白云綺　李慧　高照　范冬冬　婁利霞　吳愛明　孫克寒　商洪才　聶波

摘要 目的：比較酒制豨薟草和生豨薟草對大鼠心肌細胞缺氧損傷的保護作用，并探討其作用機制，為臨床用藥選擇提供實驗依據(jù)。方法：采用H9c2細胞缺氧模型，給予不同濃度酒制豨薟草和生豨薟草干預，CCK-8法測定細胞成活率，比色法檢測細胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶（LDH）活性，超氧化物歧化酶（SOD）活性;熒光酶標儀檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）含量;用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）檢測凋亡B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）的表達。結(jié)果：缺氧16 h成功制備H9c2心肌細胞缺氧損傷模型;篩選確定300 μg/mL是生豨薟草和酒制豨薟草最佳給藥濃度;與模型組比較，酒制豨薟草和生豨薟草均可提高細胞成活率（P<0.05），改善損傷細胞形態(tài)，減輕LDH外漏（P<0.05），降低ROS的含量（P<0.05），增加SOD活性（P<0.05），上調(diào)Bcl2（P<0.05）和Bcl-2/Bax的表達。給藥濃度為300 μg/mL時，生豨薟草在提高SOD活力和細胞成活率方面優(yōu)于酒制豨薟草（P<0.05），酒制豨薟草在抑制LDH外漏的作用強于生豨薟草，在活性氧（ROS）含量和Bcl、Bax蛋白表達方面，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論：酒制豨薟草和生豨薟草對缺氧損傷的H9c2心肌細胞具有保護作用，其機制可能是通過抵抗氧化應激，抑制心肌細胞凋亡。

關(guān)鍵詞 酒制豨薟草;生豨薟草;H9c2心肌細胞缺氧模型;心肌保護;氧化應激;細胞凋亡;乳酸脫氫酶;活性氧

Protective Effects of Wine-Processed and Raw Siegesbeckiae Herba on H9c2

Myocardial Cells Induced by Hypoxia：A Comparative Analysis

BAI Yunqi，LI Hui，GAO Zhao，F(xiàn)AN Dongdong，LOU Lixia，WU Aiming，SUN Kehan，SHANG Hongcai，NIE Bo1，2

（1 Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing，Dongzhimen Hospital，

Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 2 School of Chinese Materia Medica，

Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To compare the protective effects of wine-processed and raw Siegesbeckiae Herba on H9c2 myocardial cells induced by hypoxia and explore the underlying mechanism to provide the experimental basis for clinical drug selection.Methods：Hypoxia-induced H9c2 cells were treated by wine-processed and raw Siegesbeckiae Herba of different concentrations.Cell viability was detected by Cell Counting Kit-8（CCK-8） and the lactic dehydrogenase（LDH） activity in cell culture supernatant by colorimetry.Superoxide dismutase（SOD） activity was also detected.The fluorescence microplate reader was used to detect the content of intracellular reactive oxygen species（ROS）.Western blot was used to detect the protein expression of B-cell lymphoma 2（Bcl-2） and Bcl-2-associated X protein（Bax）.Results：The hypoxia model was properly induced in H9c2 myocardial cells after 16 hours of hypoxia.The screening results revealed that the optimal concentration of wine-processed and raw Siegesbeckiae Herba was 300 μg/mL.Compared with the conditions in the model group，wine-processed and raw Siegesbeckiae Herba could improve cell viability（P<0.05），improve damaged cell morphology，reduce LDH leakage（P<0.05），decrease ROS content（P<0.05），potentiate SOD activity（P<0.05），and up-regulate the expression of Bcl-2（P<0.05） and Bcl-2/Bax.In the context of administration concentration of 300 μg/mL，raw Siegesbeckiae Herba was superior to wine-processed Siegesbeckiae Herba in potentiating SOD activity and increasing cell viability（P<0.05），while wine-processed Siegesbeckiae Herba was superior to raw Siegesbeckiae Herba in inhibiting LDH leakage.No statistically significant difference in ROS content and protein expression of Bcl and Bax was observed between wine-processed and raw Siegesbeckiae Herba.Conclusion：Wine-processed and raw Siegesbeckiae Herba possessed protective effects on H9c2 myocardial cells induced by hypoxia，and the mechanism might be related to the resistance to oxidative stress and the inhibition of myocardial apoptosis.

