胡海蕊 袁 媛 李 君 薛天琳 王 營 劉曙光 高 超 鄭胡鏞

急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)是一組以惡性幼稚T淋巴細(xì)胞增殖為特征的異質(zhì)性疾病，占兒童ALL的10%～15%[1]。盡管目前的高強(qiáng)度化療使T-ALL患兒誘導(dǎo)緩解率超過95%，但其易發(fā)生早期復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)后再緩解困難，故長(zhǎng)期預(yù)后仍差于兒童B細(xì)胞前體ALL[2]。目前，國內(nèi)外普遍將患兒初診時(shí)外周血WBC計(jì)數(shù)、強(qiáng)的松實(shí)驗(yàn)治療第8 d外周血幼稚細(xì)胞絕對(duì)值和化療早期微小殘留病(MRD)作為T-ALL分層治療的劃分標(biāo)準(zhǔn)，其中MRD被認(rèn)為是最佳的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因素[3]。中國兒童白血病治療協(xié)作組ALL 2008方案(CCLG-ALL 2008)[4]在此基礎(chǔ)上，納入化療開始后第33 d和第78 d MRD，并以此指導(dǎo)臨床調(diào)整化療強(qiáng)度，或作為進(jìn)行造血干細(xì)胞移植(HSCT)治療的參考指標(biāo)。本研究回顧性分析2008至2018年首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院(我院)血液病中心應(yīng)用CCLG-ALL 2008方案治療的T-ALL患兒的臨床和生物學(xué)特征，探討在應(yīng)用MRD調(diào)整治療強(qiáng)度后，影響T-ALL患兒預(yù)后的相關(guān)因素，以期為患兒的精準(zhǔn)分層提供參考依據(jù)。

1 方法

1.1 知情同意 本研究中骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查、免疫表型和融合基因檢測(cè)及資料收集均取得患兒監(jiān)護(hù)人的書面知情同意。

1.2 研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn) 同事滿足以下2項(xiàng)：①2008年3月至2018年9月于我院初診且原發(fā)病為T-ALL的0～18歲連續(xù)病例；②應(yīng)用CCLG-ALL 2008方案[4]治療。

1.3 研究對(duì)象的排除標(biāo)準(zhǔn) 滿足任意1項(xiàng)者排除：①確診后未在我院行CCLG-ALL 2008方案治療；②缺失基因?qū)W和免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果。

1.4 治療方案及危險(xiǎn)度分層 參照CCLG-ALL 2008方案診斷、分層和治療。免疫分型T-ALL為中危組，滿足以下任意1項(xiàng)者即升入高危組，并調(diào)整為高危化療方案：①BCR/ABL1融合基因陽性；②MLL基因重排；③強(qiáng)的松實(shí)驗(yàn)治療7 d后，外周血幼稚淋巴細(xì)胞絕對(duì)值≥1 000個(gè)/μL(即強(qiáng)的松實(shí)驗(yàn)治療反應(yīng)差)；④誘導(dǎo)緩解治療第15 d骨髓形態(tài)學(xué)示幼稚淋巴細(xì)胞>20%，即呈M3；⑤誘導(dǎo)緩解治療第33 d骨髓形態(tài)學(xué)未緩解(原始+幼稚淋巴細(xì)胞≥5%)，即呈M2(≥5%且<20%)或M3；⑥誘導(dǎo)緩解治療第33 d MRD≥1%或鞏固治療開始前MRD≥0.1%。CCLG-ALL 2008中危和高危治療方案見表1。

1.5 免疫表型和MRD評(píng)估 采用Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液(美國Thermo Fisher Scientific公司)分離患兒?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熒光偶聯(lián)單克隆抗體標(biāo)記的白血病細(xì)胞，陽性表達(dá)閾值胞膜抗原為>20%，胞漿抗原為>10%。T-ALL患兒免疫表型根據(jù)歐洲白血病免疫分型協(xié)作組(EGIL)的抗原積分系統(tǒng)確定[5]。通過多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患兒初診時(shí)白血病相關(guān)抗原的表達(dá)，作為MRD的跟蹤標(biāo)志，檢測(cè)步驟參照美國St. Jude兒童醫(yī)院指導(dǎo)方案[6]。于誘導(dǎo)緩解治療結(jié)束時(shí)和鞏固化療開始前進(jìn)行MRD檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)每管中至少含1×105單個(gè)核細(xì)胞。白血病細(xì)胞檢測(cè)水平低于骨髓有核細(xì)胞的0.01%判定為陰性。

