顧楊，劉勛，區(qū)綺云，張娜，李涵，秦偉強(qiáng)，李莉*

膿毒癥是一種常見(jiàn)的危及生命的綜合征，是全球發(fā)病率和死亡率的主要原因。由于治療費(fèi)用的增加，它已經(jīng)成為一個(gè)主要的全球衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，并造成住院時(shí)間及次數(shù)顯著增加［1］?？焖俚卦u(píng)估膿毒癥的嚴(yán)重程度、死亡風(fēng)險(xiǎn)和治療策略的及時(shí)調(diào)整在降低膿毒癥的總體死亡率和成本負(fù)擔(dān)方面將會(huì)發(fā)揮重要作用。膿毒癥的根本發(fā)病環(huán)節(jié)及作用機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，尤其是免疫機(jī)制在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中尤為重要。比如免疫細(xì)胞—T、B 淋巴細(xì)胞凋亡以及骨髓來(lái)源的抑制細(xì)胞（MDSC）是膿毒癥患者免疫抑制發(fā)展的主要貢獻(xiàn)者［2，3］。趨化因子CX3CL1 在膿毒性休克的患者中表達(dá)升高，而其受體CX3CR1 下降的增加則與患者預(yù)后不良直接相關(guān)［4］。除此之外，調(diào)控免疫檢查點(diǎn)在膿毒癥誘導(dǎo)的免疫抑制中亦扮演重要角色，如免疫檢查點(diǎn)蛋白程序性細(xì)胞死亡-1 的表達(dá)增強(qiáng)會(huì)不同程度地造成T 細(xì)胞凋亡、淋巴細(xì)胞減少及白細(xì)胞吞噬能力受損等［5］。因此，免疫細(xì)胞和免疫微環(huán)境在膿毒癥演變進(jìn)程中的作用越來(lái)越受到科學(xué)領(lǐng)域的重視。近年來(lái)，人工智能在預(yù)測(cè)各種疾病預(yù)后的應(yīng)用中越來(lái)越多，并且有研究顯示深度學(xué)習(xí)作為人工智能的一個(gè)子學(xué)科，它能夠利用數(shù)據(jù)和算法來(lái)模擬人類學(xué)習(xí)，并且?guī)椭幚泶罅繑?shù)據(jù)，洞察有意義的信息模式，從而協(xié)助診斷、預(yù)測(cè)和治療膿毒癥［6］。本研究借助深度學(xué)習(xí)開(kāi)發(fā)基于膿毒癥免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度的臨床預(yù)測(cè)模型，希望為提高臨床醫(yī)師評(píng)估膿毒癥患者預(yù)后的能力帶來(lái)新的契機(jī)。

1 材料與方法

1.1 研究設(shè)計(jì)與對(duì)象

本研究從GEO 基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索含有28 天生存狀態(tài)的膿毒癥患者的數(shù)據(jù)集，最終選取前瞻性隊(duì)列研究（MARS 研究，GSE65682）［7］，將患者以9∶1 的比例隨機(jī)分為訓(xùn)練組和驗(yàn)證組，同時(shí)進(jìn)行基因表達(dá)矩陣的數(shù)據(jù)質(zhì)控，使用主成分分析進(jìn)行批次效應(yīng)的去除，以及剔除離群值。本研究遵循TRIPOD 報(bào)告指南開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證模型，已通過(guò)中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院倫理委員會(huì)的倫理批準(zhǔn)（倫理號(hào)為：SYSEC-KY-KS-2020-122）。

1.2 ssGSEA 計(jì)算免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度

我們基于外周血基因表達(dá)量，使用gsvaR 包中的ssGSEA 算法計(jì)算膿毒癥患者個(gè)體外周血免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度［8］。ssGSEA 是基于免疫細(xì)胞的特定基因組，將基因表達(dá)譜轉(zhuǎn)化為膿毒癥個(gè)體患者中免疫細(xì)胞群的浸潤(rùn)豐度，以此得到表達(dá)矩陣，其中列是每個(gè)免疫細(xì)胞的ssGSEA 分?jǐn)?shù)，行是患者ID。將每列的免疫細(xì)胞豐度作為特征變量，聯(lián)合28 d生存狀態(tài)，以及生存時(shí)間作為生存分析模型的輸入層。

