國晶晶，劉詩萌，韓梓琪，宋悅凡,2，劉舒,2，周慧,2，汪秋寬,2*

(1.大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023; 2.國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心(大連)，遼寧 大連 116023)

褐藻聚糖硫酸酯(fucoidan)是一種連接硫酸基團(tuán)的雜環(huán)活性多糖，主要從褐藻細(xì)胞和棘皮動物體壁提取，因其結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，不同種間、不同收獲季節(jié)和不同提取方法得到的褐藻聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)各不相同。褐藻聚糖硫酸酯的主要組成成分是巖藻糖和硫酸基團(tuán)，另外還含有一定量的葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和甘露糖醛酸等，有些還含有少量的蛋白質(zhì)和乙酰基[1-2]。褐藻聚糖硫酸酯具有抗氧化、降血壓、降血脂和抗血栓[3-6]等多種生物活性，但因分子量較大限制了其應(yīng)用范圍。而低分子量的褐藻聚糖硫酸酯易被人體吸收，特別是對體弱人群能更好地發(fā)揮其活性,且褐藻聚糖硫酸酯具有安全性高、無毒等優(yōu)勢，因此，將其高分子物質(zhì)降解為低分子量低聚糖后，在食品、醫(yī)藥等方面具有巨大的應(yīng)用潛力。

目前，低分子量褐藻聚糖硫酸酯的制備方法主要有酶解法、酸解法和高壓降解法，其中，酶解法具有反應(yīng)溫和、專一性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)其作用方式，褐藻聚糖硫酸酯降解酶大致分為3類：①α-L-巖藻糖苷酶(α-L-fucosidases)(EC3.2.1.51)，為外切酶，其作用方式主要是切斷多糖非還原末端α-L-糖苷鍵，可用于測定糖基的連接順序；②另兩類統(tǒng)稱為褐藻聚糖硫酸酯酶(fucoidananse,FUCase)(EC3.2.1.51)，為內(nèi)切酶，其中一種是在多糖鏈中間某處將糖鏈切割，可用于制備寡糖或低分子量的降解產(chǎn)物,另一種是在末端不斷地釋放寡糖鏈，可用于降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析[7]。因使用范圍不同，可根據(jù)不同需求選取不同種類的酶，但目前仍無商品化的褐藻聚糖硫酸酯降解酶，且對酶的作用機(jī)制和方式也缺乏深入的了解。因此，亟待篩選新型產(chǎn)褐藻聚糖硫酸酯降解酶的菌株，為高效、安全地降解褐藻聚糖硫酸酯提供新酶源。

本研究中,選取大連旅順柏嵐子沿海海水和泥沙，以褐藻聚糖硫酸酯作為唯一碳源，經(jīng)過富集與純化篩選獲得一株產(chǎn)褐藻聚糖硫酸酯降解酶菌株，通過分析其16S rRNA基因序列對該菌株進(jìn)行鑒定，優(yōu)化其產(chǎn)酶條件,并對粗酶及降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，以期為褐藻聚糖硫酸酯降解酶的分離純化和作用方式研究提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用海水、泥沙采集于大連旅順柏嵐子沿海周邊。

大連籠目海帶Kjellmanniellacrassifolia褐藻聚糖硫酸酯(FUC)由國家海藻加工技術(shù)研究分中心(大連)提供；PCR擴(kuò)增試劑盒由生工生物工程(上海)股份有限公司提供,擴(kuò)增16S rDNA基因引物由該公司合成；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀為德國Eppendorf公司生產(chǎn)；高效液相色譜儀為安捷倫1260。巖藻糖、半乳糖等單糖標(biāo)準(zhǔn)品由Sigma公司提供，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選

富集培養(yǎng)基的制備：將FUC 2 g、NaNO33 g、NaCl 20 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCl20.1 g和FeSO4·7H2O 0.01 g溶于1 000 mL蒸餾水中，于115 ℃加熱滅菌30 min后待用。

