杜歌 劉自雙 魏莉 劉芳芳 陳子浩

肺癌是發(fā)病率及死亡率較高的惡性腫瘤[1], 因大多數(shù)患者就診時已處于中晚期，肺癌的預(yù)后不佳[2]。肺癌的早期診斷方法包括影像學(xué)檢查、生物標(biāo)記物檢測、支氣管鏡檢查術(shù)等。其中，生物標(biāo)記物檢測因便捷、無創(chuàng)性等特點成為臨床上常用的檢測手段，高敏感度及特異度的生物標(biāo)記物對提高早期肺癌診斷率、降低死亡率是十分必要的。

S100蛋白家族是鈣結(jié)合蛋白中較大的一個亞家族，包含25個已知成員，其中多個成員在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤中異常表達(dá)[3]。S100A2作為S100蛋白家族中特殊的一員，在腫瘤中的作用存在爭議[4]。1992年，學(xué)者首次報道該蛋白在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，認(rèn)為其可能為抑癌因子。然而，隨后又出現(xiàn)了許多與之相反的觀點[5]，S100A2在腫瘤中的具體作用也尚未明確。本研究擬從細(xì)胞水平證實S100A2與肺癌關(guān)系，評價其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，期望為其日后作為診斷工具應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。

資料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

實驗選用肺癌細(xì)胞Calu-6，該細(xì)胞株采購于中國科學(xué)研究院，使用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2，37℃。細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后，培養(yǎng)1～2周，調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)后進(jìn)行實驗。

二、構(gòu)建過表達(dá)S100A2的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株

構(gòu)建pcDNA3.1-S100A2過表達(dá)質(zhì)粒：S100A2源于人基因，基因信息參考網(wǎng)站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6273。用pcDNA-S100A2聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法制備PLVX-AcGFP1-N1-S100A2。引物設(shè)計如下：正向引物為5-CCCAAGCTTACCATGTGCAGTTCTCTGGAGCAG-3′，反向引物為5′-GACGGGTCTGGCTGGGCCTTAAGGC-3′。(2)慢病毒包裝：分別將目的基因質(zhì)粒和輔助質(zhì)?；旌虾螅D(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，采用 Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染體系。轉(zhuǎn)染后 48h 收獲富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，1500rpm 離心 5min，0.45μm 濾膜過濾，收取病毒。(3)慢病毒載體感染肺癌細(xì)胞：將細(xì)胞接種到 6 孔板中，次日將1μl 8 mg/mL 的聚凝胺加入1mL慢病毒中，再加入1mL無血清的培養(yǎng)基。吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，加入含慢病毒顆粒的培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置4h后，換成完全培養(yǎng)基。于感染后48h，加入含50 mg/mL G-418的完全培養(yǎng)基，篩選穩(wěn)定感染的細(xì)胞株，設(shè)定為Calu-/S00A2實驗組。同時，將肺癌細(xì)胞株及慢病毒作為空載體感染后的肺癌細(xì)胞株分別設(shè)定為Cal-6/空細(xì)胞對照組及Calu-6/空載體對照組。感染48h后熒光顯微鏡下觀察感染效率。收集細(xì)胞樣本進(jìn)行QPCR和Western blot方法檢測 S100A2表達(dá)，驗證過表達(dá)效果。

RNA提取和QPCR：使用TRIzol試劑進(jìn)行細(xì)胞裂解，離心收集上清液，然后在上清液中依次加入氯仿、2-丙醇和75%乙醇，分離RNA，使用Nanodrop 2000檢測RNA的濃度和純度。使用RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，參照說明書執(zhí)行所有步驟。PCR的具體步驟和條件為：孵育(95℃、5min)、變性(94℃、30s共44周)、退火(55℃、30s)、延伸(72℃、30s)。此外，PCR中使用的引物信息如下：S100A2正向引物(5′-GCCAAGAGGGCGACAAGTT-3′)和S100A2反向引物(5′-AGGAAAACAGCATACTCCTGGA-3′)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，內(nèi)源性對照)正向引物(5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′)和GAPDH反向引物(5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′)。

