王立 孟令丙 徐鴻軒 陳玉輝 尹家文 王倩雯 劉德平 龔濤

100730 北京醫(yī)院，國家老年醫(yī)學中心， 國家衛(wèi)生健康委北京老年醫(yī)學研究所，國家衛(wèi)生健康委老年醫(yī)學重點實驗室，中國醫(yī)學科學院老年醫(yī)學研究院(王立、孟令丙、徐鴻軒、陳玉輝、尹家文、王倩雯、劉德平、龔濤)；100730 北京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(王立、陳玉輝、尹家文、王倩雯、龔濤)，心血管內(nèi)科(孟令丙、徐鴻軒、劉德平)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種多因素疾病，其主要原因是脂質(zhì)成分在血管壁的積聚，以及動脈內(nèi)的慢性炎癥，導致AS斑塊的形成和斑塊破裂[1]。AS斑塊破裂引起的心肌梗死、腦梗死等心腦血管疾病及其并發(fā)癥已成為威脅人類生命和健康的主要原因。因此，探討AS性疾病的發(fā)病機制、防治已成為當前的研究熱點[2-3]。已有研究表明，社會心理因素尤其是慢性心理應(yīng)激(chronic psychological stress，CPS)在AS的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但其在AS演變中的確切機制尚不清楚[4-5]。近年來，越來越多的證據(jù)表明腸道菌群參與了血管炎癥和AS的發(fā)生發(fā)展過程[6-8]。各種小鼠模型均證實腸道菌群影響血管炎癥表型、心腦血管疾病的發(fā)生和動脈血栓形成。然而，目前尚不清楚CPS是否通過改變腸道菌群進而影響AS形成和進展。本研究的目的是探討CPS對小鼠AS的影響，并觀察在CPS作用下AS模型小鼠腸道菌群的變化情況。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

小鼠普通飼料(貨號1022)和高脂飼料(貨號H10141)購自北京華阜康生物科技有限公司；HE染色試劑盒(貨號G1003)購自武漢賽維爾生物科技有限公司；全自動生化分析儀購自美國Beckman公司；曠場裝置(尺寸：長50 cm，寬50 cm，高40 cm)及KEMaze動物行為自動分析軟件購自南京卡爾文生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗動物

10只SPF級雄性C57BL/6J小鼠和20只SPF級雄性ApoE-/-(C57BL/6J背景)小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司。所有小鼠單籠飼養(yǎng)，食物和水不受限。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20℃～24℃，相對濕度60%～70%，光照周期12/12 h。

1.3 AS和CPS模型構(gòu)建

10只20周齡雄性C57BL/6J小鼠接受普通飼料喂飼，設(shè)為正常對照組(normal control group，NC組)；20只20周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機分為2組：其中10只為AS組(atherosclerosis group，AS組)，予以高脂飼料喂養(yǎng)12周；另10只予以高脂飼料喂養(yǎng)疊加慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)干預(yù)12周，為AS+CPS組。

CUMS實施方案[9-10]如下，每周隨機進行以下應(yīng)激方式：(1)夾尾：鼠尾末端1 cm處鉗夾1 min；(2)突發(fā)震動：搖晃鼠籠15次，每次持續(xù)5 s，間隔10 s；(3)晝夜顛倒：即反轉(zhuǎn)光照周期3次；(4)噪聲刺激：暴露于70 dB的白噪音中7或9 h；(5)閃光刺激：低強度頻閃燈照明(150次閃爍/min)9或12 h；(6)束縛：將小鼠約束于固定器中，無法轉(zhuǎn)身2或4 h；(7)鼠籠傾斜：鼠籠置于45°傾斜角的平臺上，每小時調(diào)整角度，共7 h；(8)潮濕的敷料24 h。

1.4 小鼠體重和血脂濃度檢測

分別采集各組小鼠基線(0)和第4、8、12周體重。造模結(jié)束后小鼠禁食不禁水12 h，麻醉后心臟穿刺采血，注入EDTA抗凝管，3 000 r/min、4℃離心15 min，收集血漿后-80℃保存。采用Beckman全自動生化分析儀測定血清三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇濃度。