選擇性培養(yǎng)基的制備：在富集培養(yǎng)基里添加20 g瓊脂，于115 ℃加熱滅菌30 min后待用。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：將FUC 2 g、蛋白胨3 g、NaCl 20 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCl20.1 g和FeSO4·7H2O 0.01 g溶于1 000 mL蒸餾水中，于115 ℃加熱滅菌30 min后待用。

初篩菌株的分離：稱取海水和泥沙樣品2 g，放入盛有15 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，在25 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)液按照梯度稀釋，取0.1 mL涂布于選擇性培養(yǎng)基平板，倒置在25 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。將平板中不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行3次平板劃線純化，得到初篩菌株。

菌株酶液的制備：將分離的初篩菌株接種于盛有50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，在25 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)3 d，取發(fā)酵液在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min，上清液即為菌株酶液。

1.2.2 分離菌株酶活力的測定 取菌株酶液樣品0.25 mL與等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的FUC混合,在30 ℃、150 r/min的水浴恒溫振蕩器中反應(yīng)2 h后，沸水浴滅酶10 min。待溶液冷卻后加入0.5 mL鐵氰化鉀搖勻，在80 ℃水浴中反應(yīng)15 min，冷卻至室溫后加入2 mL蒸餾水震蕩混勻，取1 mL溶液在4 ℃以下10 000 r/min離心10 min，取0.2 mL上清液在420 nm處測定吸光值。對照組是將菌株酶液樣品在沸水浴中滅酶15 min后與FUC混合，其他步驟同上，每組設(shè)置3個平行。

1.2.3 總糖含量測定 采用苯酚硫酸法測定總糖含量[8]。以L-巖藻糖、D-半乳糖(質(zhì)量比為3∶1)為標(biāo)準(zhǔn)糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照標(biāo)準(zhǔn)方法在490 nm處測定吸光度并計(jì)算總糖含量。

1.2.4 褐藻聚糖硫酸酯硫酸根含量測定 采用明膠-氯化鋇法測定硫酸根含量[9]。配制K2SO4標(biāo)準(zhǔn)工作液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照標(biāo)準(zhǔn)方法在470 nm處測定吸光度，并計(jì)算硫酸根含量。

1.2.5 菌體生物量測定 菌體經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后，以未接菌的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵液作為空白對照，采用比濁法測定吸光度值(OD600 nm)。

1.2.6 菌種鑒定 取目標(biāo)菌株的一個單菌落，接入裝有0.1 mL無菌超純水的1.5 mL離心管中振蕩混勻，在100 ℃沸水浴中加熱10 min；冷卻至室溫后,以6 000 r/min離心10 min，所得上清液即為DNA模板。

利用16S rRNA通用引物27F(5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′)、1492R(5′GGTTACCTTGTTACGACTT 3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增片段進(jìn)行測序。將測序結(jié)果的基因序列輸入NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析，選取同源性較高的16S rRNA序列，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，以鑒定菌種。

1.2.7 菌株產(chǎn)酶優(yōu)化

1)初始培養(yǎng)條件。挑取斜面培養(yǎng)的單個菌株接入裝有15 mL富集培養(yǎng)基的錐形瓶中，在25 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)后的菌液按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接入裝有50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，在25 ℃、150 r/min搖床中進(jìn)行擴(kuò)大產(chǎn)酶培養(yǎng)，取發(fā)酵液測定酶活力和生物量。

2)菌株培養(yǎng)基成分單因素優(yōu)化試驗(yàn)。在培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的FUC(0、1、2、4、8、12 g/L)，其余成分同液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以優(yōu)化碳源質(zhì)量濃度；在培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為3 g/L的不同種類源物質(zhì)(硫酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、酵母粉和無氮源的對照)，其余成分同液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以優(yōu)化氮源種類；向培養(yǎng)液中加入不同質(zhì)量濃度的酵母粉(1、3、6、9、12、14 g/L)，其余成分同液體培養(yǎng)基，以優(yōu)化酵母粉培養(yǎng)液質(zhì)量濃度；向培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的NaCl(0、20、30、40、50 g/L)，其余成分同液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以優(yōu)化NaCl質(zhì)量濃度。

