何 瀠 王 瑩 計(jì)仁華 汪翼凡

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）引起急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是機(jī)體經(jīng)受嚴(yán)重的感染、創(chuàng)傷、休克后引起的以肺部通透性增加、呼吸窘迫為主要表現(xiàn)的臨床危重癥，致死率高達(dá)30%[1]。當(dāng)前肆虐全球的新型冠狀病毒肺炎，其重癥患者也常發(fā)展為ARDS[2]。尋找新的藥物和治療靶點(diǎn)，對早期預(yù)防和治療ALI 顯得極為迫切。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院自主研制的宣肺止咳合劑是治療上呼吸道感染、急性肺炎等的臨床常用方。課題組前期藥理實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，宣肺止咳合劑能抑制內(nèi)毒素（LPS）導(dǎo)致的急性肺損傷小鼠的肺組織水腫，降低血清中一氧化氮（NO）水平以及減輕肺泡間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，但作用機(jī)制尚不明確[3]。

LPS 是ALI 首要的致病因子，炎癥反應(yīng)的失衡是其主要的發(fā)病機(jī)制，肺水腫是內(nèi)毒素性ALI 并發(fā)急性呼吸功能衰竭的主要病理基礎(chǔ)[4-5]。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一組與水通透性有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在維持肺臟水液代謝平衡和肺泡水腫液的清除中發(fā)揮著重要的作用[6]。其中，AQP1 與肺損傷關(guān)系最為密切，可能是防治ALI 的重要靶點(diǎn)[7]。本實(shí)驗(yàn)探討宣肺止咳合劑是否通過調(diào)控AQP1 蛋白表達(dá)及炎癥反應(yīng)的平衡，從而對LPS 誘導(dǎo)的大鼠ALI 起治療作用，為宣肺止咳合劑的藥理機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF 級雄性Wistar 大鼠60只，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2013-0016。飼養(yǎng)條件：恒溫，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，14h 光照和10h黑暗的環(huán)境明暗交替，換風(fēng)次數(shù)15～20 次/h。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室許可證號SYXK（浙）2013-0184。

1.2 試劑 宣肺止咳合劑（院內(nèi)制劑，批號180102）；LPS（Sigma 公司，批號039M4004V）；蘇木素染液（servicebio，批號G1004）；伊紅染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號613101）；地塞米松（DEX）（源葉生物，批號H07N9Z74419）；AQP1（affinity 公司，批號AF5231）；β-actin（華安生物，批號EM21002）；BCA蛋白定量試劑盒（Solarbio，批號pc0020）；化學(xué)發(fā)光檢測試劑（Solarbio，批號PE0010）；Trizol（生工，批號B511311）；SYBR Green qPCR 試劑盒（康為世紀(jì)，批號CW2601）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（康為世紀(jì)，批號CW2569）；RIPA 裂解液（碧云天；批號P0013D）；白介素-1（IL-1）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號March-2019）；IL-4 酶聯(lián)免疫試劑盒（批號March-2019）；IL-6 酶聯(lián)免疫試劑盒（批號March-2019）；IL-10 酶聯(lián)免疫試劑盒（批號March-2019）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號March-2019）。

1.3 主要儀器 倒置熒光顯微鏡（日本尼康，型號Nikon Eclipse）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號RM2016）；酶標(biāo)儀（MD，型號CMaxPius）；電泳儀（天能，型號EPS300）；化學(xué)發(fā)光儀（勤翔，型號610020-9Q）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（羅氏，型號LightCycler 96）；核酸定量儀（Thermo Scientific，型號Nanodrop one）；生化培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司，型號LRH-150）。

1.4 動(dòng)物分組及處理 取健康SPF 級雄性Wistar大鼠60 只，隨機(jī)數(shù)字表法分為六組：正常對照組（灌胃生理鹽水，尾靜脈注射生理鹽水）；LPS 模型組（灌胃生理鹽水，尾靜脈注射LPS 5mg/kg）；宣肺止咳合劑低劑量組（灌胃7.5mg/kg 宣肺止咳合劑，尾靜脈注射LPS 5mg/kg）；宣肺止咳合劑中劑量組（灌胃15mg/kg 宣肺止咳合劑，尾靜脈注射LPS 5mg/kg）；宣肺止咳合劑高劑量組（灌胃30mg/kg 宣肺止咳合劑，尾靜脈注射LPS 5mg/kg）；陽性對照組（灌胃DEX 0.135mg/kg，尾靜脈注射LPS 5mg/kg）。其中生理鹽水劑量與給藥劑量一致。每天灌胃2 次，連續(xù)灌胃14d。末次給藥0.5h，除正常對照組外，其余各組尾靜脈注射LPS 5mg/kg，注射12h 后處死大鼠。

