胡夢藝　江一靜　饒婷　楊珊莉

摘要 目的：基于突觸可塑性觀察電針曲池、足三里對大腦中動脈閉塞（MCAO）大鼠運動障礙的改善。方法：將60只雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、穴位組、非穴組，每組15只。采用Zea Longa線拴法制備MCAO大鼠模型，電針曲池、足三里，干預14 d。通過神經(jīng)功能評分判斷大鼠的神經(jīng)功能缺損情況;CatWalk步態(tài)分析比較各組大鼠運動功能，TTC染色觀察腦梗死體積，透射電鏡觀察突觸超微結(jié)構(gòu)和數(shù)量，免疫熒光檢測缺血側(cè)運動皮層突觸相關因子突觸后致密物-95（PSD-95）、突觸蛋白的表達情況。結(jié)果：干預14 d后，與模型組比較，穴位組大鼠神經(jīng)功能評分降低（P<0.05）;步行速度提高、雙足支撐時間縮短（P<0.05）;腦梗死體積減少（P<0.05）;突觸超微結(jié)構(gòu)改善明顯，突觸數(shù)量增加（P<0.05），突觸相關因子突觸蛋白、PSD-95表達上調(diào)（P<0.05）。Catwalk步態(tài)參數(shù)、腦梗死體積與突觸超微結(jié)構(gòu)改善有一致性。結(jié)論：電針曲池、足三里穴可改善MCAO大鼠運動障礙，其機制可能與上調(diào)突觸相關因子的表達，改善突觸可塑性有關。

關鍵詞 腦卒中;電針;運動功能;突觸可塑性;機制研究;大腦中動脈閉塞;突觸后致密物-95;突觸素

Mechanism of Electroacupuncture in Improving Dyskinesia in MCAO Rats Based on Synaptic Plasticity

HU Mengyi，JIANG Yijing2，3，RAO Ting1，2，YANG Shanli2，3

（1 Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，China; 2 Rehabilitation Hospital Affiliated to Fujian University

of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350003，China; 3 Key Laboratory of Rehabilitation Technology，F(xiàn)uzhou 350003，China）

Abstract Objective：To observe the effect of electroacupuncture（EA） at “Quchi（LI 11）” and “Zusanli（ST 36）” on the dyskinesia in middle cerebral artery occlusion（MCAO） rats based on synaptic plasticity.Methods：Sixty male SD rats were randomly divided into a sham operation group，a model group，an acupoint group，and a non-acupoint group，with 15 rats in each group.The MCAO model was induced in rats by the Zea-Longa method.EA treatment at “Quchi（LI 11）” and “Zusanli（ST 36）” was carried out for 14 days.The neurological deficits of rats were evaluated by the score of the Neurological Impairment Scale.The motor functions of rats in each group were compared by the CatWalk-assisted gait analysis system.TTC staining was used to observe the cerebral infarction volume.The ultrastructure and number of synapses were observed by transmission electron microscopy（TEM）.The expression of synapse-related factors PSD-95 and synapsin in the ischemic motor cortex was detected by immunofluorescence assay.Results：After 14 days of intervention，compared with the model group，the acupoint group showed decreased neurological deficit score（P<0.05），quickened walking，shortened bipedal stance time（P<0.05），reduced cerebral infarction volume（P<0.05），improved synapse ultrastructure，increased number of synapses（P<0.05），and up-regulated expression of synapse-related factors synapsin and PSD-95（P<0.05）.Catwalk gait parameters and cerebral infarction volume were consistent with synaptic ultrastructure improvement.Conclusion：EA at “Quchi（LI 11）” and “Zusanli（ST 36）” can improve dyskinesia in MCAO rats，and the mechanism may be related to the up-regulation of the expression of synaptic-related factors and the improvement of synaptic plasticity.