Western-blot：篩選穩(wěn)定感染的細(xì)胞株，48h后熒光顯微鏡下觀察感染效率，確定感染成功后，收集細(xì)胞，使用總蛋白提取試劑盒進(jìn)一步獲取細(xì)胞裂解物，裂解物在14000rpm下離心10分鐘，添加上樣緩沖液后在95℃下加熱5分鐘，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺分離后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。使用5%脫脂奶粉，室溫封閉2h，后加入S100A2一抗(稀釋度1/500)，4℃孵育過夜。同時，將小鼠GAPDH抗體作為內(nèi)源性對照。隨后沖洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記聚合物的二抗(1/5000稀釋液)，再次沖洗，然后使用增強化學(xué)發(fā)光法觀察成像。

三、MTT增殖曲線測定

取處于對數(shù)生長期的Cal-6空細(xì)胞對照組，Calu-6/空載體對照組，Calu-6/S00A2實驗組細(xì)胞分別離心制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至5～10×104/mL。將細(xì)胞懸液制備好后，輕輕混勻，吸取100μl細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，用無菌PBS填充邊緣孔。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中，分別在培養(yǎng)12h，24h，48h，72h，96h時間點取出酶標(biāo)儀測定吸光度。吸棄上清，加入90μl新鮮培養(yǎng)液，再加入10μl MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸掉上清，每孔加入100μlFormazan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值。

四、Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲

包被基底膜：50 mg/L Matrigel 1.8稀釋液80μL包被Transwell小室底膜的上室面，4℃晾干。水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50μl含10g/L牛血清白蛋白(BSA)的培養(yǎng)液，37℃，30min。制備細(xì)胞懸液：取三組對數(shù)期生長的細(xì)胞，0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，800rpm離心5min，棄上清液，用無血清DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×106個/mL。加樣：取細(xì)胞懸液200μl加入Transwell上小室，24孔板下室加入600μl含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。細(xì)胞計數(shù)：常規(guī)培養(yǎng)48h后，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，75%預(yù)冷的酒精固定30min，再用0.1%結(jié)晶紫染色10min。置顯微鏡下觀察，拍照并計數(shù)。

五、流式細(xì)胞術(shù)

取三組對數(shù)期生長的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液(步驟同前)，調(diào)整其細(xì)胞濃度為3×105/mL。制備好細(xì)胞懸液后，將其輕輕混勻，吸取2000μl接種于6孔板，將6孔板置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后進(jìn)行流式檢測。將3組細(xì)胞分組處理后4℃、1000rpm離心5min，去除上清，加入5 mL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心棄去上清，重復(fù)兩次，最后重懸細(xì)胞于0.5 mL PBS中。吸棄PBS，加入100μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。然后加入10μl的PI和5uL的Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻。室溫避光反應(yīng)15min。加入400μl 1×Binding Buffer，混勻后置于冰上，在1小時內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

在流式細(xì)胞檢測細(xì)胞周期檢測過程中，重懸于0.5 mL PBS中的細(xì)胞用低速振蕩器邊震動邊加入5 mL預(yù)冷的75%乙醇中4℃過夜固定，次日將固定好的細(xì)胞離心5分鐘(4℃、1000rpm)，棄去上清，用PBS洗滌一次，用0.4mL PBS重懸細(xì)胞。然后加入100μl RNaseA溶液處理，重新懸浮，在37℃的水中浸泡30分鐘。在400μl PI染色液存在下，將細(xì)胞沉淀在黑暗中4℃培養(yǎng)30分鐘，然后在488nm的波長下用流式細(xì)胞儀分析混合物。使用Cell Quest和MidFit軟件來確定細(xì)胞周期，主要包括G1、S、G2三個階段。

六、數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)， GraphPad-Prism 7.0制作曲線圖、柱狀圖，每組細(xì)胞均設(shè)有兩組重復(fù)對照組，最后所得數(shù)據(jù)為三組表達(dá)水平的平均值，柱狀圖中數(shù)值顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。需要指出的是，在繪制增殖折線時，因每組與重復(fù)組吸光值相差值太小，故GraphPad-Prism 7.0制作出的折線圖中未顯示標(biāo)準(zhǔn)誤。使單因素方差分析比較符合正態(tài)分布的三組數(shù)據(jù)差異，使用秩和檢驗分析不符合正態(tài)分布的三組數(shù)據(jù)差異，MTT實驗數(shù)據(jù)及細(xì)胞周期中比較各組差異采用雙因素方差分析，定義P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、實驗組及對照組S100A2 mRNA和蛋白表達(dá)情況

