張子葉，閆曉彤，王曄茹，丁 甜，王 軍，王 翔，董慶利，方 婷，李長城*

（1 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 福州 350002 2 國家食品安全風(fēng)險評估中心 北京 100022 3 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州 310030 4 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東 青島 266109 5 上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院 上海 200093）

預(yù)測微生物學(xué)模型以數(shù)學(xué)和計算機語言為基礎(chǔ)，描述食品中微生物的生長、失活規(guī)律，是微生物定量風(fēng)險評估的基礎(chǔ)[8-9]。目前，國內(nèi)外已有關(guān)于生鮮豬肉[10-11]、廣式臘腸[12]、烤鴨[13]、牛奶[14]等畜禽產(chǎn)品中金黃色葡萄球菌生長預(yù)測模型的研究，而未見有關(guān)醬鴨制品中預(yù)測微生物學(xué)模型的報道，且上述文獻中關(guān)于金黃色葡萄球菌的生長預(yù)測建模均未考慮食品基質(zhì)中背景微生物對其生長的影響。文獻研究表明，食品中微生物的生長除受環(huán)境因子（溫度、水分活度、pH 值）的影響外，還可能受其它種類微生物的制約[15-17]，構(gòu)建基于菌間競爭效應(yīng)的相互作用模型可以更準確地描述目標微生物的生長。另外，從數(shù)值分析的角度，上述文獻中金黃色葡萄球菌模型的構(gòu)建均基于傳統(tǒng)的兩步法，相比于該領(lǐng)域近年來提出的一步法，其累積誤差更大[18]。使用一步法建模，將可縮小累積誤差，提高模型準確度[19]。

本研究擬研究醬鴨中金黃色葡萄球菌單獨生長或與背景菌群共同存在時的生長特性，采用一步法構(gòu)建醬鴨中金黃色葡萄球菌與背景菌群的生長預(yù)測模型，旨在為有效監(jiān)控以醬鴨為代表的熟肉制品中金黃色葡萄球菌的風(fēng)險評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬鴨，福州山姆會員超市。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）菌株（CICC10786、CICC10787），中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。

利福平（Rifampin，Rif），北京索萊寶科技有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（Tryptose soya agarmedium，TSA）、腦-心浸出液肉湯（Brain heart infusion broth，BHI），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；蛋白胨粉，杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Bag Mixer-400 均質(zhì)拍打器，法國Interscience公司；H-1850R 高速冷凍離心機，湖南相儀實驗室儀器有限公司；SHP-250 細菌生化培養(yǎng)箱、LDZX-75KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；AIRTECH 生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；KB115 低溫恒溫箱，德國BINDER公司；Whirl-Pak-207 mL 無菌均質(zhì)袋，美國Nasco公司；VORTEX-5 漩渦混合器，上海習(xí)仁科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 金黃色葡萄球菌培養(yǎng)與接種菌液的制備參照Fang 等[20]的方法，使用利福平逐步誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌，獲得對利福平耐受質(zhì)量濃度為100 mg/L 的抗性菌株，并劃線于利福平添加質(zhì)量濃度為100 mg/L 的TAS 平板（TSA/R）培養(yǎng)，再于8 ℃保存。每次試驗前，挑取2 株金黃色葡萄球菌的單菌落，分別轉(zhuǎn)移至10 mL 利福平添加質(zhì)量濃度為100 mg/L 的BHI 中，于37 ℃培養(yǎng)18～20 h。菌液于4 ℃條件下5 000 r/min 離心15 min，去掉上清液，菌體經(jīng)無菌蛋白胨水（質(zhì)量分數(shù)0.1%）清洗2次后，分別懸浮于5 mL 蛋白胨水中。將2 株金黃色葡萄球菌懸浮液按1∶1 的體積比混合，梯度稀釋至～4.5 lg（CFU/mL），備用。