Keywords Stroke; Electroacupuncture; Motor function; Synaptic plasticity; Mechanism research; MCAO; PSD-95; Synapsin

中圖分類號：R245;R743.3文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.06.007

最新全球疾病負擔研究的系統(tǒng)分析表明，腦卒中是影響50歲以上人群致死和致殘的主要原因[1]。由于該疾病具有致殘率高、死亡率高的特點，患者常留下多種后遺癥，運動功能障礙是常見的后遺癥之一，影響著70%～80%的腦卒中患者[2]。腦卒中后運動障礙是一種不自主的異常運動模式，嚴重影響患者的日常生活，給家庭、社會帶來一定的壓力與負擔[3]。

運動障礙的癥狀與缺血中心神經(jīng)元死亡導致的正常神經(jīng)功能的中斷有關。神經(jīng)網(wǎng)絡發(fā)揮生理功能的基礎是神經(jīng)元之間相互形成的神經(jīng)突觸及介導信息傳遞，缺血后突觸結(jié)構(gòu)的完整性損害，中斷傳輸信號，導致感覺運動功能受損[4-5]。由于突觸是遞質(zhì)和受體的功能單位，因此是整個中樞系統(tǒng)細胞間信號傳遞的基本結(jié)構(gòu)[6]。突觸超微結(jié)構(gòu)的改變很大程度上反映出神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性，是缺血再灌注損傷后腦可塑性的基礎。針灸是中醫(yī)學的瑰寶，從古至今被廣泛應用于腦血管疾病的治療?！夺樉募滓医?jīng)》等169部醫(yī)籍治療中風半身不遂或癱瘓的統(tǒng)計結(jié)果顯示，曲池、足三里使用頻率最高、相互配伍也最為常見[7-8]。臨床研究已證明針灸治療可降低腦卒中的致殘率與復發(fā)率，但作用機制未闡明[9-11]。

突觸后致密物-95（Postsynaptic Density-95，PSD-95）作為信號復合物，具有促突觸連接的形成、維持突觸可塑性的生物學功能，在反應性突觸形成中起關鍵作用，突觸蛋白與突觸功能和結(jié)構(gòu)關系密切，被用作突觸數(shù)量的指示劑，二者都是突觸可塑性標志物[12-13]。本研究觀察電針曲池、足三里對MCAO大鼠突觸超微結(jié)構(gòu)及PSD-95、突觸蛋白表達的改變，旨在基于突觸可塑性以研究電針治療患側(cè)曲池、足三里改善腦卒中后遺留的運動功能障礙的中樞機制，為臨床電針治療缺血性腦卒中提供理論與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 8周齡雄性的健康SD大鼠60只（220～280 g），無特定病原（Specific Pathogen-free，SPF）級，購自浙江省醫(yī)學科學院[許可證號SCXK（浙）2019-0002]，喂養(yǎng)于本校的實驗動物中心。室溫下自由飲食水，模擬標準日夜系統(tǒng)，相對濕度30%～60%，溫度21～23 ℃。此實驗經(jīng)福建中醫(yī)藥大學倫理委員會批準并同意（倫理審批號：2020035），并在飼養(yǎng)和使用實驗動物時遵守“減少、優(yōu)化和替代”的原則給予充分的人道主義關懷。

1.1.2 試劑與儀器 線栓：深圳瑞沃德生命科技有限公司。電針儀：無錫佳健醫(yī)療器械有限公司。Catwalk步態(tài)分析系統(tǒng)：荷蘭Noldus信息技術(shù)有限公司。透射電鏡：H7650，HITACH日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 60只SPF雄性SD大鼠，適應性喂養(yǎng)1周，采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、穴位組、非穴組，每組15只。4組大鼠的鼠齡、體質(zhì)量等一般資料經(jīng)統(tǒng)計學分析，差異無統(tǒng)計學意義（P<0.05），具有可比性。采用改良的Longa等[14]用線栓法開展MCAO動物模型的制備，實驗動物術(shù)前禁食不禁水12 h，用10%的水合氯醛以0.35 mL/kg的比例對各組大鼠腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉充分后以仰臥位于手術(shù)板固定，依次備皮消毒。沿頸部正中間以一垂直的約2 cm的豎切口切開皮膚，鈍性分離各肌群、肌肉，直至暴露右側(cè)的頸總動脈，逐漸細致分離迷走神經(jīng)、頸內(nèi)動脈、頸外動脈。使用4-0的縫合線充分結(jié)扎頸總動脈遠端及頸外動脈，使用動脈夾將頸內(nèi)動脈夾閉，并用血管剪在分叉口剪一小切口，將一根帶有硅膠端包裹的魚線插入頸內(nèi)動脈（18～22 mm），至感覺有輕微阻力，閉塞大腦中動脈。用縫合線將頸內(nèi)動脈及魚線固定，縫合皮膚并消毒。90 min后拔出線10～15 mm恢復再灌注。假手術(shù)大鼠除閉塞大腦中動脈外，均進行以上相同的操作。