感染48小時后，使用熒光顯微鏡、RT-PCR和Western blot方法確認(rèn)感染是否成功。(圖1)中1a和1b所示，與對照組相比，感染后Calu-6/S100A2實驗組S100A2 mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高。同時，熒光顯微鏡下可見感染S100A2過表達(dá)慢病毒載體后Calu-6細(xì)胞株綠色熒光強度變?nèi)?，也提示感染成?見圖1C)。

圖1 S100A2在三組細(xì)胞中mRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)及熒光對比圖(C)(×200)

二、S100A2促進(jìn)細(xì)胞增殖及遷移能力

MTT實驗結(jié)果顯示(圖2)：與兩組對照組相比，Calu-6/S100A2實驗組細(xì)胞在12h，24h，48h，72h，96h吸光值均高(P<0.05)。在檢測細(xì)胞遷移能力的實驗結(jié)果中(圖3)，Calu-6/S100A2實驗組細(xì)胞數(shù)量平均為412.6±11.26，明顯高于Calu-6空細(xì)胞對照組 (209.8±5.16)和Calu-6/空載體對照組(231.0±8.86)(P<0.05)。

圖2 各組細(xì)胞增殖能力對比圖

圖3 各組遷移能力差異圖

三、S100A2促進(jìn)細(xì)胞侵襲能力

在檢測細(xì)胞侵襲能力的實驗結(jié)果中(圖4)，Calu-6/S100A2實驗組細(xì)胞數(shù)量平均為(485.3±10.68)，高于Calu-6空細(xì)胞對照組 (236.7±4.91)和Calu-6/空載體對照組(228.0±7.94)(P<0.05)，提示實驗組細(xì)胞侵襲能力增強。

圖4 各組侵襲能力差異圖

四、S100A2抑制Calu-6細(xì)胞株凋亡、影響細(xì)胞周期

(圖5)顯示了各組細(xì)胞凋亡百分比，Calu-6/S100A2實驗組細(xì)胞凋亡的平均比例為(6.32±0.02)%，低于Calu-6空細(xì)胞對照組(8.86±0.41)%和Calu-6/空載體對照組(8.01±0.07)% (P<0.05)。(圖6)展現(xiàn)了各組細(xì)胞周期的變化，與對照組相比，Calu-6/S100A2組細(xì)胞處在G1期的比例相對較低，處于S期的細(xì)胞百分率較高，說明S100A2可促進(jìn)Calu-6肺癌細(xì)胞株從G1期向S期轉(zhuǎn)變。更具體地說，三組細(xì)胞中處于G1期的細(xì)胞比例分別為(57.08±0.54)% (Calu-6空細(xì)胞組)，(58.96±0.16)% (Calu/neo空載體組)和(39.66±0.58)% (Calu-6/S100A2組)。三組處于S期的細(xì)胞比例分別為(22.58±0.81)% (Calu-6空細(xì)胞對照組), (23.79±2.12)% (Calu-6/空載體對照組)和 (36.69±0.67)% (Calu-6/S100A2實驗組)，P<0.05。

圖5 各組細(xì)胞凋亡能力對比圖

圖6 各組細(xì)胞周期變化對比圖

討 論

在本研究中，我們構(gòu)建了S100A2表達(dá)慢病毒載體，并將其感染Calu-6細(xì)胞，進(jìn)一步探討了S100A2在肺癌細(xì)胞系中的作用。通過比較Cal-6/空細(xì)胞對照組，Calu-6/空載體對照組，Calu-/S00A2實驗組的細(xì)胞生物學(xué)行為，證實S100A2的高表達(dá)與細(xì)胞高增殖、侵襲、遷移及凋亡之間相關(guān)，S100A2在細(xì)胞水平上促進(jìn)肺癌的發(fā)生、發(fā)展。