1.5 曠場實驗

曠場實驗反應(yīng)箱底部分為16個面積相同的小格，外周12格記為周邊區(qū)，中間4格為中心區(qū)。將小鼠置于中心區(qū)域，動物行為學軟件自動記錄并分析5 min內(nèi)小鼠停留在中心區(qū)的時間。曠場實驗在沒有干擾的隔音室中進行，每次檢測完成一只小鼠后使用5%的乙醇水溶液擦洗反應(yīng)箱，揮發(fā)干后再進行下一只檢測，以避免由于先前小鼠留下的氣味而產(chǎn)生的偏倚。

1.6 小鼠動脈血管組織病理學檢查

小鼠麻醉后分離動脈血管，標本于4%多聚甲醛溶液中固定后，依次進行沖洗、脫水、浸蠟、石蠟包埋、制片和染色等操作。按試劑使用說明進行蘇木精和伊紅(H&E)染色后在顯微鏡下觀察并拍照。用ImageJ軟件測量管腔和AS斑塊面積。

1.7 小鼠腸道菌群檢測分析

為了解不同處理對小鼠腸道菌群多樣性的影響，實驗最后一天利用無菌離心管接取每只小鼠的糞便標本，立即置入液氮后轉(zhuǎn)入-80℃保存以供進一步分析。 提取并擴增微生物DNA，正向引物為341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)，反向引物為806R(5’- GGACTACHVGGGTATCTAAT-3’)，分別針對V3-V4區(qū)擴增微生物16S rDNA基因。由廣州基迪奧生物科技有限公司在Illumina Novaseq 6000測序平臺上進行16S測序及分析。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 CPS和高脂飲食對小鼠體重的影響

各組小鼠初始體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨著生長及干預(yù)進行，各組小鼠體重增加，其中NC組和AS組小鼠體重全過程均無顯著改變，但AS組小鼠體重增長幅度更大，于第4周反超過NC組，此后差距逐漸加大。第12周AS組小鼠體重增長幅度較NC極顯著增加(P<0.001)。與NC組比較，AS+CPS組小鼠體重增長相對較慢(圖1)，干預(yù)第4周AS+CPS組小鼠體重與NC組小鼠體重相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與AS組比較，AS+CPS組小鼠體重增長緩慢，第4周開始差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，干預(yù)12周后AS+CPS組小鼠體重和NC組及AS組小鼠體重相比更輕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

a：NC組比AS組，b：AS組比AS+CPS組，c：NC組比AS+CPS組；a/b/cP<0.05，bb/ccP<0.01，aaaP<0.001；每組10只圖1 干預(yù)前后各組小鼠體重變化趨勢

2.2 CPS和高脂飲食對小鼠血脂濃度的影響

與NC組小鼠比較，AS組和AS+CPS組小鼠血漿中低密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇濃度顯著升高(P<0.001)，三酰甘油和高密度脂蛋白膽固醇濃度顯著升高(P<0.01)。與AS組比較，AS+CPS組小鼠血漿高密度脂蛋白膽固醇濃度顯著下降(P<0.05)，見表1。

表1 小鼠血脂濃度比較(mmol/L)

2.3 CPS和高脂飲食對小鼠自主行為的影響

曠場實驗結(jié)果顯示，干預(yù)前各組小鼠在反應(yīng)箱中心區(qū)域停留的時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2A。干預(yù)12周后，與NC組和AS組小鼠比較，接受CUMS的AS+CPS組小鼠在反應(yīng)箱中心區(qū)域停留的時間顯著減少(P<0.05)，見圖2B。

干預(yù)前基線(A)，干預(yù)終點(B)；aP<0.05；每組10只圖2 干預(yù)前后各組小鼠在曠場反應(yīng)箱中心區(qū)域停留時間變化

2.4 CPS和高脂飲食對小鼠動脈血管形態(tài)的影響

干預(yù)12周后與NC組小鼠比較，可見AS組和AS+CPS組小鼠動脈血管壁粥樣硬化斑塊形成(P<0.001)，造成管腔狹窄(P<0.001)。與AS組小鼠比較，AS+CPS組小鼠斑塊面積顯著增加(P<0.01)，管腔狹窄更為嚴重(P<0.01)，見圖3。

HE染色顯示動脈血管壁粥樣硬化斑塊形態(tài)(A)、頭臂干分叉處斑塊面積(B)和管腔狹窄率(C)；aaP<0.01，aaaP<0.001；每組8只圖3 CPS和高脂飲食對小鼠動脈血管粥樣硬化的影響