3)菌株發(fā)酵培養(yǎng)單因素優(yōu)化試驗(yàn)。以優(yōu)化的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將初始培養(yǎng)條件設(shè)定為溫度30 ℃、pH 8、接種量5%和裝液量100 mL，以菌株繁殖生物量和產(chǎn)酶酶活力為指標(biāo)，通過改變單個因素進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)，即培養(yǎng)基初始pH為5、6、7、8、9時(shí)對菌株產(chǎn)酶發(fā)酵的影響；培養(yǎng)溫度為20、25、30、35、40 ℃時(shí)對菌株產(chǎn)酶發(fā)酵的影響；接種量為2%、5%、10%、15%時(shí)對菌株產(chǎn)酶發(fā)酵的影響；裝液量為25、50、75、100 mL時(shí)對菌株產(chǎn)酶發(fā)酵的影響。

菌株培養(yǎng)基成分和發(fā)酵培養(yǎng)單因素優(yōu)化試驗(yàn)每組分別設(shè)置3個平行。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮碳源濃度、初始pH、氮源濃度、NaCl濃度、接種量、溫度和裝液量7個因素對菌株生物量和酶活力的綜合影響，進(jìn)行7因素3水平的L18(37)正交試驗(yàn)。

1.2.8 粗酶的制備及酶學(xué)性質(zhì)分析 利用丙酮沉淀法制備粗酶。取制備的發(fā)酵液在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min，所得上清液用提前預(yù)冷的丙酮(4 ℃)按照體積比1∶2緩慢混合，在4 ℃層析柜靜置沉淀1 h后離心10 min，所得沉淀用緩沖溶液復(fù)溶，再次離心所得上清液即為粗酶液。然后分析粗酶的最適反應(yīng)溫度、pH及其穩(wěn)定性，以及不同金屬離子對酶活力的影響。

1.2.9 酶降解寡糖的制備及其組成分析 按照10 U/mg的酶添加量將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的FUC與粗酶混合，在最適反應(yīng)溫度、pH條件下酶解反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴加熱15 min終止酶解反應(yīng)，室溫冷卻后以10 000 r/min離心10 min，所得上清液即為酶解產(chǎn)物，冷凍干燥保存。

分別稱取0.005 g相對分子質(zhì)量分別為1 000、5 000、10 000的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，溶于2 mL蒸餾水中，通過Sephacryl S-100凝膠柱洗脫，采用苯酚硫酸法測定各組分的總糖含量，以標(biāo)準(zhǔn)品分子量的對數(shù)值(lgM)為縱坐標(biāo)、對應(yīng)的保留體積(Kav)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將酶解產(chǎn)物通過Sephacryl S-100凝膠柱(1.6 cm×100 cm)進(jìn)行分離純化，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合公式估算其分子量，用高效液相色譜法測定酶解產(chǎn)物的單糖組成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 25軟件單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐藻聚糖硫酸酯成分含量

首先對試驗(yàn)用籠目海帶褐藻聚糖硫酸酯的組成成分進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，其總糖含量為71.68%±2.06%，硫酸根含量為20.04%±0.18%，純度為91.72%，純度較高，說明其中褐藻膠的干擾物質(zhì)較少，由此確定，該褐藻聚糖硫酸酯可以作為菌株培養(yǎng)發(fā)酵的唯一碳源進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 菌株篩選及鑒定

經(jīng)過富集、分離及純化，共篩選出30株以褐藻聚糖硫酸酯為唯一碳源生長的菌株。將篩選獲得的菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)、復(fù)篩，并對多糖利用率和產(chǎn)酶能力進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，F(xiàn)uc19菌株的發(fā)酵液酶活力最高，粗酶酶活力為95.23 U/mL，該菌株經(jīng)過10次傳代穩(wěn)定性培養(yǎng)后，產(chǎn)酶能力仍較穩(wěn)定，可作為后續(xù)研究菌株。

