宋海昭，沈新春，吳 濤，鄭曉冬

（1 南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 南京 210023 2 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院 天津 300457 3 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州 310058）

櫻桃是中國傳統(tǒng)的藥食兩用漿果?，F(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究表明，櫻桃不僅富含蛋白質(zhì)、糖類、有機酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，還含有酚酸和黃酮類等生物活性物質(zhì)，尤其是其特征性活性成分——花色苷的含量較高[1]?；ㄉ帐且活愑苫ㄉ嘏c糖以糖苷鍵結(jié)合而成的化合物，具有抗氧化、抗癌、抗炎，降低血脂，延緩衰老和提高視力等生理活性[2-6]，且花色苷安全無毒，在食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。櫻桃具有明顯的季節(jié)依賴性且貯藏期短，櫻桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也因此受到限制。提取櫻桃特征性活性成分——花色苷，研究其生物活性，能夠為櫻桃高價值深加工與開發(fā)提供理論支持，推進櫻桃精深加工與利用的進程。櫻桃花色苷是櫻桃果實中的主要呈色物質(zhì)，研究表明，不同品種櫻桃所含花色苷種類與含量稍有不同，其所含的花色苷主要類型為矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-葡萄糖基鼠李糖苷、矢車菊-3-槐糖苷和矢車菊-3-蕓香糖苷[7-8]。目前關(guān)于櫻桃花色苷的生理活性研究主要有：櫻桃花色苷能夠抗氧化應(yīng)激，抑制COX1 和COX2 的生成，調(diào)節(jié)T 淋巴細胞亞群，顯著降低炎癥細胞因子水平，從而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用[9-11]；抑制腸道癌細胞的生長，降低患腸癌的危險[12-13]；降低血液中甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇等含量水平，預(yù)防肥胖的發(fā)生[8]。此外，Wu 等[8]在研究膳食櫻桃花色苷對肥胖的干預(yù)作用時發(fā)現(xiàn)，櫻桃花色苷能有效降低肥胖小鼠血清中的胰島素和血糖含量水平。體外實驗研究發(fā)現(xiàn)櫻桃花青素、花色苷作用于小鼠胰腺細胞時，無論在正常糖分或高糖環(huán)境，櫻桃花色苷均能夠顯著促進胰島素的分泌，尤其在高糖環(huán)境中，胰島細胞的胰島素分泌量增加了50%[14]，且櫻桃花色苷能夠顯著促進HepG2 的葡萄糖消耗水平[15]。然而，也有報道稱在干預(yù)高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠實驗中，櫻桃花色苷對餐后血漿胰島素和空腹血糖含量水平無顯著影響[16]。綜上，櫻桃花色苷雖具有良好的抗氧化、抗炎、抗腫瘤和降血脂等作用，但其是否具有良好的降糖活性存在分歧，其作用機制有待研究。本課題利用高脂飼料飲食誘導(dǎo)建立肥胖伴胰島素抵抗小鼠模型，評價櫻桃花色苷對肥胖伴隨的高血糖和胰島素抵抗等癥狀的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

按照本課題組先前研究所報道的方法[8]制備得到櫻桃花色苷，其主要含有矢車菊-3-O-2G-葡萄糖蕓香糖苷 （39.4%）、矢車菊素-3-蕓香糖苷（49.0%）和天竺葵素-3-蕓香糖苷（2.6%）。30 只SPF 級4 周齡雄性C57BL/6 小鼠，體重17.2～20.9 g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司；純化低脂飼料（含10%脂肪）、高脂飼料（含45%脂肪），江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司，飼料成分見表1。胰島素檢測試劑盒，美國R & D 公司；SYBRRGreen QPCR Master Mix，美國Roche 公司；cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，日本Takara 公司；PCR 引物由金斯瑞生物科技有限公司合成；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

表1 飼料營養(yǎng)成分（%）Table 1 Ingredients of the purified diets （%）

1.2 主要儀器與設(shè)備

ACCUTE TBA-40FR 全自動生化分析儀，日本Toshiba 公司；Nanodrop 2000 核酸濃度測定儀，美國Thermo 公司；ABI 7500 system 實時熒光定量PCR 儀，美國ABI 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物實驗設(shè)計 C57BL/6J 小鼠在浙江大學(xué)動物實驗中心喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為12 h 光暗交替，環(huán)境溫度為（23±3）℃，相對濕度為55%～60%。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將其隨機分為3 組，每組10 只，組別分別設(shè)計為：低脂（LFD）對照組：飼喂含10%脂肪的低脂飼料；高脂（HFD）對照組：飼喂含45%脂肪的高脂飼料；櫻桃花色苷（SWCN）處理組：飼喂含45%脂肪的高脂飼料，并每天給與小鼠灌胃櫻桃花色苷，劑量為100 mg/kg。LFD 和HFD 組灌胃等量生理鹽水。實驗進行14 周，每周稱量體重一次，實驗期間小鼠自由進食和飲水，每3 d 記錄一次攝食量和飲用水量。實驗最后1 d 將小鼠禁食12 h 后稱量體重，眼眶取血后將小鼠進行頸椎脫臼處死，快速摘取肝臟組織，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存。血液樣品經(jīng)2 500×g 離心15 min 后分離得到血清。