1.3 深度生存分析模型

在本研究中，將DeepSurv［9］用于分析患者的28 d 生存率，這是一種可以預(yù)測(cè)個(gè)體生存風(fēng)險(xiǎn)值的深度學(xué)習(xí)算法。采用Python 3.7.11 中的Tensor-Flow 2.2.0 框架搭建深度生存分析環(huán)境，此后在生存分析中使用深度前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型，從而構(gòu)建了膿毒癥的深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)生存模型（sepsis DeepSurv Net，seDNT）。seDNT 模型包含一個(gè)特征輸入層，輸入層節(jié)點(diǎn)數(shù)為預(yù)后影響因素的個(gè)數(shù)；一個(gè)含有2 層多節(jié)點(diǎn)結(jié)構(gòu)的隱藏層，該隱藏層具有完全連接的前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該隱藏層是模型的關(guān)鍵，需要調(diào)節(jié)相關(guān)參數(shù)，關(guān)鍵參數(shù)有學(xué)習(xí)率、學(xué)習(xí)率衰減、激活函數(shù)選擇、正則化及優(yōu)化方法等；模型的最后是使用對(duì)數(shù)風(fēng)險(xiǎn)函數(shù)計(jì)算個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并將該評(píng)分作為一個(gè)單節(jié)點(diǎn)的輸出層。得到輸出層的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分后，根據(jù)受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線計(jì)算最佳截?cái)嘀?，將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的亞組，應(yīng)用Kaplan-Meier 生存分析評(píng)估seDNT 模型預(yù)測(cè)膿毒癥患者14 天、28 天生存的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)，以及ROC 曲線下的面積（area under the ROC curve，AUC）進(jìn)行模型預(yù)測(cè)性能的評(píng)價(jià)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分高低分組，使用R 軟件的limma、ggplot2 包進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析及可視化，使用clusterProfiler 包基于基因本體論（Gene Ontology，GO）及京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia for Genes and Genomes，KEGG）進(jìn)行基因集的功能注釋及通路富集分析，進(jìn)一步了解seDNT 模型內(nèi)在機(jī)制。最后，將免疫檢查點(diǎn)［10］、趨化因子［11］與免疫細(xì)胞、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析，更深層次地增加深度生存模型的可解釋性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；分類數(shù)據(jù)以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 法計(jì)算生存率，組間比較采用log-rank 檢驗(yàn)。在訓(xùn)練隊(duì)列中采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析影響生存的因素，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）及其對(duì)應(yīng)的95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）。采用R 4.1.2 軟件中的survival 包構(gòu)建多因素Cox 回歸模型。本研究以雙側(cè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料及數(shù)據(jù)預(yù)處理

這項(xiàng)研究初步篩選了802 位膿毒血癥患者，每位患者具有24 646 個(gè)核酸探針，預(yù)處理后獲得包含11 503 個(gè)基因的表達(dá)矩陣，對(duì)表達(dá)矩陣進(jìn)行過(guò)濾和樣本聚類以去除批次效應(yīng)，剔除數(shù)據(jù)集中顯著的離群樣本，最終得到符合標(biāo)準(zhǔn)479 例膿毒血癥患者，將其以9：1 的比例隨機(jī)分為訓(xùn)練組和驗(yàn)證組，其中訓(xùn)練組由431 名膿毒血癥患者組成，驗(yàn)證組由48 名膿毒血癥患者組成。