1.5 HE 染色觀察肺組織切片炎癥細(xì)胞浸潤和組織損傷情況 末次給藥后，取血后處死大鼠，取大鼠一葉左肺放于4%多聚甲醛中固定，取材包埋切片染色。圖像采集和分析：通過顯微鏡拍照（200 倍鏡下觀察），采集分析樣本相關(guān)部位。

1.6 免疫組化觀察LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 表達(dá) 組織切片常規(guī)脫蠟、水化、枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)，3% H2O2孵育10min 以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS 沖洗3 次。滴加封閉液（5%BSA），在濕盒中室溫30min。用濾紙擦去封閉液，滴加適宜濃度的一抗（均1∶50）置濕盒中4℃孵育過夜，用PBS 洗去一抗。滴加生物素化二抗工作液，室溫置濕盒中孵育20min，用PBS 洗去二抗。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫置濕盒中孵育20min，用PBS 洗去。DAB 顯色劑顯色，自來水充分沖洗。再進(jìn)行蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。切片在10×20 倍顯微鏡下隨機(jī)選取組織不重復(fù)6個(gè)視野。

1.7 Western blot 檢測AQP1 蛋白表達(dá) 取100mg肝臟組織樣品，剪碎，加入1mL 冷Lysis Buffer，組織勻漿機(jī)中進(jìn)行勻漿，離心取上清，用BCA 試劑盒測濃度后，進(jìn)行蛋白變性，加入Loading buffer 保存待用；吸取適量樣品上清加入樣品孔中，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳80V 分離2h，350mA、90min 濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。用5%脫脂奶粉的BSA 封閉2h，剪膜后分別加入一抗，4℃孵育過夜。TBST 洗膜后，分別加入相應(yīng)的二抗，室溫下避光孵育1h，TBST 洗膜后ECL 化學(xué)發(fā)光儀顯影。用Image Studio Ver 2.0 軟件對蛋白灰度進(jìn)行半定量分析。

1.8 qPCR 檢測AQP1 mRNA 表達(dá) 提取肺組織總RNA，按照康為世紀(jì)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：42℃，15min；85℃，5min；按照康為世紀(jì)SYBR Green qPCR 試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃，10min 變性；95℃，15s；60℃，60s；40 次循環(huán)。PCR 反應(yīng)：Real time PCR 儀使用ABI7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，PCR 程序已優(yōu)化。將已點(diǎn)好樣的8 連管板置于Realtime PCR 儀上進(jìn)行PCR 反應(yīng)。引物序列分別為：AQP1 上游引物：5′-ACCTGCTGGCCATTGACTAC3′-；AQP1 下游引物5′-CCAGGGCACTCCCAATGAAT3′-；GAPDH 上游引物：5′-AGGAGCGAGACCCCACTAACA3′-；GAPDH下游引物：5′-AGGGGGGCTAAGCAGTTGGT3′-。

1.9 ELISA 法檢測血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、IL-4 水平 大鼠心臟取血后，3500r/min 離心15min，分離血清，酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、IL-4 的含量。操作步驟按試劑盒說明，反應(yīng)終止后15min 內(nèi)，用450nm 波長測量各孔的吸光值（OD 值）。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。組間比較，方差齊性者采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊者采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色觀察宣肺止咳合劑對LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織病理學(xué)改變的影響 正常對照組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間質(zhì)無明顯滲出。LPS 模型組肺泡間質(zhì)滲出明顯，肺泡正常結(jié)構(gòu)幾乎消失，可見大量炎性細(xì)胞浸潤。在給予宣肺止咳合劑或DEX 治療后，可見低劑量組大鼠肺組織無明顯改變，說明低劑量宣肺止咳合劑治療效果不明顯。中、高劑量組及陽性對照組大鼠肺組織肺泡簡直可見炎性細(xì)胞滲出，肺泡結(jié)構(gòu)可見，損傷較模型組明顯減輕。見圖1。

圖1 宣肺止咳合劑對LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織病理學(xué)改變的影響（HE 染色，200 倍）

2.2 免疫組化觀察宣肺止咳合劑對LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 表達(dá)的影響 與正常對照組相比，LPS 模型組中AQP1 陽性表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。給予宣肺止咳合劑或DEX 治療后，與LPS 模型組相比，宣肺止咳合劑低劑量組AQP1 陽性表達(dá)無明顯改變（P＞0.05）。宣肺止咳合劑中、高劑量組及陽性對照組AQP1 陽性表達(dá)明顯升高，且具有顯著性（P＜0.01）。見表1。