1.2.2 干預方法 4組大鼠術(shù)后均進行Longa評分并回籠飼養(yǎng)，分組情況對評估者設盲。第2天進行干預，對假手術(shù)組及模型組的大鼠進行點按患側(cè)肢體曲池穴及足三里穴，頻率為1次/d;穴位組進行患側(cè)電針曲池穴及足三里穴（取穴方法參照實驗大鼠腧穴圖譜[15]）;非穴組在穴位附近選一點扎針。針具選用0.5寸毫針（華佗牌），針刺深度3 mm，進針后提插捻轉(zhuǎn)，隨后接上華佗牌電針儀，采用疏密波，頻率1～20 Hz，電壓峰值為6 V，見大鼠肢體肌肉微微顫動為標準，30 min/次，1次/d。4組大鼠共持續(xù)干預14 d，至處死。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 神經(jīng)行為學評分 分別測試4組大鼠術(shù)后24 h以及干預14 d的神經(jīng)行為學評分，具體分組情況對評估者施盲，參考Longa等[14]5級4分法的評分標準評定神經(jīng)功能，1～3分表明造模成功可納入模型組，0分及4分不符合納入標準則剔除。具體評分標準：0分：正常，大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)損傷癥狀;1分：大鼠患側(cè)前肢不能完全伸展，出現(xiàn)輕度神經(jīng)功能缺損表現(xiàn);2分：步行時，大鼠右側(cè)轉(zhuǎn)圈，出現(xiàn)中度神經(jīng)功能缺損表現(xiàn);3分：步行時，大鼠向右側(cè)傾倒，出現(xiàn)中度神經(jīng)功能缺損表現(xiàn);4分：大鼠意識喪失，無法進行自發(fā)性行走。

1.2.3.2 CatWalk步態(tài)分析 所有大鼠進行為期1周的適應性CatWalk訓練，訓練過程中數(shù)據(jù)不做記錄，主要目的為使大鼠充分熟悉跑道的環(huán)境，以便正式測試時達到測試所需的要求。訓練前需禁食但不限水，每次完成訓練后每只大鼠給予12～15 g飼料，以控制體質(zhì)量及培養(yǎng)實驗動物形成穩(wěn)定獎勵機制。采集術(shù)后24 h、干預14 d的步態(tài)參數(shù)。訓練方法：打開電腦、CatWalk跑道燈、攝像頭燈等所有相關設備，并使實驗室房間無其他明顯光源，使大鼠平穩(wěn)進入CatWalk跑道，讓其在任何刺激的情況下自發(fā)地、不停頓地通過跑道。測試的大鼠在5 s內(nèi)無中斷及大致勻速地通過跑道3次，且采集范圍內(nèi)的單次總步數(shù)不少于6步。

1.2.3.3 TTC染色 干預14 d后，各組大鼠隨機取5只，處死取腦，將腦組織-20 ℃冰凍5 min，置于冰上腦模內(nèi)，沿冠狀切面以腦腹側(cè)視交叉為中點切成2 mm的組織片，連續(xù)切5片。將切片置于1% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyl-2H-tetrazolium Chloride，TTC）磷酸緩沖液中，在37 ℃避光染色20 min，然后用10%甲醛溶液固定，并采用Image J 1.36b軟件計算大鼠缺血側(cè)腦梗死體積的百分比。白色為梗死區(qū)域，紅色為未梗死區(qū)域。見圖1。