2.2 預(yù)測(cè)模型的開(kāi)發(fā)與評(píng)估

基于431 名膿毒血癥患者，通過(guò)ssGSEA 計(jì)算28 個(gè)免疫細(xì)胞豐度，根據(jù)其免疫細(xì)胞豐度進(jìn)行評(píng)分構(gòu)建seDNT 模型，seDNT 模型最優(yōu)網(wǎng)絡(luò)設(shè)置：輸入層有28個(gè)節(jié)點(diǎn)，隱藏層有兩層（第一隱藏層有32個(gè)節(jié)點(diǎn)，第二隱藏層有16 個(gè)節(jié)點(diǎn)），輸出層有1 個(gè)節(jié)點(diǎn)；學(xué)習(xí)率為0.01，學(xué)習(xí)率衰減為1.0（圖1）。根據(jù)免疫細(xì)胞豐度風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型計(jì)算患者個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并根據(jù)最佳的截?cái)嘀?，將患者分為低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組（101人）與高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組（330人），在訓(xùn)練組中，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（deepscore）與28 天生存期具有良好相關(guān)性，其在預(yù)測(cè)膿毒癥患者14 天和28 天生存期的AUC 分別為0.912 和0.936，其風(fēng)險(xiǎn)比（HR）=0.022，95%CI=0.013～0.038，P＜0.005（圖2），這表明在預(yù)測(cè)膿毒癥患者28 天生存率方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在驗(yàn)證組中，同樣應(yīng)用seDNT 模型計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，發(fā)現(xiàn)deepscore 與28 天生存期相關(guān)（14 天和28 天生存期的AUC 分別為0.822 和0.777），其風(fēng)險(xiǎn)比（HR）=0.07，95%CI=0.008～0.063，P＜0.005（圖3）。

圖1 seDNT 模型框架

圖2 訓(xùn)練組的KM 生存曲線和AUC

圖3 驗(yàn)證組的KM 生存曲線和AUC

同樣基于訓(xùn)練隊(duì)列431 名膿毒血癥患者，將28 個(gè)免疫細(xì)胞做生存分析曲線，根據(jù)單因素及多因素篩選最終選出6 個(gè)免疫細(xì)胞（P＜0.05）（圖4）用于構(gòu)建Cox 回歸模型（圖5）。根據(jù)相應(yīng)的回歸系數(shù)，建立風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程。Cox 模型方程：coxscore=活化樹(shù)突狀細(xì)胞*0.341-未成熟B 細(xì)胞*1.363-巨噬細(xì)胞*0.707+肥大細(xì)胞*0.56-調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞*0.716。

圖4 預(yù)測(cè)膿毒癥患者生存的單變量和多變量Cox 回歸分析的森林圖

圖5 6 個(gè)顯著的免疫細(xì)胞的KM 生存圖

將seDNT 模型和Cox 模型中的deepscore 和coxscore 的28 天生存期計(jì)算AUC，其AUC 分別為0.807 和0.705，深度學(xué)習(xí)算法seDNT 模型的AUC優(yōu)于Cox 比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型（均P＜0.05）（圖6），這表明seDNT 模型在預(yù)測(cè)膿毒血癥患者28 天生存率方面具有良好的靈敏度和特異性，且seDNT 模型優(yōu)于常規(guī)的多因素Cox 模型評(píng)分預(yù)測(cè)患者死亡率及預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)。

圖6 比較seDNT 與COX 比例風(fēng)險(xiǎn)模型在AUC 方面的預(yù)測(cè)性能

2.3 seDNT 模型預(yù)測(cè)參與膿毒血癥的基因表達(dá)差異分析、富集分析、免疫檢查點(diǎn)及其相關(guān)性

本研究根據(jù)免疫細(xì)胞豐度計(jì)算deepscore 從而建立seDNT 模型，其模型可良好預(yù)測(cè)患者膿毒癥28 天生存率，這說(shuō)明了該模型預(yù)測(cè)膿毒癥患者生存與免疫微環(huán)境特征明顯相關(guān)，可進(jìn)一步探討差異表達(dá)基因及其相關(guān)生物標(biāo)志物分子和免疫通路等，以及尋找deepscore 與免疫檢查點(diǎn)及趨化因子相關(guān)性。

故將訓(xùn)練隊(duì)列中431 例膿毒癥患者根據(jù)seDNT模型計(jì)算每位患者的deepscore，并根據(jù)ROC 曲線取最佳截?cái)嘀担瑢⒒颊叻譃閐eepscore 高（102）/低（329）表達(dá)組。從中篩選出455 個(gè)差異基因，包括285 個(gè)上調(diào)基因和170 個(gè)下調(diào)基因。進(jìn)一步采用火山圖對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，其中上調(diào)基因主要有TNFSF12、CALHM2、TGFBI、FBP1、CX3CR1，下調(diào)基因主要有TUBG2、ELL2、TUBG1、TMEM57、BCAM（圖7）。