1.6 融合基因檢測(cè) 分離患兒初診骨髓樣本中的單個(gè)核細(xì)胞，根據(jù)Trizol(美國Life Technology公司)試劑盒說明書提取總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度和濃度。采用隨機(jī)逆轉(zhuǎn)錄引物(美國Invitrogen公司)將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用多重巢式聚合酶鏈法(RT-PCR)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)融合轉(zhuǎn)錄本。常規(guī)融合基因檢測(cè)包括：SIL-TAL1、SET-CAN、MLL重排、BCR-ABL、TEL-AML1、E2A-PBX1、TLS-ERG、E2A-HLF等共29種[7]。

1.7 隨訪 入組患兒除已在病歷系統(tǒng)中記錄死亡者外，其余在完成治療時(shí)以及完成治療后的第3～6、12、24、36個(gè)月進(jìn)行隨訪；并于2020年8月1日行電話隨訪，詢問患兒存活或死亡情況?？偵嫫?OS)定義為從確診之日起至患兒死亡或隨訪截止日未死亡的時(shí)間；無事件生存期(EFS)定義為患兒初次診斷T-ALL至末次隨訪或出現(xiàn)事件的時(shí)間，事件包括復(fù)發(fā)、第2次腫瘤和任何原因引起的死亡。

1.8 臨床資料截取 ①患兒性別、年齡；②初診時(shí)外周血WBC計(jì)數(shù)、危險(xiǎn)度評(píng)估；③免疫表型和融合基因檢測(cè)結(jié)果；④強(qiáng)的松實(shí)驗(yàn)治療反應(yīng)(經(jīng)過強(qiáng)的松治療7 d后，第8 d檢測(cè)外周血白細(xì)胞數(shù)目<1×109·L-1)；⑤早期治療反應(yīng)評(píng)估：第15 d和33 d骨髓幼稚細(xì)胞百分比，第15 d、33 d和78 d MRD；⑥隨訪：EFS和OS。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用n(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Long-rank檢驗(yàn)；Cox回歸采用逐步向前法進(jìn)行多因素預(yù)后分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 符合本文納入標(biāo)準(zhǔn)的T-ALL患兒共114例，排除未化療即死亡2例、確診后未在我院行CCLG-ALL 2008方案治療3例、骨髓異常增生綜合征(MDS)轉(zhuǎn)為T-ALL 1例、缺失基因?qū)W或免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果7例，最終101例納入本文分析。其中男76例(75.2%)，女25例?；純耗挲g1歲2個(gè)月至14歲6個(gè)月，中位年齡7歲6個(gè)月。101例T-ALL患兒轉(zhuǎn)歸見圖1。

2.2 免疫表型標(biāo)志 101例T-ALL患兒均表達(dá)cyCD3和CD7，T系免疫標(biāo)志CD2和CD5的表達(dá)率分別為85.1%(86例)和98.0%(99例)。B系免疫表型標(biāo)志CD10、cyCD79a、CD19和cyIgM的表達(dá)率分別為24.8%(25例)、7.9%(8例)、2.0%(2例)和2.0%(2例)；Igλ和Igκ均無表達(dá)。干細(xì)胞標(biāo)志CD34的表達(dá)率為45.5%(46例)，幼稚細(xì)胞標(biāo)志HLA-DR的陽性率為11.9%(12例)。髓系免疫表型標(biāo)志CD117、CD13、CD33、MPO和CD41的陽性率分別為8.0%(8/100)、5.0%(5例)、13.9%(14例)、0(0例)和2.0%(2例)。CD56異常表達(dá)率為31.0%(9/29)。