1.3.2 口服葡萄糖耐量實驗 （Oral glucose tolerance test，OGTT） 在實驗進行到第12 周時，每組隨機選取6 只小鼠，禁食12 h 后給小鼠灌胃葡萄糖（2 g/kg），并分別在0，30，60，90，120 min 時通過尾靜脈取血，以羅氏血糖儀測定血糖水平。應(yīng)用Graphpad Prism 7.0 計算OGTT 曲線下面積（AUC）值。

1.3.3 胰島素耐量實驗 （insulin tolerance test，ITT） OGTT 實驗完成3 d 后，每組隨機選取6 只小鼠，禁食4 h 后通過腹腔注射胰島素（0.5 U/kg），并分別在0，30，60，90，120 min 時通過尾靜脈取血，測定血糖水平。應(yīng)用Graphpad Prism 7.0 計算ITT 曲線下面積（AUC）值。

1.3.4 血清生化指標測定 血清葡萄糖含量利用東芝全自動生化分析儀進行測定，Elisa 法檢測血清中胰島素水平，并計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）和胰島素敏感指數(shù)（HOMA-IS），如式（1）和式（2）所示。

1.3.5 實時熒光定量PCR 檢測肝臟中糖代謝相關(guān)基因的差異表達水平 采用Trizol 裂解法從肝臟中提取總RNA，并使用NanoDrop 2000 測定RNA 濃度和純度。取1 μg RNA 利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用SYBR Green QPCR Master Mix 在ABI 7500 PCR 儀進行實時熒光定量PCR。引物序列如下：IRS2 （正向）：5′-GAG GACTTATTCCCTAACCACG-3′，IRS2 （反向）：5′-GAGAGGCGACCTGAACTACC-3′[17]；G6PC （ 正向）：5′-TCAACCTCGTCTTCAAGTGGATT-3′，G6PC （反向）：5′-GCTGTAGTAGTCGGTGTCCA GGA-3′[18]；PEPCK （正向）：5′-TGCGGATCATGA CTCGGATG-3′，PEPCK （反向）：5′-AGGCC CAGTTGTTGACCAAA-3′[19]。

PCR 反應(yīng)程序設(shè)置如下：50 ℃，3 min；95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，60 s，持續(xù)31 個循環(huán)；95℃，60 s；50 ℃，20 s；95 ℃，20 s。以β-actin （正向：5′-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3′，反向：5′-ATGCCACAGGATTCCATACC-3′） 為內(nèi)參基因。各目標基因的相對表達量根據(jù)2-△△Ct計算方法計算得出。

1.3.6 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），用Duncan 多重比較進行組間差異分析，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標準差”。P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 櫻桃花色苷對小鼠體重及攝食量的影響

各組小鼠的初始體重不存在差異（圖1a），經(jīng)過14 周的高脂飲食誘導(dǎo)后，HFD 組小鼠體重增長（27.82±2.62）g，最終體重為（46.76±3.05）g，是LFD組小鼠體重（29.44±1.92）g 的1.59 倍，出現(xiàn)明顯肥胖（圖1b，1c）。與HFD 組相比，膳食櫻桃花色苷處理組（SWCN）小鼠的體重（37.13±2.09）g 顯著低于HFD 組（圖1b）。此外，在HFD 組和SWCN 組之間不存在食物或熱量攝入的差異（圖1d，1e）。

圖1 櫻桃花色苷對小鼠體重和攝食量的影響Fig.1 Effects of sweet cherry anthocyanins on the body weight and food intake of mice

2.2 櫻桃花色苷對小鼠葡萄糖和胰島素耐受性的影響

如圖2a 所示，SWCN 組小鼠在0，60，90，120 min 的血糖水平顯著高于LFD 組，低于HFD 組。SWCN 組AUC 值與HFD 組相比顯著減小，然而沒有恢復(fù)到LFD 組的水平（圖2b）。如圖2c 所示，SWCN 組小鼠在30，60，90，120 min 的血糖水平顯著高于LFD 組，而低于HFD 組小鼠。SWCN 組AUC 值低于HFD 組，高于LFD 組 （圖2d）。由OGTT 和ITT 結(jié)果可知SWCN 組小鼠的葡萄糖變化水平與恢復(fù)速度雖弱于LFD 組但明顯優(yōu)于HFD 組。