圖7 訓(xùn)練組中低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)表型之間的DEGs 火山圖

選擇膿毒血癥患者中顯著升高的285 個(gè)差異基因進(jìn)行GO 基因功能注釋，GO 富集分析差異基因的生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP），提示它們的功能可能主要富集在以下幾個(gè)方面：細(xì)胞殺傷、白細(xì)胞的粘附、T 細(xì)胞活化、T 細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)等；細(xì)胞組分（cellular component，CC）變化的差異基因主要富集主要在初級(jí)溶酶體、嗜苯胺藍(lán)粒、特異性顆粒等；分子功能（molecular function，MF）變化的差異基因主要富集于調(diào)節(jié)蛋白激酶活性、MHC 蛋白結(jié)合、激酶調(diào)節(jié)活性等功能上（圖8）。其次通過(guò)對(duì)KEGG 信號(hào)通路的富集分析可顯示：P53 信號(hào)通路、卟啉代謝、氮代謝等（圖9）。基于GO 基因集進(jìn)行GSEA（基因集富集）分析，適應(yīng)性免疫應(yīng)答、細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、免疫應(yīng)答、固有免疫應(yīng)答、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)為GO 富集的主要生物學(xué)功能（圖10）。

圖8 GO 富集分析（生物過(guò)程［BP］，細(xì)胞成分［CC］和分子功能）

圖9 KEGG 基因集富集分析

圖10 GSEA 富集分析顯示免疫通路顯著富集

將訓(xùn)練隊(duì)列中431 例膿毒血癥患者進(jìn)一步尋找免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與免疫檢查點(diǎn)相關(guān)性得到如圖所示（圖11），將免疫檢查點(diǎn)與deepscore 進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)免疫檢查點(diǎn)CD160 與deepscore 相關(guān)性最高，其兩者相關(guān)性曲線相關(guān)系數(shù)r=-0.16（P＜0.05）（圖12），說(shuō)明CD160 與deepscore 呈負(fù)相關(guān)，因此CD160 與活化CD8 T 細(xì)胞水平高的患者總生存期延長(zhǎng)。繼續(xù)尋找趨化因子與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間相關(guān)性如圖所示（圖13），將趨化因子與deepscore 進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)差異基因CX3CR1 與deepscore 相關(guān)性最高，其兩者相關(guān)性曲線相關(guān)系數(shù)r=-0.18（P＜0.05）（圖14），說(shuō)明CX3CR1 與deepscore 呈負(fù)相關(guān)，CX3CR1 與MDSC 高表達(dá)患者28天生存期較長(zhǎng)。

圖11 免疫檢查點(diǎn)與免疫細(xì)胞及deepscore 的相關(guān)性熱圖

圖12 顯示免疫檢查點(diǎn)相關(guān)性排序的棒棒糖圖

圖13 趨化因子與免疫細(xì)胞及deepscore 的相關(guān)性熱圖

圖14 顯示趨化因子相關(guān)性排序的棒棒糖圖

3 討 論

膿毒癥是臨床危重癥患者常見(jiàn)并發(fā)癥之一，與機(jī)體免疫功能及代謝異常有關(guān)，細(xì)胞因子風(fēng)暴被認(rèn)為是引發(fā)膿毒癥炎癥的原因，常常識(shí)別和誘導(dǎo)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，激活這些多種信號(hào)通路最終導(dǎo)致幾種常見(jiàn)的基因表達(dá)，這些基因涉及炎癥、適應(yīng)性免疫和細(xì)胞代謝等［10］。與此同時(shí)，各種黏附分子和趨化因子隔離以及激活中性粒細(xì)胞進(jìn)入靶器官，可進(jìn)一步加重炎癥和炎性損傷。因此可以基于膿毒癥相關(guān)基因、信號(hào)通路、免疫細(xì)胞、免疫檢查點(diǎn)及趨化因子等進(jìn)行生存預(yù)測(cè)。本研究基于深度學(xué)習(xí)算法DeepSurv 根據(jù)免疫細(xì)胞豐度建立了可預(yù)測(cè)膿毒血癥患者生存預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型。無(wú)論是在訓(xùn)練隊(duì)列還是在驗(yàn)證隊(duì)列中，seDENT 預(yù)測(cè)膿毒癥患者28 天生存率方面具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同時(shí)其模型具有良好的靈敏度及特異性。