2.5 CPS和高脂飲食對小鼠腸道菌群的影響

2.5.1 OTUs數(shù)據(jù)分析和物種注釋 在16S rRNA V3-V4基因序列相似性為97%的條件下，得到每個樣本的操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)。其中307個OTUs為三組共有，NC組、AS組、AS+CPS組小鼠分別獨有208、61、30個OTUs。這一結(jié)果表明這三個群體的腸道菌群之間有一定的共性，同時也存在一些差異。比較各組OTUs數(shù)量，結(jié)果顯示NC組、AS組和AS+CPS組樣本OTUs數(shù)量依次降低，見圖4。

圖4 維恩圖展示各組間共有和特有OUTs數(shù)量

2.5.2 α多樣性分析 α多樣性指某個群落或生境內(nèi)部物種的多樣性，通常使用兩個重要參數(shù)進行計算：物種豐富度和均勻度。Chao1指數(shù)主要與樣品的物種豐富度有關(guān)。與NC組相比，AS和AS+CPS小鼠腸道菌群chao1指數(shù)均顯著降低(NC組比AS組，P<0.01；NC組比AS+CPS組，P<0.0001； AS組比AS+CPS組，P>0.05)，見圖5A。Peilou指數(shù)主要反應(yīng)樣品內(nèi)物種均勻度，結(jié)果顯示與NC組相比，AS+CPS組Peilou指數(shù)顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其他各組間差異不顯著，見圖5B。此外，Shannon指數(shù)綜合反映樣本豐富度和均勻度，結(jié)果顯示只在NC組和AS+CPS組間存在顯著差異(P<0.05)，見圖5C。綜上表明，AS+CPS組小鼠腸道內(nèi)菌群多樣性明顯下降。

α多樣性分析： Chao1箱線圖(A)、Pielou箱線圖(B)和Shannon箱線圖(C)；β多樣性分析：NMDS分析(D)；aP<0.05，aaP<0.01，aaaaP<0.000 1，每組8只圖5 小鼠腸道菌群多樣性分析

2.5.3 β多樣性分析 β多樣性指不同生境之間多樣性的比較，即樣本間的差異，可用非度量多維尺度法(nonmetric multidimensional scaling，NMDS)分析。結(jié)果顯示NC組和AS組小鼠樣本分布相對集中，AS+CPS組小鼠樣本分布較分散；AS和AS+CPS樣本間分布距離較近，與NC組小鼠距離相對遠，故與AS和AS+CPS組比較，NC組小鼠樣本單獨構(gòu)成一類，見圖5D。

2.5.4 小鼠腸道菌群組成變化 根據(jù)物種注釋結(jié)果在門水平與NC組小鼠比較，AS組小鼠腸道內(nèi)厚壁菌門豐度顯著增加(P<0.01)，而AS+CPS組小鼠腸道厚壁菌門豐度呈增加趨勢(P>0.05)；AS組和AS+CPS組小鼠腸道疣微菌門(P<0.001)和變形菌門(P<0.01)的豐度顯著增加，擬桿菌門(P<0.001)的豐度均顯著降低，厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)比值增大。與AS組比較，AS+CPS組小鼠疣微菌門的豐度顯著增加(P<0.01)，放線菌門的豐度顯著降低(P<0.05)。雖然與AS組比較，AS+CPS組小鼠腸道厚壁菌門和擬桿菌門的豐度均呈下降趨勢(P>0.05)， 但擬桿菌門的豐度下降程度更大，故F/B比值相對增大，見圖6A。

門水平物種分布堆疊圖(A)，屬水平top10物種豐度熱圖(B)；Firmicutes：厚壁菌門，Bacteroidetes：擬桿菌門，Verrucomicrobia：疣微菌門，Proteobacteria：變形菌門，Actinobacteria：放線菌門；Akkermansia：阿克曼氏菌屬，Blautia：布勞特氏菌屬，Lachnospiraceae-UCG-006：毛螺菌科-UCG-006，Desulfovibrio：脫硫弧菌屬，F(xiàn)aecalibaculum：糞鈣桿菌屬，Romboutsia：羅姆布茨菌屬， Lachnospiraceae-NK4A136-group：毛螺菌科-NK4A136組，Lactobacillus：乳酸桿菌屬，Alistipes：理研菌屬；每組8只圖6 小鼠腸道菌群組成變化