Keywords Wine-processed Siegesbeckiae Herba; Raw Siegesbeckiae Herba; H9c2 myocardial cell hypoxia model; Myocardial protection; Oxidative stress; Cell apoptosis; lactic dehydrogenase（LDH）; Reactive oxygen species（ROS）

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.06.005

豨薟草（Siegesbeckiae Herba，HS）性寒味苦，歸肝、腎經(jīng)，具有祛風濕，通經(jīng)絡(luò)，清熱解毒的功效，臨床上常用于治療風濕痹痛、筋骨不利，并具有很好抗炎鎮(zhèn)痛功效[1-2]。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，HS對心臟具有很好的保護作用，可以通過抑制炎癥，抗氧化作用抵抗慢性心肌損傷，其對于急性心肌損傷也具有保護作用，其機制可能是通過抗氧化作用或者防止心肌重構(gòu)來發(fā)揮作用[3-4]。然而我們發(fā)現(xiàn)豨薟草炮制方法多樣，無論是含有豨薟草的中成藥，還是臨床應用的豨薟草，使用比較多的炮制方法清蒸和酒蒸，即生豨薟草（SHS）和酒制豨薟草（JHS）。臨床應用多根據(jù)經(jīng)驗和醫(yī)生偏好選擇HS炮制品，尚未見從藥效學對常用2種炮制品進行評價研究[3-5]。因此，本實驗采用H9c2心肌細胞缺氧損傷模型，通過考察細胞成活率、乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）漏出率、氧化酶活力、凋亡相關(guān)蛋白表達情況，探討SHS和JHS對H9c2細胞缺氧損傷的保護作用及其機制，比較二者藥效學差異，為臨床選擇HS的炮制品提供實驗依據(jù)，同時也為HS治療心血管疾病的機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 H9c2大鼠心肌細胞株，購于中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所協(xié)和細胞資源中心，批號：H9c2 2-1。

1.1.2 藥物 生豨薟草和酒制豨薟草提取物由北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院實驗室提供，批號：83161101。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基（BI公司，以色列，批號：0024219）;胎牛血清（Gibco公司，美國，批號：2045677R）;胰蛋白酶（Gibco公司，美國，批號：15140-122）;細胞增殖-毒性檢測試劑盒（日本同仁化學研究所，日本，批號：CK04）;青-鏈霉素溶液（Gibco公司，美國，批號：15140-122）;LDH試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A020-2-2）;SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A001-3-2）;MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A003-1-2）;ROS試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：E004）;大鼠抗Bax抗體（Proteintech公司，美國，批號：50599-2-Ig）;兔抗Bcl-2抗體（Proteintech公司，美國，批號：26593-1-AP）;兔抗β-acting抗體（abcam公司，美國，批號：AB66132）;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：BST13L04A54）;抗鼠IgG抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：BST14J10A50）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：B0802）;PVDF膜（Millipore公司，美國，批號：K4SA1716L）;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（廣州雅梅生物科技有限公司，批號：013C2151）;ECL化學發(fā)光試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號：P1010）;RIPA裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號：CI1053）、奶粉（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號：P1622）。酶標儀（BIO-TEX Instruments公司，美國，型號：ELX800），倒置顯微鏡（重慶光學儀器廠，型號：XSZ-D2），自動細胞計數(shù)儀（Countstar公司，美國，型號：IC 1000），低溫離心機（Eppendorf公司，德國，型號：5424R），37 ℃恒溫CO培養(yǎng)箱（SANYO公司，日本，型號：MCO-15AC CO），垂直電泳儀（北京市六一儀器廠，型號：DYCZ-25D），垂直電轉(zhuǎn)儀（北京市六一儀器廠，型號：DYCZ-40D），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號：Tanon-5200），超凈臺（海爾集團，型號：HCB-900V），三氣培養(yǎng)箱（BioSpherix，美國，型號：C42）。