1.2.3.4 透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu) 各組大鼠干預14 d后，每組隨機選取5只進行麻醉，夾閉腹主動脈，于心尖、右心耳處剪一開口，心尖處灌注生理鹽水300 mL，再注入預冷的4%多聚甲醛進行腦組織灌流固定，小心取體積為1 cm的缺血側(cè)腦組織皮質(zhì)浸泡于2%多聚甲醛-2.5%戊二醛磷酸緩沖液中充分固定24 h，隨后取出組織用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）漂洗3次，10 min/次，1%鋨酸磷酸緩沖液固定1.5 h再次漂洗，取出組織后進行常規(guī)脫水、包埋，隨后將包埋的組織塊置于60 ℃烘干箱中聚合48 h后至硬化。將包埋塊帶組織的一段粗修至暴露組織，后修切成厚度1 μm的半薄切片，修去樹脂等邊緣組織使切面呈梯形再用超薄刀片將其切成90 nm薄片，銅網(wǎng)撈片干燥后進行染色，透射電子顯微鏡下觀察每個銅網(wǎng)內(nèi)標本的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.3.5 免疫熒光檢測Synaspsin、PSD-95的表達 各組大鼠造模14 d后，腹腔注射麻醉后，夾閉腹主動脈，于心尖、右心耳處剪一開口，心尖處灌注生理鹽水300 mL，再注入預冷的4%多聚甲醛進行腦組織灌流固定，小心取出形態(tài)完整的腦組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定36 h，經(jīng)脫水處理后石蠟包埋后，制成厚度為5 μm、均勻、無刀痕、無皺褶的組織切片，將切片脫蠟至水、修復抗原后經(jīng)PBS漂洗，室溫下用5%山羊血清封閉120 min，滴加一抗（突觸蛋白、PSD-95鼠多克隆抗體，濃度1∶300），4 ℃過夜。次日復溫30 min后對切片進行PBS漂洗，滴加熒光二抗（山羊抗鼠和山羊抗兔濃度為1∶300），避光37 ℃孵育0.5 h。經(jīng)PBS漂洗3遍，用含4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的抗熒光淬滅封片劑進行封片。于熒光顯微鏡下觀察缺血側(cè)腦皮質(zhì)。每組選取5只大鼠不同位置的腦切片3張，在相同放大倍數(shù)、相同參數(shù)條件下，每張腦組織切片隨機選取4個視野照相，使用Image J軟件統(tǒng)計突觸蛋白、PSD-95陽性細胞數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)局統(tǒng)計由本研究不知情者完成。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析法及LSD法統(tǒng)計。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Zea-Longa評分比較 實驗大鼠術(shù)后24 h，與假手術(shù)組大鼠比較，模型組、穴位組及非穴組大鼠Zea-Longa評分均升高，說明MCAO術(shù)后動物表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)運動功能障礙，但模型組、穴位組與非穴組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠干預前后CatWalk系統(tǒng)中步行速度比較 干預14 d后，穴位組大鼠步行速度明顯快于非穴組，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠干預前后CatWalk系統(tǒng)中雙足支撐時間比較 各組大鼠干預14 d后，穴位組大鼠雙足支撐時間明顯少于非穴組，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠干預前后腦梗死體積比較 TTC染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織無明顯腦梗死區(qū)域。模型組、穴位組和非穴組大鼠均有明顯梗死灶，與假手術(shù)組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.01）;與模型組比較，穴位組和非穴組大鼠梗死體積顯著減小，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.01）;與非穴組比較，穴位組腦梗死體積較小，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表4。

2.5 各組大鼠透射電鏡超微結(jié)構(gòu)變化 通過透射電鏡觀察可見假手術(shù)組突觸間隙清晰，突觸前后膜結(jié)構(gòu)清晰，前膜內(nèi)突觸可見囊泡多且分布均勻、密集，突觸后致密帶密度高。模型組與假手術(shù)組比較，突觸間隙模糊，突觸前后膜模糊，前膜內(nèi)突觸的囊泡密度不均、數(shù)量少，突觸后致密帶密度較低，突觸數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;非穴組、穴位組與模型組比較，突觸間隙較清晰、突觸前后膜較清晰可見、前膜內(nèi)可見突觸囊泡較分布密集且較均勻、豐富，突觸后致密帶密度高，突觸數(shù)量明顯增多，尤其是穴位組的突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的改善程度優(yōu)于非穴組，在穴位組不同組別中，隨著電針干預時間的延長，突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)改善越明顯，突觸數(shù)量增加越多，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖2、圖3。

2.6 各組大鼠Synapsin、PSD-95表達比較 免疫熒光結(jié)果顯示大鼠經(jīng)過MCAO造模術(shù)后突觸蛋白、PSD-95水平急劇減少，進行電針干預后突觸蛋白、PSD-95表達有所上調(diào)，其中穴位組上調(diào)的趨勢較非穴組明顯，且具有一定的時間依賴性。見圖4～5。