膿毒癥一直是臨床所面臨的一個(gè)重要問(wèn)題，早期識(shí)別、及時(shí)治療對(duì)膿毒癥意義重大，目前有許多膿毒癥相關(guān)生存預(yù)測(cè)模型，如基于調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞中單個(gè)免疫檢查點(diǎn)PD-1 的過(guò)度表達(dá)可以預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后，其驗(yàn)證膿毒癥患者28天死亡率能力（AUC=0.792）［12］，其預(yù)測(cè)能力仍比我們建立seDNT模型預(yù)測(cè)能力低，這表明膿毒癥其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尤其是免疫機(jī)制，我們采用檢測(cè)多個(gè)免疫細(xì)胞豐度，并且驗(yàn)證膿毒癥是多個(gè)免疫細(xì)胞、免疫檢查點(diǎn)及差異基因共同參與。而并非單獨(dú)一個(gè)指標(biāo)所涵蓋，這也表明我們seDNT模型更具有全面性和準(zhǔn)確性。

膿毒癥其特征是同時(shí)出現(xiàn)的過(guò)度炎癥與免疫抑制之間發(fā)生不平衡。與過(guò)度炎癥有關(guān)的不同細(xì)胞類型和中介網(wǎng)絡(luò)中包括白細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞）、內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞因子、補(bǔ)體產(chǎn)物等。其免疫抑制涉及不同的細(xì)胞類型和特征，與免疫細(xì)胞凋亡增強(qiáng)、T 細(xì)胞衰竭、通過(guò)表觀遺傳學(xué)改變細(xì)胞重編程以及活化細(xì)胞表面分子表達(dá)減少有關(guān)。細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞中［5］。最近的研究表明，調(diào)控免疫檢查點(diǎn)在膿毒癥誘導(dǎo)的免疫抑制中起重要作用，其中CD160 主要表達(dá)在NK 細(xì)胞、T 細(xì)胞以及腸內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，尤其是在具有高殺傷活性的NK 細(xì)胞中高表達(dá)，其中包括NKT 細(xì)胞、CD8+CD28 調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞等［13］。

除此之外，還有一些文獻(xiàn)暗示其他檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)因子在免疫抑制中的作用，如T 細(xì)胞上表達(dá)結(jié)合B 細(xì)胞活化抗原B7-2（CD86）的檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)因子等［14］。當(dāng)膿毒癥患者發(fā)生過(guò)度炎癥，趨化因子將會(huì)與其受體結(jié)合，趨化白細(xì)胞至炎癥部位，在炎癥過(guò)程中發(fā)揮中心作用。當(dāng)細(xì)胞因子和趨化因子的暴發(fā)性釋放引起的廣泛炎癥時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致器官損傷。有研究表明，趨化因子CX3CR1 可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎性因子釋放以及免疫功能紊亂參與膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的病理生理過(guò)程［15-17］。

本研究仍存在一定的局限性，應(yīng)用深度學(xué)習(xí)算法DeepSurv 構(gòu)建生存預(yù)測(cè)模型，但并未進(jìn)行外部隊(duì)列驗(yàn)證，后續(xù)可增加外部隊(duì)列驗(yàn)證對(duì)以上模型進(jìn)行獨(dú)立的分析以評(píng)估其準(zhǔn)確性，并且檢驗(yàn)其模型在當(dāng)前實(shí)踐中具有有效性，此外，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證本文所探討與膿毒癥相關(guān)基因、信號(hào)通路、免疫細(xì)胞、免疫檢查點(diǎn)及趨化因子等相關(guān)作用及其聯(lián)系。

綜上所述，本研究基于深度學(xué)習(xí)算法DeepSurv建立可預(yù)測(cè)膿毒癥患者生存預(yù)后的seDNT 模型，預(yù)測(cè)變量根據(jù)免疫細(xì)胞豐度較Cox 預(yù)測(cè)模型可以更好地預(yù)測(cè)膿毒血癥患者28 天生存率?？梢栽缙谠\斷、積極識(shí)別其嚴(yán)重程度，以便于臨床醫(yī)師及早干預(yù)，這對(duì)膿毒癥患者的生存預(yù)后有著重大意義。同時(shí)也證明了深度學(xué)習(xí)算法可以提供一種新穎的預(yù)測(cè)模型，通過(guò)預(yù)測(cè)模型能更快速、更好地幫助臨床醫(yī)師作出治療決策。