近年來，S100蛋白家族因在多種腫瘤中表達(dá)異常，受到越來越多的關(guān)注，研究證實該家族中很多成員可與Ca2+結(jié)合并激活Ca2+介導(dǎo)的信號通路進(jìn)一步參與多種細(xì)胞活動，如細(xì)胞分裂、侵襲等。S100A2是S100蛋白中重要且有特殊作用的一員，其含99個氨基酸的蛋白，位于易發(fā)生重排的染色體1q21上。既往研究證實，S100A2在不同種類的腫瘤中均有異常表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為。S100A2的特殊性在于其在不同腫瘤中有不同作用，且在同一腫瘤中有不同表達(dá)。例如，S100A2最初由Lee等人發(fā)現(xiàn)在正常乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，而在乳腺腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下降，且在腫瘤細(xì)胞暴露于DNA甲基化抑制劑后，該蛋白被重新激活表達(dá)，故Lee等學(xué)者認(rèn)為S100A2可能與S100蛋白家族中大多數(shù)成員不同，可能在惡性腫瘤中起抑癌作用[6]。然而，在接下來的幾十年中，關(guān)于S100A2與癌癥的研究越來越多，相互矛盾的發(fā)現(xiàn)也不斷涌現(xiàn)。例如，在胃癌中，研究人員發(fā)現(xiàn)Western-blot分析驗證S100A2表達(dá)降低，且這種低表達(dá)水平與腫瘤低分化、高侵襲及高遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率有關(guān)[7]。在膽管癌中的研究表明，S100A2和S100A4、S100A6和S100P等其他S100蛋白家族一樣，在瘤變的膽管上皮細(xì)胞中及肝門膽管癌癌細(xì)胞中表達(dá)升高[8]。故S100A2在腫瘤中所起的具體作用尚無統(tǒng)一結(jié)論。

在肺癌中，關(guān)于S100A2表達(dá)和具體作用機制也有一些不一致的研究成果出現(xiàn)。最早的研究在2001年，研究人員利用cDNA陣列篩選正常支氣管上皮細(xì)胞(NHBE)和腫瘤細(xì)胞系1170-I，結(jié)果顯示S100A2編碼核鈣結(jié)合蛋白在1170-I中表達(dá)下降，S100A2 mRNA和編碼蛋白均下調(diào)，在75%～83%的肺正常組織和增生組織中S100A2均可被檢測到，但在腺癌及鱗癌標(biāo)本中檢測陽性率不足10%[9]，提示S100A2在肺癌中可能扮演一個抑癌的角色[10]。然而，很快，相反的研究結(jié)論就出現(xiàn)了。Wang等人對113例I 期非小細(xì)胞肺癌組織的免疫組化的研究表明，S100A2在肺癌組織中表達(dá)升高，且高表達(dá)S100A2的患者預(yù)后差。Heighway等學(xué)者利用一組cDNA微陣列進(jìn)行雙通道基因表達(dá)分析，它們的微陣列、RT-PCR、Western-blot和免疫組化數(shù)據(jù)均表明S100A2在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)[11]。這些觀點還得到了許多后續(xù)研究的支持，其中一些研究還發(fā)現(xiàn)S100A2與肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)。

關(guān)于S100A2具體的作用機制，S100A2被證實可通過p53蛋白和TGF-β誘導(dǎo)的MAPK信號通路參與TGF-β介導(dǎo)的細(xì)胞遷移和侵襲。同時，S100A2還可促進(jìn)TGF-β/Smad3靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步促進(jìn)該通路介導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展[12]。在前人的研究基礎(chǔ)上，有的學(xué)者提出S100A2在肺癌中可能起雙重作用，即在肺癌早期階段中起到促癌作用，表達(dá)升高，但隨著腫瘤進(jìn)展，可能表達(dá)有所下降[13]，該蛋白在肺癌中的確切作用及具體機制有待于進(jìn)一步研究。我們的研究結(jié)果與Heighway等學(xué)者所持觀點一致，即S100A2有促癌作用，未來我們也將使用多種細(xì)胞株、多水平進(jìn)一步證實S100A2與肺癌的關(guān)系。

我們此次的研究證實在細(xì)胞水平上，S100A2對肺癌細(xì)胞的分裂增殖、遷移及侵襲能力均有促進(jìn)作用，未來此蛋白有望作為有效的生物學(xué)標(biāo)記物輔助診斷肺癌及評估預(yù)后。