1.2 方法

1.2.1 酒制豨薟草和生豨薟草的溶液制備 精密稱取SHS和JHS提取物各20 mg，以DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡稱“培養(yǎng)基”）溶解制成2.0 mg/mL的貯備液，經(jīng)0.22 μm濾器濾過除菌，于-20 ℃保存。后續(xù)實驗時以培養(yǎng)基將其稀釋至相應濃度。

1.2.2 H9c2細胞的培養(yǎng)及缺氧損傷模型的建立 H9c2細胞以含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞增殖至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化、計數(shù)，并以1∶3比例傳代。取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞懸液密度為8×10個/mL接種于細胞板或細胞瓶中，置于37 ℃、5% CO細胞培養(yǎng)箱中孵育48 h，待細胞增殖至80%～90%時，建立缺氧損傷模型。用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞板或細胞瓶3次，換無血清培養(yǎng)基，將細胞放入三氣培養(yǎng)箱（1% O、5% CO、94% N）中密閉缺氧培養(yǎng)。缺氧結(jié)束后，取細胞或培養(yǎng)液進行相應指標檢測。

1.2.3 分組與給藥方法 本實驗分為正常組、模型組、SHS組、JHS組。正常組：用含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng);模型組：缺氧條件下用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng);SHS組和JHS組：缺氧同時加入藥物（藥物用無血清培養(yǎng)基配制，濃度為100、300、500 μg/mL），其余過程同模型組。

1.2.4 檢測指標與方法

1.2.4.1 細胞活力的檢測 細胞活力檢測采用CCK-8法。細胞接種于96孔板，按實驗條件進行培養(yǎng)后，棄去細胞上清，每孔加入CCK-8溶液10 μL和100 μL無血清培養(yǎng)基，孵育1 h，用酶標儀在450 nm測定吸光度，計算細胞成活率，同時倒置顯微鏡觀察各組細胞生長及損傷情況。

1.2.4.2 細胞培養(yǎng)上清液中LDH的含量測定 微量酶標法檢測細胞LDH漏出量。細胞接種于6孔板，造模給藥后，取細胞上清液，按照比色法進行LDH活性測定，并根據(jù)試劑盒上的相關(guān)換算公式將實驗結(jié)果進行標準化轉(zhuǎn)換。

1.2.4.3 細胞內(nèi)活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）水平的測定 細胞接種于6孔板，造模給藥后，用胰酶消化并收集細胞，PBS清洗后重懸，調(diào)整細胞懸液密度為8×10個/mL種于96孔板中，加入熒光探針2，7-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA），避光孵育1 h后于熒光酶標儀檢測含量，酶標儀激發(fā)波長510 nm，發(fā)射波長525 nm檢測細胞熒光強度，并根據(jù)試劑盒上的相關(guān)換算公式將實驗結(jié)果進行標準化轉(zhuǎn)換。

1.2.4.4 細胞內(nèi)超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活力測定 微量酶標法檢測細胞中SOD活力，細胞接種于10 cm皿中，造模給藥后，用胰酶消化并收集細胞，PBS洗3次后，離心，棄去細胞上清液，留取沉淀，再加入1 mL的PBS并混勻，然后將其放入液氮中反復凍融3次，在2 000 r/min，離心半徑11 cm條件下離心2 min后取上清液，根據(jù)試劑盒說明書要求檢測細胞內(nèi)SOD活力。

1.2.4.5 B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）表達水平檢測 細胞接種于25 cm培養(yǎng)瓶中，造模給藥后，用胰酶消化并收集細胞。然后用RIPA細胞裂解液在冰上裂解30 min，15 000 r/min，離心半徑6 cm條件下離心后取上清液，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取等量總蛋白上樣，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（Polyvinylidenefluoride，PVDF）膜。用5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗Rabbit Anti-Bcl-2（濃度為1∶1 000），Mouse Anti-Bax（濃度為1∶5 000），Rabbit Anti-bactin（濃度為1∶5 000），在4 ℃條件下?lián)u床孵育過夜。次日，TBST洗膜5次后，用Goat Anti-rabbit，Goatanti-mouse（濃度為1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗滌5次后，增強型化學發(fā)光試劑（ECL）顯色。Image J軟件灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同缺氧時間對H9c2細胞成活率的影響 缺氧時間增加可加重H9c2細胞氧化應激損傷并降低細胞成活率。實驗結(jié)果顯示H9c2細胞缺氧16～48 h可顯著降低細胞成活率。H9c2細胞缺氧16 h，細胞成活率為48.39%，細胞成活率降低程度適中，實驗結(jié)果重復性好（n=6），因此選擇16 h來建立細胞缺氧損傷模型。見圖1。

