欒艷超 梁超 韓青松 劉佳坤 楊立偉 李志峰

肺腺癌作為肺癌最常見亞型，其發(fā)病率逐年上升，死亡率高[1]，因肺癌早期無特有的臨床表現(xiàn)，導(dǎo)致大多患者確診時已出現(xiàn)局部及遠處轉(zhuǎn)移，無法手術(shù)治療[2]。目前，隨著生物治療及免疫治療的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，打破了肺癌以微創(chuàng)外科手術(shù)、放、化療為主的傳統(tǒng)治療方式，進而使得肺癌患者的生存期逐漸延長[3]；而早期肺腺癌患者如及時手術(shù)治療，可極大降低術(shù)后復(fù)發(fā)率及死亡率[4]。為此，我們亟需尋求可靠的用于早期診斷以及治療的靶標分子。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細胞、乳房癌、胃癌中均檢測到SPP1異常高表達與臨床分期及預(yù)后有關(guān)[5-6]。本研究將生物信息學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合，探討SPP1在肺腺癌中的表達及其與臨床表現(xiàn)及預(yù)后的關(guān)系; 旨在臨床上為LUAD診治及預(yù)后提供新的參考。

資料與方法

一、標本來源

本研究選取138例肺腺癌患者癌組織和癌旁組織標本，所有患者均于2014年12月至2015年12月期間我院行肺腺癌手術(shù)切除。入組標準：男性54.3%(75/138)例，女性45.7%(63/138)例，年齡35歲至88歲之間，根據(jù)國際第八版肺癌TNM 分期標準，將患者分為Ⅰ+Ⅱ期83例，Ⅲ+Ⅳ期55例(T1/2期101例、T3/4期37例，N0 期68例，N1/2 期70例，M0 期133例、M1期5例)，病理分級Ⅰ/Ⅱ 級82例、Ⅲ級56例，患者術(shù)前均未給予放、化療及其他生物治療，截止隨訪2019年12月，并已獲我院倫理委員會批準(編號：2021071)。通過門診復(fù)查、電話回訪等方式隨訪，記錄病情、病史詢問、腫瘤標志物檢驗、胸部CT等檢查，術(shù)后復(fù)發(fā)及死亡時間。

二、材料

基因擴增儀Eppendorf，熒光定量PCR儀:Mx3000p，RT Fiest Strand cDNA Synthesis Kit(Servicebio，G3330-100)，2 X SYBR Green qPCR Master Mix(low Rox)，Servicebio，G3321-01;引物購自上海生工生物。SP試劑盒(上?？菩郎?; DAB試劑盒(河北博海生物);一抗:SPP1多克隆抗體(河北博海生物)，濃度1 ∶200;生物素化通用二抗工作液;蘇木素染料(上海恒遠生物);辣根酶標記鏈酶卵白素工作液(蘇州宇恒生物)等。

三、利用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析SPP1表達與臨床關(guān)系

通過UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)行 TCGA Gene Analysis，檢索SPP1，選擇肺腺癌，檢出結(jié)果中運用泛癌表達分析(pan-cancer view)[7]。通過基于TCGA(The Cancer Genome Atlas)所搭建的數(shù)據(jù)可視化平臺UALCAN，在UALCAN 數(shù)據(jù)庫中進行TCGA 及CPTAC(Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium)數(shù)據(jù)集中檢索SPP1，于數(shù)據(jù)庫選項中選擇肺腺癌。分別對年齡、性別、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征分組及預(yù)后情況進行分析。

四、運用GEPIA、KM Plotter數(shù)據(jù)庫研究SPP1表達與預(yù)后關(guān)系

利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)進行SPP1的表達與肺腺癌患者生存關(guān)系的分析。GEPIA數(shù)據(jù)庫是用于分析來自TCGA (The Cancer Genome Atlas)和GTEx (Genotype-Tissue Expression)項目的RNA測序表達數(shù)據(jù)[8]。通過分析KM Plotter數(shù)據(jù)庫中SPP1肺腺癌樣本表達，使用Survival選項，繪制樣本表達與生存時間關(guān)系的Kaplan-Meier曲線，包括總生存率(overall survival，OS)[9]。