1.3.2 背景菌株分離及接種菌液的制備 在無菌條件下，稱?。?±0.05）g 醬鴨樣品置于均質(zhì)袋中，加入20 mL 0.1%蛋白胨水，于均質(zhì)拍打器中正、反兩面各拍打2 min，均質(zhì)液經(jīng)梯度稀釋后涂布于TSA 平板上，并于37 ℃培養(yǎng)18～24 h。從TSA 平板上挑取不同形態(tài)的典型菌落，經(jīng)連續(xù)分離純化后獲得3 株優(yōu)勢背景菌株 （編號BG-1、BG-2、BG-3）。背景菌株經(jīng)TSA 平板劃線后保存于8 ℃培養(yǎng)箱。每次試驗前，挑取單菌落接種至10 mL BHI 溶液中，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，菌液于4 ℃條件下離心（5 000 r/min）15 min，菌體再經(jīng)無菌蛋白胨水（0.1%）清洗2 次后，分別懸浮于5 mL 蛋白胨水中。3 株背景菌液等量混合后，梯度稀釋至～5.5 lg（CFU/mL），備用。

（7）混煮。將過濾好的膠液加入姜汁和糖液混合液中，加熱并充分攪拌均勻，在此基礎(chǔ)上加入檸檬酸和β-環(huán)狀糊精，繼續(xù)加熱，在微沸騰的狀態(tài)下攪拌1 min。

1.3.3 樣品接種 將醬鴨去皮、去骨，抽真空（2 kPa）包裝，并于115 ℃殺菌15 min，以消除樣品中的背景菌群。冷卻后在無菌環(huán)境下將其切分，稱?。?±0.05）g 若干份樣品，裝入無菌均質(zhì)袋中。將稱取的樣品分為兩大組，其中一組樣品單獨接種上述已制備的金黃色葡萄球菌懸浮液 （0.1 mL），另一組樣品混合接種上述已制備的金黃色葡萄球菌和背景菌群懸浮液（各0.1 mL）。兩組接種方式樣品中，金黃色葡萄球菌的濃度均約102.5～103.0CFU/g，混合接種的樣品中背景菌群的濃度約103.5～104.0CFU/g。

1.3.4 生長實驗與取樣計數(shù) 將接種后的樣品分別置于10，12，16，20，25，30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按預(yù)設(shè)時間間隔取樣，以測定其生長濃度。取樣時，向樣品袋中加入20 mL 無菌蛋白胨水，并置于均質(zhì)拍打器中正、反兩面各拍打2 min。根據(jù)實際情況，將均質(zhì)液經(jīng)梯度稀釋，并吸取合適稀釋度下的均質(zhì)液0.1 mL 或1 mL 涂布于TSA/R[20]培養(yǎng)基或TSA 培養(yǎng)基，其中，TSA/R 平板用于測定金黃色葡萄球菌菌落數(shù)，TSA 平板用于測定背景菌菌落數(shù)。將涂布后的平板置于37 ℃條件下培養(yǎng)，24 h 后計數(shù)，單位為lg（CFU/g）或ln（CFU/g）。所有生長試驗均至少獨立重復(fù)2 次。

1.4 生長模型

1.4.1 醬鴨中金黃色葡萄球菌的非競爭生長 金黃色葡萄球菌接種至滅菌的醬鴨樣品單獨培養(yǎng)時，因不受其它微生物的影響，其生長行為可用式（1）所示的微分方程進行描述，式（1）即Huang 模型[21]，可用于包含遲滯期、對數(shù)期和穩(wěn)定期的微生物生長描述。

式中，Y、Ymax——t 時刻和穩(wěn)定期的細菌濃度，ln（CFU/g）；μmax——細菌最大比生長速率（h-1）；λ——遲滯期（h）。

溫度對醬鴨中金黃色葡萄球菌最大比生長速率的影響可用Huang Square-Root（HSR）模型[22]予以描述，其表達式如式（2）所示；最大比生長速率與遲滯期的關(guān)系可用式（3）表示。