表1 宣肺止咳合劑對LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 表達(dá)的影響（）

表1 宣肺止咳合劑對LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 表達(dá)的影響（）

注：正常對照組予生理鹽水；LPS 模型組予生理鹽水；宣肺止咳合劑低劑量組予7.5mg/kg 宣肺止咳合劑；宣肺止咳合劑中劑量組予15mg/kg宣肺止咳合劑；宣肺止咳合劑高劑量組予30mg/kg 宣肺止咳合劑；陽性對照組予地塞米松0.135mg/kg；除正常對照組外，其余各組給藥14d 后給予LPS 5mg/kg 尾靜脈注射；Area 為面積參數(shù)值；LPS 為內(nèi)毒素；IOD 為累積光密度參數(shù)值；與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

2.3 宣肺止咳合劑對LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組比較，LPS 模型組大鼠肺組織AQP1 蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01）。與LPS 模型組比較，給藥組大鼠肺臟組織AQP1 蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，宣肺止咳合劑不同給藥劑量呈現(xiàn)濃度依賴性，其中宣肺止咳合劑中劑量組和宣肺止咳合劑高劑量組有顯著性差異（P＜0.05 或P＜0.01），陽性對照組顯著上升趨勢（P＜0.01）。見表2 和圖3。

圖3 宣肺止咳合劑對LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織中AQP1 蛋白表達(dá)的影響

表2 宣肺止咳合劑對LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 蛋白表達(dá)的影響（）

表2 宣肺止咳合劑對LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 蛋白表達(dá)的影響（）

注：正常對照組予生理鹽水；LPS 模型組予生理鹽水；宣肺止咳合劑低劑量組予7.5mg/kg 宣肺止咳合劑；宣肺止咳合劑中劑量組予15mg/kg宣肺止咳合劑；宣肺止咳合劑高劑量組予30mg/kg 宣肺止咳合劑；陽性對照組予地塞米松0.135mg/kg；除正常對照組外，其余各組給藥14d 后給予LPS 5mg/kg 尾靜脈注射；LPS 為內(nèi)毒素；與正常對照組比較，aP<0.01；與LPS 模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

圖2 免疫組化觀察宣肺止咳合劑對LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織中AQP1 表達(dá)的影響（200 倍）

2.4 宣肺止咳合劑對LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 mRNA 水平的影響 與正常對照組相比，LPS 模型組大鼠肺組織中AQP1 mRNA 水平顯著降低（P<0.01）。與LPS 模型組相比，給藥組大鼠肺組織中AQP1mRNA 水平有升高趨勢，其中僅有宣肺止咳合劑低劑量組無顯著性變化（P＞0.05），其余各組顯著升高（P<0.01 或P<0.05）。見表3。

表3 宣肺止咳合劑對LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 mRNA 水平的影響（）

注：正常對照組予生理鹽水；LPS 模型組予生理鹽水；宣肺止咳合劑低劑量組予7.5mg/kg 宣肺止咳合劑；宣肺止咳合劑中劑量組予15mg/kg宣肺止咳合劑；宣肺止咳合劑高劑量組予30mg/kg 宣肺止咳合劑；陽性對照組予地塞米松0.135mg/kg；除正常對照組外，其余各組給藥14d 后給予LPS 5mg/kg 尾靜脈注射；LPS 為內(nèi)毒素；與正常對照組比較，aP<0.01；與LPS 模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

2.5 宣肺止咳合劑對LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、IL-4 的影響 與正常對照組比較，LPS 模型組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、IL-4 水平顯著升高（P＜0.01）。與LPS 模型組相比，給藥組中TNF-α、IL-1、IL-6 水平有降低趨勢，IL-10、IL-4 有升高趨勢，其中宣肺止咳合劑低劑量組大鼠血清僅有趨勢而無顯著性（P＞0.05）；宣肺止咳合劑中、高劑量組與LPS+陽性對照組大鼠血清呈顯著性趨勢（P＜0.05 或P＜0.01）。見表4。

表4 宣肺止咳合劑對LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、IL-4 水平的影響（pg/mL，）

表4 宣肺止咳合劑對LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、IL-4 水平的影響（pg/mL，）

注：正常對照組予生理鹽水；LPS 模型組予生理鹽水；宣肺止咳合劑低劑量組予7.5mg/kg 宣肺止咳合劑；宣肺止咳合劑中劑量組予15mg/kg 宣肺止咳合劑；宣肺止咳合劑高劑量組予30mg/kg 宣肺止咳合劑；陽性對照組予地塞米松0.135mg/kg；除正常對照組外，其余各組給藥14d 后給予LPS 5mg/kg 尾靜脈注射；LPS 為內(nèi)毒素；與正常對照組比較，aP<0.01；與LPS 模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