五、RT-qPCR檢測SPP1表達

通過TRIzol法提取細胞總RNA，分光光度計測定RNA濃度和純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA合成cDNA，采用PrimeScript RT Enzyme Mix I進行RT反應(yīng)。反應(yīng)條件:1個循環(huán)的95℃、5 min;40個循環(huán)的95℃、10s 和60℃、30s，以GAPDH為內(nèi)參.通過2-ΔΔCt方法表達SPP1相對表達量。獲得SPP1基因擴增和溶解曲線(圖1)。

圖1 SPP1基因擴增曲線圖(左)和溶解曲線圖(右)

六、Western blotting檢測SPP1蛋白表達

加入蛋白裂解液分離總蛋白， BCA法定量蛋白;經(jīng)變性后行SDS-PAGE電泳，250mA恒定電流，轉(zhuǎn)膜90min;PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1h，一抗(稀釋度為1 ∶1000)，4℃孵育過夜;經(jīng)TBST漂洗10min，重復(fù)3次;浸入二抗工作液(稀釋度為1 ∶5000)，37 ℃孵育1 h，再次TBST漂洗;滴入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，行ECL檢測并拍照; 采用Image J 分析條帶灰度值。

七、免疫組織化學(xué)

石蠟切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、滲透、封閉等操作后，給予一抗(SPPI抗體1 ∶200)過夜，給予生物素化通用二抗工作液;，加入辣根酶標記鏈酶卵白素工作液DAB染色，蘇木素復(fù)染，脫水封片。鏡下拍攝， Image-J軟件分析，棕色、褐色、黃色顆粒為(+)，無染色為(-)，隨機選取5個視野，計算平均吸光度。

八、統(tǒng)計分析

采用SPSS 23進行統(tǒng)計分析，以Graphpad Prism9.0作圖，運用Image J分析免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。采用Kaplan-Meier和Cox回歸進行生存分析，采用t檢驗進行兩組定量資料的比較，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、SPP1在肺腺癌組織中高表達

我們前期利用UALCAN數(shù)據(jù)庫全面分析SPP1在人類常見惡性腫瘤中的表達，分析發(fā)現(xiàn)包括肺腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤組織中SPP1 mRNA表達明顯高于癌旁組織，并且可能發(fā)揮致癌基因的作用(圖2)。通過挖掘GEPIA數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫同樣驗證SPP1在肺腺癌組織中表達顯著高于肺正常組織(圖3，P<0.001)。

圖2 不同腫瘤組織中SPP1的表達水平

圖3 SPP1在肺腺癌與正常組織表達差異 A: GEPIA; B: UALCAN

二、GEPIA數(shù)據(jù)庫分析LUAD中SPP1 mRNA表達與預(yù)后關(guān)系

為了深入分析SPP1表達與LUAD患者預(yù)后關(guān)系，我們首先通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析SPP1 mRNA表達與LUAD患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn) SPP1 mRNA高表達與更差的OS(P=0.016，圖4A)顯著相關(guān)，初步提示SPP1 mRNA高表達與預(yù)后不良有關(guān)。鑒于GEPIA中LUAD患者病例數(shù)有限，我們利用Kaplan -Meier Plotter數(shù)據(jù)庫對SPP1 mRNA表達與預(yù)后關(guān)系的進行了驗證，同樣發(fā)現(xiàn)SPP1 mRNA高表達的LUAD患者，其OS明顯縮短(P=5.2e-06，圖4B)，進一步證實SPP1 mRNA高表達與不良預(yù)后密切相關(guān)。

圖4 GEPIA和K-M數(shù)據(jù)庫檢測SPP1的表達對患者生存率的影響 A: GEPIA; B: K-M

三、UALCAN數(shù)據(jù)庫分析LUAD中SPP1表達與臨床特征關(guān)系

接下來，利用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析了LUAD (515例)中SPP1的表達與臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SPP1 mRNA的表達與LUAD患者的N分期(P<0.001，圖5D)顯著相關(guān)，且隨著N分期的增高SPP1的表達水平有著上升的趨勢，與TNM分期、年齡、性別無顯著相關(guān)性。利用CPTAC數(shù)據(jù)庫進一步分析SPP1蛋白表達與臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，SPP1蛋白表達在肺腺癌中顯著升高，且與LUAD患者的TNM分期(P<0.001，圖6B)、N分期(P<0.001，圖6D)顯著相關(guān)，且隨著TNM分期、N分期的增高 SPP1的表達水平有著上升的趨勢，但與年齡、性別無顯著相關(guān)性。