2.2 SHS和JHS不同濃度對H9c2細胞活力的影響 與正常組比較，給藥濃度在800 μg/mL以下未見細胞毒性，因此在后續(xù)實驗中，SHS和JHS均采用500、300、100 μg/mL為藥物干預濃度。見表1。

2.3 SHS和JHS對缺氧損傷H9c2細胞活力和LDH漏出率的影響 與正常組比較，模型組細胞成活率下降（P<0.05），LDH漏出率增多（P<0.05）;與模型組比較，3個濃度的SHS組和JHS組細胞成活率均升高（P<0.05），LDH的漏出率下降（P<0.05）。SHS各濃度組間比較，給藥濃度為300 μg/mL時，細胞成活率最高（P<0.05），LDH漏出率各組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;JHS各濃度組間比較，給藥濃度為300 μg/mL時，LDH漏出率最低（P<0.05），細胞成活率各組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。因此，綜合造模給藥后細胞活力和LDH指標篩選出最適給藥劑量分別為：SHS給藥濃度為300 μg/mL，JHS給藥濃度為300 μg/mL，接下來實驗SHS和JHS均采用該濃度。見表2，圖2。

2.4 SHS和JHS對缺氧損傷H9c2細胞ROS水平、SOD活性的影響 與正常組比較，模型組細胞內(nèi)ROS水平增加（P<0.05），SOD活力降低（P<0.05）;與模型組比較，SHS組和JHS組均降低細胞胞內(nèi)ROS的水平（P<0.05），增加SOD活性（P<0.05）;SHS組與JHS組比較，SHS組SOD活性高于JHS組（P<0.05），ROS水平2組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖3、圖4。

2.5 SHS和JHS對缺氧損傷后H9c2細胞中Bax，Bcl-2，Bcl-2/Bax蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組Bcl-2表達水平下調(diào)（P<0.05），Bax表達水平上調(diào)（P<0.05），Bcl-2/Bax比值下調(diào)（P<0.05）;與模型組比較，SHS組和JHS組均可上調(diào)Bcl-2的表達（P<0.05），上調(diào)Bcl-2/Bax的比值（P<0.05），但Bax值未見明顯差異;SHS組與JHS組的Bax、Bcl-2、Bcl-2/Bax水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖5。

3 討論

HS最早記載于唐代的《新修本草》：“主金瘡，止痛，斷血，生肉，除諸惡癥，消浮腫，搗封之。湯漬、散敷并良。”古文獻中記載的炮制方法有很多種，包括清蒸、酒蜜蒸、酒蒸、酒炒、清炒等，其中以清蒸、酒蒸應用最為廣泛[6]。現(xiàn)代臨床應用和專利藥中HS多是清蒸和酒蒸，但品種選擇依據(jù)未見相關(guān)實驗報道，因此本實驗以豨薟草的2種常用品種SHS和JHS為研究對象，從防治心肌缺氧損傷藥理作用進行比較研究。

心肌缺氧造模選用經(jīng)典造模方式，依據(jù)本實驗結(jié)果調(diào)整缺氧時間，H9c2細胞缺氧不同時間，則細胞受損程度不同[14]。缺氧16 h時，細胞損傷明顯，細胞成活率降至50%左右，因此選擇16 h為本實驗缺氧損傷的造模時間。采用CCK-8法篩選藥物給藥濃度，發(fā)現(xiàn)藥物濃度為800 μg/mL以下細胞正常生長，避免了藥物毒性對實驗結(jié)果的影響，本實驗采用500、300、100 μg/mL為藥物干預濃度。心肌缺氧時，細胞膜和線粒體膜損傷導致膜通透性增加，LDH漏出增多，LDH作為有效評價心肌損傷程度的指標[10]。本研究從細胞活力和LDH指標進一步篩選，確定給藥濃度SHS為300 μg/mL，JHS為300 μg/mL。