3 討論

ALI 是ARDS 的早期階段，如果沒有得到有效的治療會(huì)進(jìn)展成為ARDS，嚴(yán)重威脅患者的生命[8]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥對ALI 的早期防治有著廣闊的應(yīng)用前景。本院自主研制的宣肺止咳合劑（原名清肺飲，由麻黃、杏仁、生石膏、葛根、僵蠶、知母、甘草七味藥組成），具有清熱宣肺，止咳平喘之功，是用于治療上呼吸道感染、急慢性支氣管炎、小兒毛細(xì)支氣管炎、急性肺炎等病癥的臨床常用方[9-12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予宣肺止咳合劑或DEX 治療后，能明顯改善LPS 模型組肺泡間質(zhì)滲出，減少炎性細(xì)胞浸潤，且中、高劑量組及陽性藥物組較低劑量組損傷明顯減輕。

ALI 發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，主要涉及炎癥反應(yīng)失控、氧化還原失衡、肺水代謝紊亂等許多層面?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，LPS 是ALI 首要的致病因子[13]。肺水腫是內(nèi)毒素性ALI 并發(fā)急性呼吸功能衰竭的主要病理基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為血管通透性增加、肺組織腫脹，組織間隙內(nèi)大量液體集聚，以及炎性細(xì)胞浸潤等[14-15]。肺泡水腫液的清除可能是治療內(nèi)毒素性肺損傷的關(guān)鍵措施。AQPs 是一組與水通透性有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，大量研究證實(shí)AQPs 在肺水腫的形成和消除過程中起非常重要的作用，可能是防治ALI 的重要靶點(diǎn)[16]。其中AQP1 作為最早發(fā)現(xiàn)的水通道蛋白亞型，與肺損傷關(guān)系最為密切，研究表明，AQP1 敲除鼠，氣腔-毛細(xì)血管屏障水通透性下降約10 倍[7]。李波等[17]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在LPS 誘導(dǎo)的ALI 模型中，表達(dá)于氣道和肺泡周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的AQP1 明顯減少。鐘佰強(qiáng)[18]研究發(fā)現(xiàn)，LPS 性肺損傷后AQP1 的表達(dá)水平下降，DEX 干預(yù)后，AQP1 的表達(dá)明顯提高?？梢?，AQP1 在LPS 性ALI 中扮演著重要的角色。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宣肺止咳合劑給藥組大鼠肺臟組織AQP1 蛋白表達(dá)、AQP1mRNA 水平較LPS 模型組呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，宣肺止咳合劑不同給藥劑量呈現(xiàn)濃度依賴性，其中宣肺止咳合劑中、高劑量組和陽性藥對照組有顯著性差異（P<0.05 或P<0.01）。

ALI 的另一重要發(fā)病機(jī)制主要為促/抗炎反應(yīng)失衡。LPS 誘導(dǎo)后可刺激細(xì)胞或組織釋放大量炎癥介質(zhì)，包括促炎介質(zhì)（TNF-α、IL-1、IL-6 等）和抗炎介質(zhì)（IL-10、IL-4 等），兩者之間的平衡失調(diào)是ALI 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[17-18]。研究表明，TNF-α、IL-1、IL-6 等促炎因子可抑制肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上AQPs 的表達(dá)，從而減少鈉離子的轉(zhuǎn)運(yùn)及肺泡內(nèi)液體清除，提示抑制促炎細(xì)胞因子的釋放及炎性反應(yīng)能夠增加AQPs 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肺泡內(nèi)液體清除。本研究采用宣肺止咳合劑干預(yù)LPS 誘導(dǎo)的ALI大鼠，檢測血清TNF-α、IL-1、IL-4、IL-6、IL-10 水平的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中、高劑量宣肺止咳合劑和陽性藥能抑制LPS 引起的TNF-α、IL-1、IL-6 水平升高，增加IL-4、IL-10 水平（P＜0.05 或P＜0.01）。

綜上所述，宣肺止咳合劑對內(nèi)毒素性ALI 的保護(hù)作用可能通過調(diào)控AQP1 的表達(dá)，抑制TNF-α、IL-1、IL-6 等促炎因子，促進(jìn)IL-10、IL-4 等抗炎因子的釋放，調(diào)節(jié)促/抗炎平衡來實(shí)現(xiàn)的。