脂和除藻等作用，可開(kāi)發(fā)成生防制劑[30]。其部分成員能形成生物膜并釋放胞外拮抗劑，有效抑制因無(wú)脊椎動(dòng)物幼蟲(chóng)附著引發(fā)的生物污損(biofouling)[31]。如P.lipolytica菌可在海洋中的不銹鋼材料上形成抗污損生物膜[25]，其分泌的胞外黑膿素(pyomelanin)對(duì)厚殼貽貝Mytiluscoruscus的幼蟲(chóng)附著及變態(tài)發(fā)生有抑制作用[32]。一株分離自韓國(guó)附近東海海域的P.donghaensis菌能在低溫和堿性條件下生產(chǎn)胞外蛋白酶[33]。一株分離自太平洋沉積物中的P.shioyasakiensis菌能產(chǎn)生胞外多糖[34]。已報(bào)道有植物促生功能的假交替單胞菌屬細(xì)菌包括從奧迪爾(Odiel)鹽沼節(jié)黎屬植物Arthrocnemummacrostachyum根際分離的P.rhizosphaera[35]和從海帶Laminariajaponica中分離的P.porphyrae菌，后者能夠促進(jìn)農(nóng)作物種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)[36]。

本研究中，從遼河口野生鹽地堿蓬葉片內(nèi)分離出一株假交替單胞菌屬細(xì)菌BJY223，其在實(shí)驗(yàn)室條件下具有產(chǎn)鐵載體能力，且能顯著促進(jìn)水培鹽地堿蓬幼苗的根部伸長(zhǎng)和植株生長(zhǎng)，可望用于鹽地堿蓬植被修復(fù)。

4 結(jié)論

1)從夏季遼河口濕地野生鹽地堿蓬葉片內(nèi)分離獲得6株可培養(yǎng)細(xì)菌并對(duì)其進(jìn)行分子鑒定，篩選出4株具備產(chǎn)鐵載體潛能的細(xì)菌。

2)通過(guò)水培鹽地堿蓬幼苗定植接種試驗(yàn)，從4株具備產(chǎn)鐵載體潛能的細(xì)菌中篩選出1株能顯著促進(jìn)幼苗根部伸長(zhǎng)和莖部增長(zhǎng)的內(nèi)生菌BJY223，該菌可能是鹽地堿蓬促生菌。基于形態(tài)學(xué)觀察和16S rRNA基因全長(zhǎng)序列分析，鑒定該株鹽地堿蓬促生菌為假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas細(xì)菌，該菌可為遼河口鹽地堿蓬植被恢復(fù)提供菌種資源。