式中，T——環(huán)境溫度（℃）；Tmin——細菌的最低生長溫度（℃）；a、A 和m——回歸系數(shù)。

1.4.2 醬鴨中金黃色葡萄球菌與背景菌群的競爭生長 當背景菌群與金黃色葡萄球菌混合接種于醬鴨樣品共同生長時，由于前者本身是醬鴨樣品中的優(yōu)勢分離菌株，一般更能適應(yīng)樣品的環(huán)境條件。另外，前者的初始濃度高于后者的初始濃度，由生長數(shù)據(jù)的直觀體現(xiàn)可知，醬鴨樣品中金黃色葡萄球菌與背景菌群共同生長時，未能完全表現(xiàn)其生長潛力，可能受到背景菌群的抑制作用。因此，本文假設(shè)醬鴨中金黃色葡萄球菌的生長受到背景菌群的單向抑制，其生長規(guī)律可由式（4）（根據(jù)Lotka-Volterra（LV）方程演化而來）表示[23-24]；另外，背景菌群的生長受金黃色葡萄球菌的影響很小，忽略競爭效應(yīng)和遲滯期，其生長規(guī)律可由式（5）表示。

式中，S 和B——金黃色葡萄球菌（S.aureus）和背景菌群 （Background microflora）；Y、λ、μmax與式 （1） 相同；Ymax——醬鴨樣品的最大載菌量，ln（CFU/g）。式（4）中的α×exp（YB）一項代表背景菌群對金黃色葡萄球菌的抑制效應(yīng)，α——抑制系數(shù)。

競爭生長中，溫度對金黃色葡萄球菌和背景菌群生長速率的影響仍可由HSR 模型來描述，分別如式（6）、式（7）所示。

式中，下標S 和B——金黃色葡萄球菌和背景菌群；Tmin和a 與式（2）相同。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

將2 次獨立試驗下，不同恒定溫度對應(yīng)的試驗數(shù)據(jù)合并成數(shù)據(jù)集{Y}，通過一步法[18，24]估計細菌的生長動力學(xué)參數(shù)。若將初級模型和二級模型中待求的參數(shù)和系數(shù)記為{P}，則醬鴨中金黃色葡萄球菌單獨接種生長時，{P}={a，Tmin，A，m，Ymax}；金黃色葡萄球菌和背景菌群混合接種生長時，{P}={aS，aB，Tmin，Tmin，B，A，m，Ymax，α}。本研究數(shù)值分析過程通過MATLAB 2018 軟件編程來實現(xiàn)，分析過程中，采用四階龍格-庫塔法求解微分方程（1）或（4）、（5），獲得細菌生長濃度的預(yù)測值{}，再結(jié)合最小二乘法求解預(yù)測值{}與實測值{Y}之間的最小殘差平方和（RSS）[25]，其表達式如式（8），式中，n——總觀察值的數(shù)量。當RSS 最小時，對應(yīng)的{P}即為所求。

1.6 模型驗證

通過另設(shè)不同溫度條件下的生長試驗，對模型和參數(shù)進行驗證，采用均方根誤差（RMSE）衡量預(yù)測值與觀測值之間的差異，其表達式如式（9）。式中，n——觀測值總數(shù)；p——模型中參數(shù)數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 動力學(xué)參數(shù)估計與模型構(gòu)建

2.1.1 金黃色葡萄球菌單獨接種至醬鴨中的非競爭生長 本研究將金黃色葡萄球菌單獨接種至已滅菌處理的醬鴨樣品中，以考察其不受背景菌群干擾時的生長狀況。試驗時，醬鴨樣品中金黃色葡萄球菌的初始接種濃度約為2.5～3.0 lg（CFU/g）。10 ℃貯藏時，在觀測時間內(nèi)（288 h），醬鴨樣品中金黃色葡萄球菌的數(shù)量未見有顯著增長（圖1中未顯示）。在12，16，20，25，30 ℃貯藏時，醬鴨樣品中金黃色葡萄球菌的生長良好，總體呈S 型增長趨勢；在觀測時間內(nèi)，除12 ℃貯藏條件下的最大生長濃度偏低以外，其余溫度對應(yīng)的生長曲線均包含滯后期、對數(shù)期及穩(wěn)定期3 個階段（圖1）。因此，本研究僅將12，16，20，25，30 ℃條件下醬鴨樣品中金黃色葡萄球菌的生長數(shù)據(jù)合并，再開展建模分析。