2.3 融合基因 28例(27.7%)患兒檢出融合基因陽性，分別為SIL-TAL122例(21.8%)；SET-CAN1例(1.0%)；MLL基因重排5例(5.0%)，包括MLL-ENL3例、MLL-ELL和MLL-AF6各1例。

2.4 生物學(xué)特征與臨床表現(xiàn)和治療反應(yīng)的相關(guān)性 表2顯示，CD2陽性患兒初診外周血WBC計(jì)數(shù)≥100×109·L-1的比例顯著高于陰性者，誘導(dǎo)緩解治療第15 d骨髓幼稚細(xì)胞未獲得M1者的比例顯著低于陰性者。表達(dá)CD10者強(qiáng)的松實(shí)驗(yàn)治療反應(yīng)差的比例低于陰性患兒。表達(dá)CD33者誘導(dǎo)緩解治療第15 d和化療第33 d的形態(tài)學(xué)未獲得完全緩解的患兒比例及MRD>1%的患兒比例均高于CD33陰性患兒，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表達(dá)CD34者強(qiáng)的松治療反應(yīng)差、第15 d骨髓形態(tài)學(xué)≥5%和MRD≥10%的比例均高于陰性患兒，最終歸入高危的患兒比例也高于陰性患兒，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他免疫分型分子cyCD79a、CD117、HLA-DR均未發(fā)現(xiàn)與臨床特征和治療反應(yīng)的相關(guān)性。SIL-TAL1陽性患兒初診臨床特征和早期治療反應(yīng)與陰性患兒差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其最終劃入高危的比例顯著高于陰性患兒。

2.5 生物學(xué)特征與患兒預(yù)后的關(guān)系 截止至2020年8月1日，中位隨訪時(shí)間44(1.7～140.5)個(gè)月，5年EFS和OS分別為(70.7±4.7)%和(74.2±4.5)%。各免疫表型標(biāo)志的表達(dá)均與患兒預(yù)后不相關(guān)(表2)。

表3顯示，SIL-TAL1陽性、強(qiáng)的松實(shí)驗(yàn)治療反應(yīng)不良、治療第15 d骨髓形態(tài)學(xué)不緩解和第33 d MRD≥1%與不良的EFS和OS相關(guān)。表3和圖2顯示，第33 d MRD≥1%和SIL-TAL1基因陽性亦是EFS和OS的獨(dú)立影響因素，HR分別為第33 d MRD≥1%對(duì)EFS為1.96(95%CI：1.114～3.452，P=0.020)，對(duì)OS為2.062(95%CI：1.138～3.734，P=0.017)；SIL-TAL1陽性對(duì)EFS為2.536(95%CI：1.053～6.104，P=0.038)，對(duì)OS為2.921(95% CI：1.144～7.457，P=0.025)。

表2 T-ALL患兒生物學(xué)特征與臨床表現(xiàn)和治療反應(yīng)的相關(guān)性[n(%)]

3 討論

本研究共納入T-ALL患兒101例，男孩占比(75.2%)顯著高于女孩；初診時(shí)WBC≥100×109·L-1的患兒占51.5%，>10歲患兒占28.7%，這些臨床生物學(xué)特征與既往文獻(xiàn)報(bào)道的兒童T-ALL相似[8-10]。

既往研究顯示，T-ALL普遍存在跨系抗原的異常表達(dá)[11]。本研究中，B系抗原CD10、干細(xì)胞標(biāo)志CD34以及CD56的異常表達(dá)率均>20%，髓系抗原CD33表達(dá)率也達(dá)10%。雖然既往研究顯示所有免疫標(biāo)志均與患者預(yù)后不相關(guān)[12, 13]，但本研究CD34和CD33陽性患兒與不良的初診臨床特征和早期治療反應(yīng)相關(guān)，而CD10陽性者強(qiáng)的松實(shí)驗(yàn)反應(yīng)良好者的比例高于陰性者。