3 討論

腦卒中是嚴重危害人類健康的疾病。近年來，大量臨床試驗證實了電針在治療腦卒中方面的療效確切，包括改善肢體運動功能、吞咽障礙以及言語困難等癥狀，對其治療機制研究也日益深入[16-17]?！端貑枴ゐ粽撈吩弧罢撗灾勿粽?，獨取陽明”，可見陽明經(jīng)在治痿中的重要性，曲池、足三里分別為手、足陽明經(jīng)之合穴，調(diào)理氣血、濡養(yǎng)筋脈，為中風痿痹康復治療常用穴位。已有基礎研究揭示了電針曲池、足三里在減輕腦缺血損傷方面的分子和生物物理相關性[18-19]。另有研究表明，實驗性腦缺血模型經(jīng)過電針曲池、足三里干預后梗死體積縮小，感覺、運動皮層葡萄糖代謝增加，同時CatWalk步態(tài)分析結(jié)果和Rota-rod測試表現(xiàn)出運動功能改善的趨勢[20]。本研究結(jié)果表明，電針曲池、足三里能有效改善MCAO大鼠的神經(jīng)行為學表現(xiàn)（P<0.05），CatWalk步態(tài)分析結(jié)果顯示穴位組大鼠的步行速度提高（P<0.05），雙足支撐時間減少（P<0.05），腦梗死體積減少（P<0.05），與以往研究結(jié)果類似。

腦缺血后神經(jīng)功能的關鍵分子基礎是突觸可塑性，神經(jīng)元間突觸的改變會促進機體更加適應環(huán)境的改變，即突觸可塑性[21]。突觸可塑性是指突觸鏈接在形態(tài)上和功能上的修飾，主要是指突觸在一定條件下調(diào)整功能、改變形態(tài)和增減數(shù)目的能力，包括突觸傳遞效能的變化和突觸結(jié)構(gòu)的改變，缺血后突觸可塑性作為一個修復過程，可通過增加樹突分支，特別是Ⅲ層多極神經(jīng)元并重建腦半球間的軸突連接;也通過新生的軸突芽，建立新的神經(jīng)環(huán)路，促進新生神經(jīng)元的投射[22-23]。因此突觸可塑性有助于腦卒中后神經(jīng)功能的恢復。目前，許多促進突觸可塑性的治療已被證明對缺血性損傷有保護作用[24]，因此我們選用與突觸形態(tài)功能密切相關的突觸可塑性標志物PSD-95、Synapsin作為觀察指標，以進一步確定電針曲池、足三里對突觸可塑性的影響。PSD-95是衡量突觸可塑性的關鍵蛋白之一，以往研究將其作為衡量突觸可塑性的主要指標之一[25]。Synapsin是一種鈣結(jié)合蛋白，位于突觸前囊泡膜上，參與突觸可塑性的調(diào)節(jié)[26]。我們通過免疫熒光染色、透射電鏡觀察，進一步確定電針對突觸可塑性的影響。實驗結(jié)果表明，電針上調(diào)了PSD-95和Synapsin的表達，改善了突觸的超微結(jié)構(gòu)。本研究數(shù)據(jù)與以前的研究結(jié)果相似，即PSD-95和Synapsin表達的上調(diào)，電針可促進突觸可塑性[27]。

綜上所述，電針患側(cè)曲池穴、足三里穴14 d可減少MCAO大鼠缺血側(cè)腦梗死體積，有益于促進缺血側(cè)皮質(zhì)突觸的可塑性，從而提高MCAO后運動功能水平及改善神經(jīng)功能缺損情況。本研究將為臨床應用電針干預以改善缺血性腦卒中提供了相應的實驗依據(jù)，為針刺干預防治腦卒中后運動障礙的中樞機制提供了研究思路。

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（2021-05-06收稿 本文編輯：芮莉莉）

基金項目：國家自然科學基金項目（81904268）;福建省衛(wèi)生健康中青年骨干人才培養(yǎng)項目（2019-ZQN-81）;中醫(yī)藥循證能力-?？茖２⊙C能力提升項目（2019XZZX-GK001）

作者簡介：胡夢藝（1994.01—），女，碩士研究生在讀，研究方向：神經(jīng)康復與認知科學研究，E-mail：562412701@qq.com

通信作者：楊珊莉（1979.09—），女，博士，教授，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合康復學，E-mail：49688400@qq.com