圖1 醬鴨中金黃色葡萄球菌生長曲線一步法擬合分析Fig.1 One-step analysis of growth curves of S.aureus in sauced duck

通過一步法對12～30 ℃條件下醬鴨中金黃色葡萄球菌的生長數(shù)據(jù)（共計151 個數(shù)據(jù)點）進行分析，構(gòu)建包含初級模型（Huang 模型）和二級模型（HSR 模型）的組合模型，求解最低生長溫度、最大生長濃度、二級模型系數(shù)等參數(shù)，即{P}={a，Tmin，A，m，Ymax}，其結(jié)果如表1所示。

由表1可知，構(gòu)建的Huang-HSR 模型的均方根誤差（RMSE）為0.47 lg（CFU/g），5 個生長參數(shù)的估計值均達到顯著水平（P＜0.05）。通過一步法估計醬鴨中金黃色葡萄球菌的最大生長濃度為21.63 ln（CFU/g），或9.39 lg（CFU/g），最低生長溫度為9.28 ℃，其95%置信區(qū)間為 [8.95 ℃，9.61℃]。醬鴨中金黃色葡萄球菌最低生長溫度的估計值及其置信區(qū)間的上限均略低于10 ℃，然而這并不與前述提及的10 ℃貯藏條件下，金黃色葡萄球菌的數(shù)量未見顯著增長的現(xiàn)象相矛盾。本研究中，10 ℃條件下的測試時長（288 h）相對較短，而將a、A 和m 的估計值 （0.076，0.824 和1.301） 代入式（2）、式（3）可計算得10 ℃對應(yīng)的遲滯期約為2 000 h，或83 d，這遠大于醬鴨產(chǎn)品的貨架期，因此，可以認為10 ℃條件下醬鴨中金黃色葡萄球菌不能正常生長。鄒彥桐[12]、宇盛好等[13]、張微等[1]分別研究了廣式燒臘、烤鴨和鹽水牛肉中金黃色葡萄球菌的生長規(guī)律，其研究表明，10 ℃貯藏條件下，金黃色葡萄球菌仍能生長，這可能與食品基質(zhì)不同有關(guān)，本研究所用的醬鴨樣品在鹵制加工過程中吸收的辛香料或其它添加成分可能對金黃色葡萄球菌的生長具有抑制作用。將一步法求解的參數(shù){P}代入式（1）、式（3），可正向計算出各試驗溫度條件下醬鴨樣品中金黃色葡萄球菌生長的預(yù)測曲線（圖1），由圖1可知，模型預(yù)測值與試驗觀測值相近，說明所構(gòu)建的Huang-HSR 模型能夠較準確地描述醬鴨中金黃色葡萄球菌的生長。

表1 醬鴨中金黃色葡萄球菌非競爭生長一步法分析結(jié)果Table 1 One-step analysis of non-competitive growth of S.aureus in sauced duck

2.1.2 金黃色葡萄球菌與背景菌群混合接種至醬鴨中的競爭生長 將金黃色葡萄球菌與分離的優(yōu)勢背景菌群混合接種至無菌醬鴨中，以考察兩者之間的競爭效應(yīng)。不同培養(yǎng)溫度（12～30 ℃）條件下，兩者的生長曲線如圖2所示?；旌辖臃N生長試驗中，金黃色葡萄球菌和背景菌群的初始濃度分別為2.5～3.0 lg（CFU/g）和3.5～4.0 lg（CFU/g）。由圖2可知，各溫度條件下，樣品中背景菌群生長良好，且與金黃色葡萄球菌相比，背景菌群的遲滯期不明顯或可忽略不計，接種后即可快速進入對數(shù)生長期，當其生長濃度達到約10 lg（CFU/g）時，進入穩(wěn)定期，這表明背景菌群更能適應(yīng)醬鴨樣品的環(huán)境，其生長受金黃色葡萄球菌的影響較小。同時，如圖2所示，金黃色葡萄球菌的生長曲線具有顯著的遲滯期，且通過圖形的直觀對比可知，進入對數(shù)生長期之后，其生長速率均不同程度地小于背景菌群的生長速率，其生長濃度也始終低于背景菌群的生長濃度；當背景菌群的生長進入穩(wěn)定期后，金黃色葡萄球菌的生長速率顯著降低，其數(shù)量隨著時間的延長而緩慢增長。因此，在混合接種的醬鴨樣品中，金黃色葡萄球菌的生長受到背景菌群的抑制，且兩者之間的競爭關(guān)系主要表現(xiàn)為后者對前者的單向抑制。