圖5 UALCAN數(shù)據(jù)庫中SPP1 mRNA 與臨床特征關(guān)系 (1)P<0.001

圖6 CPTAC 數(shù)據(jù)庫中SPP1 蛋白表達與臨床特征關(guān)系 (1)P<0.001

四、肺腺癌組織中SPP1高表達

我們?yōu)榱诉M一步驗證肺腺癌組織中SPP1的表達情況，采用(RT-qPCR)檢測肺腺癌組織和對應(yīng)癌旁組織，結(jié)果顯示，癌組織中SPP1 mRNA表達水平顯著高于對應(yīng)癌旁組織，(n=39，P<0.001，圖7A)。然后采用western blot檢測10例肺腺癌組織和對應(yīng)癌旁組織，結(jié)果顯示，肺腺癌組織中SPP1蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.0149，圖7B、C)。運用免疫組化檢測138例肺腺癌石蠟切片中SPP1蛋白表達情況，結(jié)果顯示，SPP1蛋白在LUAD組織中表達顯著上調(diào)(P<0.001，圖8A)，SPP1定位于胞漿或核，(圖8C)。為了排除不同患者之間個體差異的影響，進一步分析69例配對肺腺癌組織與正常肺組織的免疫組化結(jié)果，同樣顯示肺腺癌組織中SPP1蛋白顯著高表達(P<0.001，圖8B)。

圖7 肺腺癌和正常肺組織中SPP1表達

圖8 免疫組化檢測SPP1蛋白在肺腺癌組織和正常肺組織中的表達

五、肺腺癌組織中SPP1表達與臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)分析

我們又對SPP1蛋白表達與肺腺癌患者臨床數(shù)據(jù)進行分析，以免疫組化評分中位數(shù)分為SPP1高表達組(n=69)和低表達組(n=69)，結(jié)果顯示在T3/4組(P=0.003)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P=0.041)、Ⅲ/Ⅳ期(P=0.023)與死亡(P=0.003)組患者的腫瘤組織中SPP1蛋白表達顯著上調(diào)(表1)。SPP1蛋白表達與腫瘤遠處轉(zhuǎn)移未見明顯統(tǒng)計學(xué)意義，考慮入組數(shù)較少(n=5)有關(guān)。

表1 肺腺癌中SPP1蛋白表達和臨床病理參數(shù)關(guān)系

六、肺腺癌組織中SPP1表達與患者預(yù)后

最后我們通過免疫組化結(jié)果，分析SPP1蛋白表達對患者總體生存時間(OS)的影響，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，高表達組中位生存時30個月，而低表達組中位生存時間52個月。K-M生存曲線表明，肺腺癌患者中SPP1高表達組OS顯著降低(P=0.0017，圖9)。為了進一步分析SPP1蛋白高表達與患者預(yù)后影響因素，我們通過單因素Cox分析顯示LUAD患者預(yù)后的影響因素為SPP1蛋白表達(P<0.001)、TNM分期(P<0.001)和M分期(P<0.001)。多因素Cox分析顯示LUAD患者預(yù)后獨立影響因素為SPP1蛋白表達(P<0.001)、TNM分期(P=0.034)和M分期(P=0.001)(表2)。

圖9 SPP1蛋白高表達與肺腺癌不良預(yù)后相關(guān)