PCR擴(kuò)增及測序結(jié)果顯示，菌株Fuc19的基因序列長度為1 425 bp，經(jīng)BLAST比對，與該菌株一致性高于99%的菌屬為大洋中華微藻Sinomicrobiumoceani。利用Mega軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，該菌株與Sinomicrobiumoceani聚為一個分支，親緣關(guān)系最近，故將其鑒定為Sinomicrobiumsp.，命名為Sinomicrobiumsp.Fuc19(簡記為Fuc19)(圖1)。

圖1 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株Fuc19系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 Sinomicrobium sp.Fuc19菌株的產(chǎn)酶優(yōu)化

2.3.1 Fuc19菌株培養(yǎng)基成分的優(yōu)化 從圖2(a)可見，隨著FUC濃度的增加，F(xiàn)uc19菌株的生長和產(chǎn)酶能力均呈先升后降的趨勢，當(dāng)FUC質(zhì)量濃度達(dá)到2 g/L時(shí)，其酶活力和生物量均達(dá)到最大值，隨后酶活力和生物量迅速降低，說明FUC的最佳質(zhì)量濃度為2 g/L。當(dāng)褐藻聚糖硫酸酯的質(zhì)量濃度高于2 g/L時(shí)會影響菌株的生長，這可能是由于FUC濃度增加，其酶溶液的黏度也隨之增加，酶與底物間的反應(yīng)受到影響。

從圖2(b)可見,在無氮源、硝酸鈉、硫酸銨環(huán)境下Fuc19菌株的生物量和酶活力均較低，而在有機(jī)氮源蛋白胨和酵母粉中繁殖較快，其中添加酵母粉的菌株生物量和產(chǎn)酶能力最高。

從圖2(c)可見，隨著酵母粉濃度的增加，F(xiàn)uc19菌株的生物量和產(chǎn)酶能力也逐漸增加，當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度為12 g/L時(shí)，生物量和酶活力達(dá)到最大值，說明酵母粉的添加可促進(jìn)菌株生長繁殖。

從圖2(d)可見，隨著NaCl濃度的增加，菌株生物量和酶活力呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，生物量和酶活力均為最大值。這是因?yàn)樵摼陙碓从诤Ｑ蟓h(huán)境，具有一定的耐鹽性，故在培養(yǎng)基中添加NaCl菌株均可生長，但NaCl濃度過高時(shí)會影響菌株的產(chǎn)酶能力。

圖2 培養(yǎng)基成分對Sinomicrobium sp.Fuc19生物量和產(chǎn)酶的影響

2.3.2 Fuc19菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化 在Fuc19培養(yǎng)基成分優(yōu)選的基礎(chǔ)上，對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。從圖3(a)可見，不同初始pH對該菌株生長和產(chǎn)酶能力影響較小，在pH為5～9時(shí)，F(xiàn)uc19菌株的相對酶活力均在80%以上，其中pH為7時(shí)相對酶活力最高，對應(yīng)的生物量也較高，因此，后續(xù)選擇7作為最佳初始pH。從圖3(b)可見，隨著溫度的升高，F(xiàn)uc19菌株的生長和產(chǎn)酶能力隨之降低，因此，后續(xù)選擇20 ℃作為最佳培養(yǎng)溫度。從圖3(c)可見，隨著裝液量的增加，F(xiàn)uc19菌株的相對酶活力呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)裝液量為75 mL時(shí)相對酶活力最高，因此，后續(xù)選擇75 mL作為最佳裝液量。從圖3(d)可見,隨著接種量的增加，F(xiàn)uc19菌株的生物量和相對酶活力均呈下降趨勢，當(dāng)接種量為2%時(shí)生物量和酶活力均為最大，這可能是因?yàn)檫^高的初始接種量需要培養(yǎng)基提供更多的營養(yǎng)成分，因此，后續(xù)選擇2%作為最佳接種量。