圖2 醬鴨中金黃色葡萄球菌與背景菌群競爭生長一步法擬合分析Fig.2 One-step analysis of the competitive growth curves of S.aureus and background microflora in sauced duck

通過一步法對醬鴨中金黃色葡萄球菌和背景菌群的競爭生長數(shù)據(jù)（共計308 個數(shù)據(jù)點）進行分析，構(gòu)建包含競爭模型和二級模型的組合模型，求解最大生長濃度、最低生長溫度、二級模型系數(shù)和抑制效應(yīng)系數(shù)等參數(shù)，即{P}={aS，aB，Tmin，Tmin，B，A，m，Ymax，α}，其結(jié)果如表2所示。由表2可知，構(gòu)建的LV-HSR 模型均方根誤差（RMSE）為0.51 lg（CFU/g），8 個參數(shù)的估計值均達到顯著水平（P＜0.05）。通過一步法估計的金黃色葡萄球菌和背景菌群的最低生長溫度分別為9.40 ℃和7.80 ℃，其中，關(guān)于金黃色葡萄球菌最低生長溫度的預(yù)測與前述非競爭生長試驗中預(yù)測的最低生長溫度（9.28 ℃）幾乎一致；估計的背景菌群的最大生長濃度 （即醬鴨樣品的最大載菌量） 為22.87 ln（CFU/g），或9.93 lg（CFU/g），與前述非競爭生長試驗中預(yù)測的金黃色葡萄球菌的最大生長濃度21.63 ln（CFU/g），或9.39 lg（CFU/g）相接近；此外，背景菌群對金黃色葡萄球菌的抑制效應(yīng)系數(shù)為0.556。

表2 醬鴨中金黃色葡萄球菌與背景菌群競爭生長一步法分析結(jié)果Table 2 One-step analysis of competitive growth of S.aureus and background microflora in sauced duck

2.1.3 遲滯期及生長速率比較分析 圖3比較了溫度對單獨接種和混合接種狀態(tài)下金黃色葡萄球菌的遲滯期及生長速率的影響。由圖3a 可以看出，在同等溫度條件下，非競爭狀態(tài)下的金黃色葡萄球菌其遲滯期要低于混合接種狀態(tài)下的金黃色葡萄球菌，表明背景菌群對金黃色葡萄球菌存在抑制效應(yīng)。圖3b 再次表明，金黃色葡萄球菌與背景菌群競爭生長過程中，前者的生長速率小于后者的生長速率，同時競爭狀態(tài)與非競爭狀態(tài)下的金黃色葡萄球菌的生長速率無顯著差異，如前所述，當背景菌群的生長進入穩(wěn)定期后，金黃色葡萄球菌的生長速率會顯著降低，其數(shù)量隨時間的延長而緩慢增長。圖3b 還將本研究中金黃色葡萄球菌的生長速率與相關(guān)文獻報道結(jié)果進行對比。當溫度大于15 ℃時，本研究結(jié)果與廣式燒臘[12]、烤鴨[13]、鹽水牛肉[1]中金黃色葡萄球菌的生長速率相近，然而當溫度低于15 ℃時，其生長速率低于上述文獻報道結(jié)果。產(chǎn)生這種差異的原因有二，其一，正如前所述，金黃色葡萄球菌在醬鴨上與上述文獻報道的產(chǎn)品中的生長本身存在差異；其二，本研究選擇的二級模型（式2）和上述文獻選擇的二級模型[26][=a（T-T0）]不同，前者中Tmin為細菌的實際最低生長溫度，而后者中T0為表觀最低生長溫度，一般而言，Tmin＞T0[27]。