心肌細胞在缺氧狀態(tài)下，清除氧自由基的SOD含量下降，氧自由基增多，導致ROS清除不足，ROS在體內(nèi)增多，破壞機體氧化/還原反應，從而引起細胞氧化損傷[8，17-18]。心肌缺氧時LDH漏出增多，細胞膜和線粒體膜損傷而介導的膜通透性增加，線粒體受損或功能障礙激活線粒體自噬，從而降解受損線粒體達到降低ROS等促凋亡因子的生成[10，19-20]，因此當ROS在體內(nèi)過度增多時，機體會代償性通過多途徑減少其分泌，降低ROS的含量。本研究發(fā)現(xiàn)，SHS和JHS均能明顯提升SOD活力，顯著降低LDH外漏和ROS含量，具有清除氧化自由基的能力，減輕氧自由基損傷的作用。濃度為300 μg/mL時，SHS組細胞成活率和SOD活性高于JHS組，JHS抑制LDH外漏作用強于SHS，2組ROS水平比較，差異無統(tǒng)計學意義。分析產(chǎn)生差異的原因可能是，炮制后的JHS有效成分發(fā)生改變，其中豨薟精醇含量下降，奇壬醇和豨薟苷含量升高[7]。推測可能是豨薟精醇在提高SOD活力方面優(yōu)于奇壬醇和豨薟苷，而奇壬醇和豨薟苷則對抑制LDH外漏有更好的效果。

心肌缺氧損傷可以導致線粒體功能障礙，線粒體是心肌細胞內(nèi)重要的細胞器，不僅是ATP產(chǎn)生的主要場所，而且是細胞凋亡的啟動處[21]。Bcl2蛋白通過維持線粒體鈣離子穩(wěn)定，抑制細胞色素C等促凋亡物質(zhì)，從而維持線粒體穩(wěn)定[11]。Bax蛋白是Bcl2的家族成員，二者共同調(diào)控細胞凋亡[12]。研究者把Bcl-2/Bax作為調(diào)節(jié)細胞凋亡的指標，其比值增加，細胞凋亡減少，比值降低，則促使細胞凋亡[16]。本實驗發(fā)現(xiàn)SHS和JHS均能明顯下調(diào)Bcl-2的表達，上調(diào)Bcl-2/Bax比值，減少細胞凋亡。

綜上所述，SHS和JHS對缺氧損傷H9c2細胞具有保護作用。其作用機制可能是抑制LDH外漏，提高SOD活力，清除過量ROS，調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達，抗氧化應激和維持線粒體完整從而抑制心肌細胞凋亡。其中SHS在提高SOD活力和細胞成活率方面優(yōu)于JHS，JHS在防止LDH外漏方面優(yōu)于SHS，其他方面沒有顯著差異，綜合以上指標評價SHS在保護心肌缺氧方面略優(yōu)于JHS。本實驗從細胞水平比較了生豨薟草和酒制豨簽草對心肌缺氧損傷的療效，并探討了初步的作用機制，為炮制品的臨床應用選擇提供實驗依據(jù)，為豨薟草在心血管疾病防治方面深入研究奠定基礎(chǔ)。

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（2020-07-16收稿 本文編輯：王明）

基金項目：第二批國家“萬人計劃”科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才特殊支持經(jīng)費資助項目（W02020052）;北京中醫(yī)藥大學重點實驗室項目（1000061222482）

作者簡介：白云綺（1994.08—），女，碩士研究生在讀，研究方向：心腦血管的中醫(yī)藥防治;E-mail：1723668176@qq.com

通信作者：聶波（1977.12—），女，博士，研究員，研究方向：中醫(yī)藥防治動脈粥樣硬化及其作用機制，中藥藥效物質(zhì)質(zhì)量標準及藥物代謝，E-mail：nieboww_1977@163.com