圖2 櫻桃花色苷對葡萄糖耐量和胰島素耐量的影響Fig.2 Effects of sweet cherry anthocyanins on glucose tolerance and insulin tolerance

2.3 櫻桃花色苷對肥胖小鼠空腹血糖、胰島素、胰島素敏感指數(shù)和胰島素抵抗指數(shù)的影響

如圖3所示，HFD 組與LFD 相比，小鼠空腹血糖、胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)顯著升高，胰島素敏感指數(shù)降低，而膳食櫻桃花色苷能夠顯著降低高脂喂養(yǎng)小鼠的血糖、胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)，提高小鼠的胰島素敏感指數(shù)。

圖3 櫻桃花色苷對葡萄糖和胰島素含量及胰島素抵抗指數(shù)和敏感指數(shù)的影響Fig.3 Effects of SWCN on serum glucose and insulin，HOMA-IR and HOMA-IS

2.4 櫻桃花色苷對小鼠糖代謝基因mRNA 表達的影響

與HFD 組相比，膳食SWCN 顯著下調(diào)PEPCK 基因轉(zhuǎn)錄水平，是HFD 組小鼠的0.6 倍，LFD 組小鼠的1.4 倍 （圖4a）；HFD 組小鼠肝臟G6PC 轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，是低脂對照組小鼠的3.47 倍（圖4b），膳食SWCN 后小鼠G6PC 基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，是HFD 組小鼠的0.56 倍，是LFD 組小鼠1.96 倍；膳食SWCN 顯著上調(diào)IRS2基因轉(zhuǎn)錄水平，是HFD 組小鼠的1.86 倍，是LFD組小鼠的0.67 倍（圖4c）。

圖4 櫻桃花色苷對肝臟糖代謝基因表達的影響Fig.4 Effects of SWCN on the genes involved in glucose metabolism in livers

3 討論

大量研究表明花色苷具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗病毒和降脂等[6]，然而關(guān)于櫻桃花色苷是否具有降低血糖的生物功效尚存在分歧。本課題以高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠為模型，研究櫻桃花色苷對高血糖和胰島素抵抗等肥胖并發(fā)癥的改善作用，明確櫻桃花色苷的糖代謝調(diào)節(jié)功能，并初步探明其作用機制。

機體內(nèi)血糖的穩(wěn)定是糖代謝處于動態(tài)平衡的結(jié)果。OGTT 是評估糖代謝功能的常用方法?？诜咸烟呛蟮难?時間變化曲線，依賴于腸道對葡萄糖的吸收率和肝臟對葡萄糖的代謝率。研究表明，糖尿病患者口服葡萄糖后，肝臟對葡萄的吸收利用率下降會導(dǎo)致大部分葡萄糖直接進入體循環(huán)，加之肝臟中葡萄糖的合成不能被抑制，OGTT響應(yīng)值會大幅降低[20]。本實驗結(jié)果顯示，肥胖小鼠對血糖的響應(yīng)程度較弱，而膳食SWCN 組小鼠對OGTT 響應(yīng)度明顯提升。本實驗研究結(jié)果提示膳食SWCN 對肥胖小鼠的糖代謝紊亂具有顯著的改善作用，且SWCN 對肝臟糖代謝功能具有重要意義。

胰島素是由胰臟的胰島β 細胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素，它能夠促進全身組織細胞對葡萄糖的攝取和利用，促進糖原合成，抑制糖異生和糖原分解，使血糖降低，從而調(diào)節(jié)糖代謝，是機體內(nèi)唯一能夠降低血糖的激素。若外周組織細胞對胰島素的敏感性下降，胰島素信號傳導(dǎo)途徑發(fā)生障礙，機體就會出現(xiàn)胰島素抵抗狀態(tài)[21-22]。ITT 是一種簡單、快速而又安全、可靠地評估胰島素抵抗的方法。本實驗通過給小鼠注射胰島素后發(fā)現(xiàn)HFD 組小鼠的血糖水平對胰島素的敏感性明顯弱于LFD組，提示肥胖小鼠的胰島素敏感性降低，呈現(xiàn)胰島素抵抗狀態(tài)。膳食SWCN 組小鼠的胰島素響應(yīng)水平雖弱于LFD 組，但已顯著強于HFD 組?？崭挂葝u素水平、胰島素抵抗指數(shù)和胰島素敏感指數(shù)也是評價胰島素抵抗水平的重要指標。本研究結(jié)果表明，與HFD 組小鼠相比，膳食SWCN 組小鼠的胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)顯著降低，胰島素敏感指數(shù)顯著上升。該研究結(jié)果提示膳食SWCN能夠改善肥胖小鼠的胰島素抵抗狀態(tài)，提高其胰島素敏感性。