圖3 發(fā)酵液成分對Sinomicrobium sp.Fuc19生物量和酶活力的影響

2.4 產(chǎn)酶優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)Fuc19培養(yǎng)的單因素試驗(yàn)結(jié)果，本研究中以酶活力和生物量為指標(biāo)，設(shè)計(jì)7因素3水平的L18(37)正交試驗(yàn)(表1)，進(jìn)一步優(yōu)化Fuc19菌株的培養(yǎng)條件，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表1 產(chǎn)酶優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

極差分析結(jié)果表明：影響Fuc19菌株產(chǎn)酶活力高低的因素依次為NaCl濃度>酵母粉濃度>pH>FUC濃度>接種量>裝液量>溫度，理論最優(yōu)化組合為A2B2C2D3E1F1G2，而酶活力正交試驗(yàn)表中，第5組試驗(yàn)結(jié)果最優(yōu)；影響Fuc19菌株生物量高低的因素依次為酵母粉濃度>NaCl濃度>接種量>溫度>FUC濃度>裝液量>pH，理論最優(yōu)組合為A2B1C3D2E2F2G3，生物量正交試驗(yàn)表中，第14組試驗(yàn)結(jié)果最優(yōu)。將這4組進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)(表3)，結(jié)果表明，理論最優(yōu)組合A2B2C2D3E1F1G2的Fuc19酶活力最高，為143.60 U/mL，OD600 nm值為1.666，相比優(yōu)化前(95.23 U/mL)提高了50.8%。因此，確定Fuc19菌株最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分為FUC質(zhì)量濃度2 g/L、酵母粉質(zhì)量濃度12 g/L、NaCl質(zhì)量濃度20 g/L和初始pH 6，最佳培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、裝液量100 mL和接種量1%。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)

2.5 粗酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.5.1 酶最適反應(yīng)溫度及其穩(wěn)定性 從表4可見：在20～30 ℃時(shí)酶活力變化不大，當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)酶活力達(dá)到最大，之后隨著溫度的升高，酶活力降低至原來水平；分別在上述各溫度中保溫4 h后測定酶活力，隨著溫度的升高，酶活力整體呈下降趨勢，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，其酶活力只有原酶活力的57.53%，說明該粗酶熱穩(wěn)定性較差。

表4 酶最適反應(yīng)溫度及其穩(wěn)定性

2.5.2 酶最適pH及穩(wěn)定性 從表5可見：當(dāng)pH為8時(shí)，其酶活力達(dá)到最大，這可能與Fuc19來源于海洋環(huán)境(pH 7.8～8.0)弱堿性有關(guān)，菌株發(fā)酵后發(fā)酵液的pH為8；將粗酶液按照不同的pH進(jìn)行復(fù)溶，在4 ℃條件下保溫4 h后測定酶活力，菌株在pH為7時(shí)酶活力最高，在pH分別為6、8時(shí)，相對酶活力仍保持在60%左右，說明穩(wěn)定性良好。

表5 酶最適反應(yīng)pH及其穩(wěn)定性

標(biāo)有不同字母者表示同一濃度下不同離子組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。

2.6 酶解產(chǎn)物的化學(xué)組成

將未酶解FUC樣品和酶解后的產(chǎn)物經(jīng)Sephacryl S-100洗脫分離。從圖5可見，酶解液在洗脫體積136.5 mL后仍有洗脫峰，由此推斷，此部分小分子物質(zhì)是酶降解后的產(chǎn)物，說明Fuc19菌株所產(chǎn)的酶可將FUC大分子物質(zhì)降解為小分子物質(zhì)。分別收集F1(相對分子質(zhì)量為10 000以上)、F2(相對分子質(zhì)量為5 000～10 000)和F3(相對分子質(zhì)量為1 000～5 000)3個組分。分析3個組分F1、F2、F3的總糖含量和單糖組成，結(jié)果如表6所示，組分F3的總糖含量較低，分析原因可能是在酶解物中存在有金屬離子等雜質(zhì)的干擾；FUC中葡萄糖和木糖的含量均在20%以上，經(jīng)酶解后，各組分中的葡萄糖和木糖含量降低，巖藻糖和半乳糖含量增加，說明酶解產(chǎn)物主要由巖藻糖和半乳糖組成，其他單糖含量較低。