在屬水平與NC組小鼠相比，AS組和AS+CPS組小鼠腸道理研菌屬(P<0.001)和毛螺菌科-NK4A136組(P<0.01 和P<0.05)的豐度顯著降低，AS組小鼠乳酸桿菌屬豐度呈下降趨勢(P>0.05)，AS+CPS組小鼠乳酸桿菌屬豐度顯著降低(P<0.05)。同時，AS組和AS+CPS組小鼠腸道布勞特氏菌屬(P<0.001 和P<0.01)、毛螺菌科-UCG-006(P<0.001)和Lachnoclostridium(P<0.001 和P<0.01)的豐度顯著增加。相較于AS組小鼠，AS+CPS組小鼠腸道阿克曼氏菌屬的豐度顯著增加(P<0.01)，乳酸桿菌屬、羅姆布茨菌屬和糞鈣桿菌屬的豐度均顯著降低(P<0.05)，見圖6B。

3 討論

AS是一種發(fā)病機制復(fù)雜的慢性炎性與代謝性相關(guān)疾病，病程發(fā)展緩慢，主要特征為脂質(zhì)在血管內(nèi)膜下逐漸沉積，然后纖維組織增生及鈣化沉積，動脈壁增厚變硬，粥樣硬化斑塊形成導致管腔變窄。在本研究中與NC組小鼠比較，AS組和AS+CPS組小鼠均喂食高脂飼料12周，成功構(gòu)建AS模型。相較于NC組和AS組小鼠，AS+CPS組小鼠疊加CPS干預(yù)，研究顯示AS+CPS組小鼠體重增長緩慢，在曠場實驗反應(yīng)箱中心區(qū)停留時間顯著減少。綜上表明CPS效果顯著，導致該組小鼠處于持續(xù)的心理應(yīng)激狀態(tài)。比較不同組間小鼠動脈血管粥樣硬化病變，結(jié)果表明AS+CPS組小鼠血管斑塊面積增大，管腔狹窄加重。此外，本研究前期結(jié)果證實CPS可導致動脈血管粥樣硬化斑塊負荷增加，管腔狹窄加重，斑塊穩(wěn)定性降低，故CPS促進了AS的發(fā)生發(fā)展[10-11]。本研究中AS組與AS+CPS組小鼠血漿低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇和三酰甘油濃度無顯著差異，提示CPS可能通過其他作用機制而非脂質(zhì)代謝途徑影響AS形成和進展。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失調(diào)激發(fā)機體的免疫調(diào)節(jié)，參與AS的發(fā)生發(fā)展[6-7，12]。同時研究表明CPS對腸道微生物群落組成有顯著影響，提示CPS可能通過改變腸道菌群結(jié)構(gòu)來影響AS發(fā)生發(fā)展。本研究利用16S測序技術(shù)對三組小鼠糞便進行檢測，評估小鼠腸道菌群變化情況，結(jié)果證實，與NC組小鼠比較，AS組和AS+CPS組小鼠腸道菌群均發(fā)生了顯著改變。

α多樣性分析顯示，與NC組比較，AS組和AS+CPS組小鼠樣本Chao1指數(shù)均下降，表示物種豐富度顯著下降。NC組和AS組小鼠樣本Pielou指數(shù)無明顯差異，而NC組和AS+CPS組小鼠樣本Pielou指數(shù)顯著下降，表明CPS導致腸道菌群均勻度下降。Shannon指數(shù)綜合反映物種豐富度和均勻度，結(jié)果表明只在NC組和AS+CPS組小鼠間出現(xiàn)顯著差異。綜上表明高脂飲食可導致AS小鼠腸道菌群紊亂，而CPSCPS可能通過降低腸道菌群多樣性進一步加重腸道菌群紊亂促進AS發(fā)生發(fā)展。