表2 138例的肺腺癌患者總體生存期單因素與多因素Cox 回歸分析

討 論

肺腺癌因其局部侵襲、遠處轉(zhuǎn)移及耐藥等諸多原因，導(dǎo)致肺癌的治療效果仍不理想[10]。2019年美國有22.8萬人被診斷為肺癌，而死亡人數(shù)約16萬人[11]，數(shù)據(jù)表明，肺癌具有發(fā)病率高、死亡率高、預(yù)后差的特性，因此，探明肺癌發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移的機制仍然是目前肺癌研究的重點及難點[12]。如今隨著生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等諸多技術(shù)突破，分子靶向治療、免疫抑制劑治療的手段已廣泛應(yīng)用于臨床，但仍未明顯降低肺癌患者的死亡率[13]。

SPP1基因是一種分泌型磷酸化糖蛋白，在多種腫瘤中高表達[14]。它屬于小整合素結(jié)合配體N型糖蛋白(SIBLING)家族，其在淋巴細胞、內(nèi)皮細胞、骨細胞及多種惡性腫瘤細胞中高表達[15]。并且分為兩個功能序列，分別為N端RGD序列以及C端非RGD序列。在腫瘤組織中，細胞外基質(zhì)被各種通路分泌的uPA、MMP等影響，進而對腫瘤的侵襲和遷移影響;C端非RGD結(jié)合CD44，促進信號通路激活[16]，進而可以導(dǎo)致免疫逃逸[17]。近年越來越多研究報道，SPP1參與多種惡性腫瘤的發(fā)生過程，如肝癌、胰腺癌、甲狀腺癌、乳腺癌的生長，侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。SPP1促進肝癌細胞增長并與肺腺癌的不良預(yù)后有關(guān)，且SPP1可促進肝癌的增殖和侵襲[19]。研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌細胞和組織中SPPI表達上調(diào)，下調(diào)SPPI抑制HeLa細胞的生長，并可誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡[20]。

但SPPI在肺腺癌的相關(guān)研究未見報道，我們前期利用UALCAN數(shù)據(jù)庫全面分析SPP1在人類常見惡性腫瘤中的表達，分析顯示多種惡性腫瘤組織中SPP1 mRNA表達顯著高于癌旁組織，進一步挖掘GEPIA數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫同樣驗證在肺腺癌組織中SPP1表達顯著高于肺正常組織。為了深入了解SPP1的表達與患者預(yù)后之間的關(guān)系，我們通過GEPIA數(shù)據(jù)庫挖掘SPP1 mRNA表達與肺腺癌患者預(yù)后關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SPP1 mRNA高表達與更差的OS顯著相關(guān)，鑒于GEPIA中LUAD患者病例數(shù)有限，我們又對Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中SPP1 mRNA表達與預(yù)后關(guān)系的進行驗證，得到相似結(jié)果，從而進一步證實SPP1 mRNA高表達與肺腺癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)。

為了驗證數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果，我們從分子水平分析SPP1的表達情況，采用qPCR、western blot 和免疫組化方法檢測SPP1的表達水平。結(jié)果表明，在mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平，均顯示肺腺癌中SPP1表達上調(diào)。以上分析表明在肺腺癌中SPP1可能起到致癌作用。又對臨床資料分析可見， SPP1表達與臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存狀況顯著相關(guān)。因多數(shù)發(fā)生腫瘤遠處轉(zhuǎn)移患者已無法通過手術(shù)治療，導(dǎo)致遠處轉(zhuǎn)移病例數(shù)偏少，可能導(dǎo)致研究結(jié)果與實際產(chǎn)生偏倚。本研究收集138例肺腺癌組織標本進行免疫組化檢測，進而從蛋白水平探討SPP1在LUAD中的表達與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SPP1蛋白高表達與LUAD患者的OS縮短密切相關(guān)，此結(jié)果與GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果一致。Cox單因素和多因素回歸分析表明， SPP1蛋白表達、臨床分期和遠處轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的獨立危險因素。

以上實驗結(jié)果提示， SPP1在肺腺癌組織中呈高表達并可在一定程度上預(yù)測肺腺癌患者的不良預(yù)后。以上結(jié)果為肺腺癌患者在早期診治、臨床預(yù)后等多領(lǐng)域提供重要參考。但本研究僅從分子、蛋白水平對肺腺癌患者SPP1表達與預(yù)后分析，因而SPP1的表達與腫瘤的分子機制的研究將作為我們的后續(xù)研究方向。