圖5 酶解產(chǎn)物洗脫曲線

表6 酶解產(chǎn)物化學(xué)組成分析

3 討論

3.1 產(chǎn)褐藻聚糖硫酸酯降解酶菌株的鑒定及產(chǎn)酶優(yōu)化條件分析

褐藻聚糖硫酸酯酶的制備途徑主要有兩種，一方面來源于食用褐藻的海洋生物的肝胰腺,另一方面來源于海洋產(chǎn)酶微生物[10-13]。本研究中，從大連旅順沿海海域的海水和泥沙中篩選出一株全新的菌株，經(jīng)16S rDNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，該菌株與大洋中華微菌屬的相似度極高，其中，與之相似度最高的是SinomicrobiumoceaniALGLP8，一致性在99%以上，由此，鑒定該菌株屬于大洋中華微菌屬Sinomicrobium。該菌株在NaCl質(zhì)量濃度為20 g/L、初始pH為6、培養(yǎng)溫度為25 ℃、裝液量為100 mL和接種量為1%條件下生長繁殖最佳。Xu等[14]從南海南沙群島海洋沉積物樣品中分離出能降解褐藻聚糖硫酸酯的海洋細(xì)菌，命名為SinomicrobiumoceaniSCSIO 03483T菌株，經(jīng)鑒定屬黃桿菌科Flavobacteriaceae，在溫度為28～37.6 ℃、pH為7.0和NaCl為40 g/L條件下菌株生長最佳，本研究中發(fā)現(xiàn)的Sinomicrobiumsp.Fuc19的培養(yǎng)溫度明顯低于該菌株培養(yǎng)溫度。Liu等[15]從北極土壤里發(fā)現(xiàn)的SinomibiumsoliN-1-3-6T菌株，與本研究中的Sinomicrobiumsp.Fuc19同屬中華微菌屬，對褐藻聚糖硫酸酯均具有降解作用。

單瑞芬[16]從浙江蒼南海域采集的樣品中篩選出一株能降解褐藻聚糖硫酸酯的菌株P(guān)seudidiomarinahomiensisZJCN121，該菌株的產(chǎn)酶優(yōu)化發(fā)酵條件為初始溫度20 ℃、pH 6.5、接種量2%和裝液量100 mL，優(yōu)化后產(chǎn)酶酶活力僅為1.19 U/mL，雖其發(fā)酵條件與本研究中的Sinomicrobiumsp.Fuc19類似，但Sinomicrobiumsp.Fuc19的酶活力具有明顯優(yōu)勢；同樣，王瑩等[17]從青島麥島海域海水中篩選出一株能降解褐藻聚糖硫酸酯的菌株MD3，優(yōu)化發(fā)酵條件為初始溫度25 ℃、pH 8、裝液量50 mL，優(yōu)化后產(chǎn)酶能力由2.1 U/mL升至4.0 U/mL，同樣與本研究中的Sinomicrobiumsp.Fuc19產(chǎn)酶酶活力相差較大。由此可見，產(chǎn)酶菌Sinomicrobiumsp.Fuc19的發(fā)現(xiàn)極具研究開發(fā)潛力，本研究中Sinomicrobiumsp.Fuc19發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化后產(chǎn)酶酶活力高達(dá)143.60 U/mL，相比優(yōu)化前提高了50.8%，這為褐藻聚糖硫酸酯酶解制備低分子聚糖提供了較佳條件。