肝臟是調(diào)節(jié)血糖的主要器官。當血糖濃度升高時，肝臟能夠利用血糖合成糖原（肝糖原約占肝重的5%），同時肝臟能夠?qū)⑦^多的血糖轉(zhuǎn)變?yōu)橹?，以及通過加速磷酸戊糖循環(huán)等，來提高葡萄糖的利用度，維持血糖濃度的穩(wěn)定。當血糖濃度降低時，肝臟通過分解肝糖原，加強糖異生作用生成葡萄糖，從而提高血糖濃度，其中糖異生途徑是肝臟補充葡萄糖或恢復(fù)糖原含量的重要途徑[23-24]。糖異生（Gluconeogenesis）是指非糖類前體物質(zhì)，如甘油、乳酸、糖氨基酸和烯丙醇等轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟腔蛱窃倪^程。體內(nèi)近一半葡萄糖的消耗和主要器官的能量供應(yīng)都依賴于糖異生作用。G6PC 和PEPCK 是糖異生途徑的關(guān)鍵酶[25]。

G6PC 特異性存在于肝臟組織中，主要分布在肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。G6PC 主要功能結(jié)構(gòu)為轉(zhuǎn)運亞基P46 和催化亞基P36。P46 為葡萄糖-6-磷酸的特異轉(zhuǎn)運體，能夠?qū)麧{中的葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；P36 為非特異性磷酸水解酶，能夠?qū)⑵咸烟?6-磷酸水解為磷酸和葡萄糖[26-27]。由此可見，G6PC 在水解葡萄糖-6-磷酸為葡萄糖的過程中發(fā)揮主要作用，其在肝臟組織中的表達量及活性的變化將直接影響肝臟內(nèi)葡萄糖的產(chǎn)生。PEPCK 是催化糖異生第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，與血糖控制有直接的相關(guān)性。抑制PEPCK 的表達能夠增強肝臟、肌肉及脂肪組織胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平，下調(diào)肝臟糖異生通路中關(guān)鍵基因FoxO1、HNF4α 和PGC-1α 的表達及G6PC 的轉(zhuǎn)錄，從而極大改善高血糖和高胰島素血癥[28]。本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠肝臟中PEPCK 和G6PC 的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，該結(jié)果提示肥胖小鼠的糖異生作用加強，葡萄糖的合成量增加，這可能是導(dǎo)致血糖濃度升高與胰島素抵抗的機制之一。與HFD 組小鼠相比，SWCN 組小鼠的PEPCK 和G6PC 的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，該結(jié)果表明SWCN 能夠下調(diào)糖異生關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制糖異生途徑。IRS2是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要信號蛋白。IRS2在肝臟內(nèi)特異性高表達，其表達量在外源干涉下的變化較為顯著。IRS2 能夠有效促進肝糖原合成以及抑制肝臟中葡萄糖的轉(zhuǎn)運，其功能異常會誘發(fā)胰島素抵抗（主要是肝臟胰島素抵抗），并減弱肝臟對葡萄糖轉(zhuǎn)運的抑制作用，導(dǎo)致機體的糖代謝障礙[29-30]。與前述研究結(jié)果一致，本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠肝臟中IRS2 的基因轉(zhuǎn)錄水平與LFD 組相比顯著下降，并伴隨發(fā)生胰島素抵抗，而膳食SWCN 可以促進肝IRS2 基因的轉(zhuǎn)錄表達，從而改善胰島素抵抗，降低血糖。

4 結(jié)論

櫻桃花色苷通過上調(diào)肝臟胰島素信號通路中IRS2 的表達，來促進肝臟對葡萄糖的攝取和利用，同時通過抑制PEPCK 和G6PC 的轉(zhuǎn)錄水平來減少糖異生，從而降低肥胖小鼠的血糖及胰島素的含量水平，增強其糖耐量和胰島素敏感性，改善胰島素抵抗狀態(tài)。本研究闡明了櫻桃花色苷的降糖活性，為櫻桃作為降糖和預(yù)防胰島素抵抗的功能性農(nóng)產(chǎn)品的開發(fā)和深加工及櫻桃產(chǎn)業(yè)鏈的延伸，提高櫻桃產(chǎn)業(yè)的附加值，提供了理論基礎(chǔ)。