研究證實，三甲胺(trimethylamine，TMA)水平和AS發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]，而產(chǎn)生TMA的細菌主要分布于厚壁菌門、變形菌門。本研究中，AS組和AS+CPS組小鼠腸道厚壁菌門及變形菌門的豐度增加，擬桿菌門的豐度降低，厚壁菌門/擬桿菌門增大，與以往研究結(jié)果一致[14-15]。本研究表明與AS組小鼠比較，AS+CPS組小鼠疣微菌門、放線菌門的豐度顯著增加，厚壁菌門和擬桿菌門的豐度相對降低，提示CPS可能通過影響腸道菌群組成促進AS發(fā)生發(fā)展。

AS組和AS+CPS組小鼠理研菌屬豐度比NC組顯著降低，該屬菌群參與脂肪消化，可將乳酸轉(zhuǎn)化為其他短鏈脂肪酸，如乙酸和丙酸，短鏈脂肪酸具有AS保護效應(yīng)[16]。此外，AS組和AS+CPS組小鼠毛螺菌科-NK4A136組的豐度顯著降低，毛螺菌科-NK4A136組為產(chǎn)丁酸鹽細菌，被證實有助于維持小鼠腸道屏障的完整性[17]。當腸道屏障受損時，腸道各種炎性介質(zhì)如脂多糖更易進入血液循環(huán)損傷血管促進AS發(fā)生發(fā)展。故由于毛螺菌科-NK4A136組增強上皮屏障完整性和抑制炎癥的能力，對維持胃腸道健康、減少炎性物質(zhì)吸收和防止血管炎癥有重要作用。AS組和AS+CPS組小鼠腸道中Lachnoclostridium豐度均顯著增加，研究表明其豐度與血液氧化三甲胺(trimethylamine oxide，TMAO)水平呈顯著正相關(guān)，而TMAO促進AS發(fā)生發(fā)展[18-20]。

通過觀察AS組和AS+CPS組間差異物種，可以評估CPS對腸道菌群的影響。本研究顯示相較于AS組，AS+CPS組小鼠腸道乳酸桿菌屬、羅姆布茨菌屬和糞鈣桿菌屬豐度均顯著降低。研究證實乳酸桿菌屬作為有益菌在AS發(fā)生發(fā)展中具有保護效應(yīng)[21]。Zheng等[22]研究顯示羅姆布茨菌屬豐度和高脂飲食大鼠高密度脂蛋白膽固醇濃度正相關(guān)，而高密度脂蛋白膽固醇在AS發(fā)展過程中有保護效應(yīng)。本研究中AS+CPS組小鼠高密度脂蛋白膽固醇濃度顯著低于AS組小鼠，提示CPS可能通過降低羅姆布茨菌屬豐度進而負向調(diào)節(jié)高密度脂蛋白膽固醇濃度促進AS發(fā)展。研究表明，糞鈣桿菌屬Faecalibaculum rodentium菌可產(chǎn)生短鏈脂肪酸發(fā)揮抗腫瘤作用，但也有研究報道糞鈣桿菌屬細菌發(fā)揮促炎作用，可能破壞腸道屏障[23-24]。此外，比較AS組和AS+CPS組小鼠腸道菌群差異物種發(fā)現(xiàn)CPS干預(yù)后小鼠腸道疣微菌門-阿克曼菌屬豐度顯著增加。近來研究顯示該屬中代表性菌種嗜黏蛋白阿克曼菌可通過修復(fù)腸道屏障減輕代謝性內(nèi)毒素引起的炎癥，從而減輕血管炎癥及改善AS病變[25-26]。該現(xiàn)象與CPS促進AS發(fā)生發(fā)展相矛盾，分析其原因有阿克曼氏菌屬包含多種細菌，彼此功能可能并不一致。此外，也可能與機體應(yīng)激后啟動反饋調(diào)節(jié)機制或采樣時間節(jié)點有關(guān)，未來應(yīng)動態(tài)采樣觀察不同階段腸道菌群變化情況?？偟膩碚f腸道菌群在介導CPS促進AS發(fā)生發(fā)展中的作用極其復(fù)雜，同時存在有益菌和有害菌豐度的雙向不同程度變化。

綜上，本研究表明高脂飲食可導致AS小鼠腸道菌群紊亂，有益菌豐度下降，有害菌豐度增加，同時CPS促進AS病變發(fā)展，加重腸道菌群紊亂及降低菌群多樣性。未來需要進一步研究CPS過程中機體腸道特異性改變的菌種對AS發(fā)生發(fā)展的影響及機制。

利益沖突：無