圖3 金黃色葡萄球菌遲滯期（a）及生長速率（b）的比較分析Fig.3 Comparative analysis of lag time （a） and growth rate （b） of S.aureus

2.2 模型驗證

2.2.1 非競爭模型驗證 本研究構(gòu)建醬鴨中金黃色葡萄球菌的非競爭生長模型時，因10 ℃條件下觀測期內(nèi)未見顯著生長，僅選取12～30 ℃的數(shù)據(jù)用于一步法分析，而10 ℃條件下的數(shù)據(jù)仍可用于模型驗證，圖4表明模型預(yù)測值與試驗觀測值相接近，RMSE 為0.16 lg（CFU/g）。此外，本研究還通過另設(shè)的恒溫條件下醬鴨中金黃色葡萄球菌的生長試驗（20 ℃） 來驗證模型和所求解參數(shù)的準確性，由圖4可知，模型的預(yù)測值與觀測值的差異較小，其RMSE 為0.56 lg（CFU/g），表明一步法構(gòu)建的非競爭模型可準確地預(yù)測無菌醬鴨中金黃色葡萄球菌的生長。

圖4 非競爭模型驗證：不同溫度條件下醬鴨中金黃色葡萄球菌的生長Fig.4 Validation of the non-competitive model：growth curves of S.aureus in sauced duck at different temperatures

2.2.2 競爭模型驗證 本研究通過另設(shè)13 ℃和20 ℃條件下醬鴨中金黃色葡萄球菌與背景菌群混合接種的生長試驗來驗證所構(gòu)建的競爭模型及其參數(shù)的準確性（圖5）。圖5a 和圖5b 分別比較了13 ℃和20 ℃條件下金黃色葡萄球菌和背景菌群競爭生長時，模型預(yù)測值和實測值之間的差異，由圖可知，其差異較小，均方根誤差（RMSE）分別為0.49 lg（CFU/g）和0.63 lg（CFU/g），表明所構(gòu)建的模型可較為準確地描述醬鴨中金黃色葡萄球菌與背景菌群的競爭生長。

圖5 競爭模型驗證：13 ℃（a）和20 ℃（b）條件下醬鴨中金黃色葡萄球菌和背景菌群的生長Fig.5 Validation of the competitive model：growth curves of S.aureus and background microflora in sauced duck at 13 ℃（a） and 20 ℃（b）

3 結(jié)論

本文考察了不同溫度條件下，金黃色葡萄球菌單獨接種或與背景菌群混合接種至醬鴨中的生長特性，并通過一步法構(gòu)建包含初級模型（非競爭或競爭模型）和二級模型的組合模型；無菌醬鴨樣品中單獨接種金黃色葡萄球菌時，由非競爭模型估計的金黃色葡萄球菌的最低生長溫度為9.28℃，最大生長濃度為9.39 lg（CFU/g）；與非競爭狀態(tài)相比，金黃葡萄球菌與背景菌群混合接種時的遲滯期略長，最大比生長速率無顯著差異，然而當背景菌群的生長進入穩(wěn)定期時，金黃色葡萄球菌的生長速率顯著降低，表現(xiàn)出抑制效應(yīng)（抑制效應(yīng)系數(shù)α=0.556）；競爭狀態(tài)下，由競爭模型估計的金黃色葡萄球菌和背景菌群的的最低生長溫度分別為9.40 ℃和7.80 ℃，背景菌群的最大生長濃度為9.93 lg（CFU/g）；驗證試驗表明構(gòu)建的模型能夠較為準確地預(yù)測醬鴨中金黃色葡萄球菌的非競爭生長及其與背景菌群的共同競爭生長。綜上所述，一步法是預(yù)測微生物學(xué)建模的有效分析方法，本文所構(gòu)建的預(yù)測模型可用于描述醬鴨中金黃色葡萄球菌和背景菌群的生長，為相關(guān)產(chǎn)品中金黃色葡萄球菌的定量風(fēng)險評估及貨架期的預(yù)測提供理論支持。