早年DCOG-ALL7研究顯示，CD34陽性T-ALL患兒的預(yù)后差于陰性者[14]，但是其他研究均未證實(shí)這一結(jié)果。本研究顯示，雖然CD34陽性患兒最終預(yù)后與陰性者無差異，但是CD34陽性者強(qiáng)的松治療反應(yīng)不佳、誘導(dǎo)緩解治療早期第15 d骨髓形態(tài)學(xué)M2或M3及MRD>10%的患兒比例顯著高于陰性者，且最終納入高危的患兒比例也高，提示根據(jù)患兒早期治療反應(yīng)增加化療強(qiáng)度，或許可以改善CD34陽性患兒的預(yù)后。本研究還發(fā)現(xiàn)，CD33陽性患兒第33 d未獲得完全緩解的比例和高M(jìn)RD的比例顯著高于陰性者。廖紅艷等[15]在青少年和成人T-ALL的研究中發(fā)現(xiàn)35%的CD33陽性患者和64.1%的CD33陰性患者分別達(dá)到CR，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與本研究結(jié)果一致。此外，Sayed等[3]的研究納入71例T-ALL患兒，結(jié)果顯示CD33的表達(dá)是唯一顯著影響患兒5年OS的預(yù)后因素。目前人源化抗CD33抗體吉妥單抗(GO)已被批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)的急性髓系白血病，部分研究正在嘗試使用GO治療CD33陽性的ALL，且取得了一定的成效[16]。

融合基因SIL-TAL1是兒童T-ALL中常見的分子遺傳學(xué)異常,TAL1基因編碼具有螺旋-環(huán)-螺旋基本結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，參與造血干細(xì)胞功能的調(diào)控，而SIL基因與TAL1基因融合后導(dǎo)致TAL1蛋白過表達(dá)，從而參與T-ALL的發(fā)生發(fā)展。成人和兒童SIL-TAL1的發(fā)生率相差不大，為16%～26%[17-19]。該基因與患者不良的臨床特征相關(guān)，但其對(duì)預(yù)后的影響，各臨床研究中心報(bào)道結(jié)果不一致。本研究中SIL-TAL1陽性患兒的EFS和OS都顯著低于陰性患兒，這與中國臺(tái)灣兒童TPOG-ALL-2002方案、巴西兒童T-ALL方案、中國武漢同濟(jì)醫(yī)院CALLG2008方案的治療結(jié)果相似[18-20]。此外，意大利AIEOP協(xié)作組BFM-ALL-2000方案和我院BCH-ALL-2003方案治療的T-ALL患兒，SIL-TAL1陽性與陰性患兒的預(yù)后并無差異[17, 21]。由此提示，SIL-TAL1白血病細(xì)胞對(duì)化療方案中不同藥物的組合和劑量敏感性不同，深入研究各種藥物對(duì)這型白血病的作用機(jī)制，有助于提高患者療效。

本研究結(jié)果顯示，早期治療反應(yīng)，包括強(qiáng)的松實(shí)驗(yàn)治療反應(yīng)、第15 d骨髓形態(tài)學(xué)分級(jí)和誘導(dǎo)緩解結(jié)束時(shí)的MRD是預(yù)后相關(guān)因素；誘導(dǎo)緩解結(jié)束時(shí)MRD是獨(dú)立的預(yù)后相關(guān)因素。在中國1項(xiàng)T-ALL的臨床研究中[22]，同樣應(yīng)用CCLG-ALL-2008治療方案，發(fā)現(xiàn)患者第15 d骨髓形態(tài)學(xué)M3、強(qiáng)的松實(shí)驗(yàn)治療反應(yīng)不佳、誘導(dǎo)治療結(jié)束時(shí)MRD>1%與不良預(yù)后相關(guān)，與本文第33 d MRD具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值結(jié)論相似，均提示MRD在T-ALL患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的重要作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，患兒高危與不良預(yù)后相關(guān)，但不是獨(dú)立預(yù)后因素，提示臨床醫(yī)生根據(jù)MRD水平及時(shí)調(diào)整治療方案，如進(jìn)行HSCT，可能會(huì)改善患兒的預(yù)后。