3.2 褐藻聚糖硫酸酯降解酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

3.3 酶解褐藻聚糖硫酸酯低分子聚糖的單糖組成分析

有關(guān)褐藻聚糖硫酸酯的單糖組成分析報(bào)道較多，不同褐藻種類、不同制備方法得到的低分子聚糖組分和含量均有差異。寡糖的單糖組成分析報(bào)道主要集中在化學(xué)法和物理法制備的組分,至今未見酶解法制備褐藻聚糖硫酸酯低分子聚糖的單糖組成分析報(bào)道。本研究中，通過Sephacryl S-100將Fuc19粗酶酶解的籠目海帶褐藻聚糖硫酸酯低分子聚糖分離純化，單糖組成分析表明，低分子聚糖組分以巖藻糖和半乳糖為主。鐘思燕等[22]利用酸降解法將羊棲菜褐藻聚糖硫酸酯降解成不同分子量的寡糖，單糖組成分析表明，MMWF1以巖藻糖、半乳糖和葡萄糖為主，LMWF2組分以巖藻糖和半乳糖為主，由此可見，2個組分均以巖藻糖和半乳糖為主。趙雪[23]通過酸水解法、超濾得到低分子量海帶褐藻聚糖硫酸酯低硫組分F-A和高硫組分F-B，單糖組成分析表明，低硫組分主要由巖藻糖和半乳糖組成，高硫組分的巖藻糖含量略高于低硫組分，但半乳糖含量升高，說明酸解過程中有部分寡糖的單糖結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。李芳等[24]采用自由基氧化結(jié)合超濾技術(shù)制備低分子量海帶褐藻聚糖硫酸酯，并對其單糖組成進(jìn)行分析，得到兩個組分Fa3(相對分子質(zhì)量為7 680)和Fb3(相對分子質(zhì)量為3 890)，其中，F(xiàn)a3主要由巖藻糖和半乳糖組成，含量分別為64.25%和30.74%，F(xiàn)b3與Fa3相比巖藻糖含量下降，半乳糖含量升高，研究同樣表明，自由基氧化法制備寡糖會導(dǎo)致單糖結(jié)構(gòu)變化。Liu等[25]分析了籠目海帶褐藻聚糖硫酸酯粗糖(未降解)的4個純化組分KF1～KF4，其中，KF1、KF3和KF4的單糖主要組成成分是巖藻糖，且KF4中巖藻糖含量高達(dá)91.44%，KF2的主要單糖組成成分為巖藻糖和甘露糖。顯然，由Sinomicrobiumsp.Fuc19產(chǎn)酶酶解制備的低分子聚糖還是以巖藻糖和半乳糖為主，糖組成成分變化不大，且與上述化學(xué)法、物理法相比，酶解法制備低分子寡糖反應(yīng)條件溫和，未有或較少破壞單糖組成結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

1)以褐藻聚糖硫酸酯為唯一碳源，在大連旅順沿海海水和泥沙中篩選獲得一株產(chǎn)褐藻聚糖硫酸酯降解酶菌株Sinomicrobiumsp.Fuc19，拓寬了褐藻聚糖硫酸酯降解酶的種類，具有應(yīng)用推廣潛力。

2)通過正交試驗(yàn)優(yōu)化確定產(chǎn)酶菌株最佳培養(yǎng)基成分為FUC質(zhì)量濃度2 g/L、酵母粉質(zhì)量濃度12 g/L、NaCl質(zhì)量濃度20 g/L、初始pH 6，最佳培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、裝液量100 mL和接種量1%，優(yōu)化后產(chǎn)酶能力較優(yōu)化前提高了50.8%。Sinomicrobiumsp.Fuc19在35 ℃、pH 8最適酶反應(yīng)條件下，降解褐藻聚糖硫酸酯的能力最強(qiáng)。

3)對粗酶酶解的褐藻聚糖硫酸酯酶解產(chǎn)物分離純化，得到一定量的低分子聚糖，說明Sinomicrobiumsp.Fuc19所產(chǎn)的酶具有較強(qiáng)的降解能力，可將褐藻聚糖硫酸酯大分子物質(zhì)降解為小分子物質(zhì)，這為制備低分子量低分子聚糖提供了一種新酶源。