趙明慧，石 巖，吳 微，張紫騰，程冰冰，張新穎，王雅妹，秦 巖

(1.河北大學附屬醫(yī)院，河北 保定 071000；2.河北大學，河北 保定 071000)

血管新生是腫瘤運輸營養(yǎng)物質(zhì)得以迅速生長和遠端轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[1-2]。腫瘤血管新生是一個復(fù)雜調(diào)控的過程，其主要受到由腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、細胞外基質(zhì)、免疫細胞、成纖維細胞及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)等各種生長因子共同構(gòu)成的局部腫瘤微環(huán)境的影響[3-5]。其中內(nèi)皮細胞是腫瘤血管新生的基礎(chǔ)，在腫瘤新生的過程中關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是內(nèi)皮細胞功能發(fā)生了變化，導(dǎo)致促增殖基因轉(zhuǎn)錄激活，促凋亡基因沉默，并最終導(dǎo)致Akt等增殖信號通路的活化及細胞遷移進程的啟動，所以內(nèi)皮細胞的增殖與血管新生密切相關(guān)。因此，抑制內(nèi)皮細胞的過度增殖可能成為腫瘤抗血管生成的治療策略。中藥三七性甘、溫，味微苦，具有化瘀止血、活血定痛的功效，其主要成分有人參皂苷Rg1、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和三七皂苷R1(NR1)，NR1具有抗腫瘤生長、增強機體免疫功能等作用[6-9]，但是其抑制腫瘤生長是否與抑制內(nèi)皮細胞增殖有關(guān)尚不明確。本研究初步探討了NR1對內(nèi)皮細胞EAhy926增殖的影響及其可能的作用機制。

1 實驗材料和方法

1.1實驗細胞 EAhy926購于美國ATCC庫，由河北大學附屬醫(yī)院實驗中心常規(guī)保存。

1.2藥物 NR1(MCE公司，樣品批號：80418-24-2，樣品純度≥97.0%)10 mg，使用DMSO溶解原液，儲存濃度為100 mg/mL，過濾后保存于-80 ℃，使用時稀釋為相應(yīng)濃度。

1.3試劑與儀器 高糖DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；胎牛血清FBS購自美國Gemini公司；青霉素和鏈霉素、異丙醇、氯仿、上樣緩沖液、脫脂奶粉、DEPC水、磷酸鹽緩沖液、蛋白裂解液RIPA購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TRIzol購于Invitrogen公司。引物由上海生工公司合成；CyclinD1、PCNA、Bcl-2單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；β-actin 單克隆抗體和二抗購自美國Proteintech 公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；細胞凋亡試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。ABI7300 PCR儀(美國ABI公司)，蛋白電泳儀、酶標儀(美國伯樂公司)，流式細胞儀Calibur(美國BD公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國ThermoFisher公司)，Olympus顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4實驗方法

1.4.1細胞培養(yǎng) 在10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，處于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)EAhy926。

1.4.2細胞活力檢測 實驗分為6組：空白組常規(guī)培養(yǎng)，PDGF-BB組加入 PDGF-BB培養(yǎng)，PDGF-BB+10 μmol/L NR1組、PDGF-BB+20 μmol/L NR1組、PDGF-BB+40 μmol/L NR1組、PDGF-BB+80 μmol/L NR1組分別加入 PDGF-BB和相應(yīng)濃度 NR1培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24 h和48 h時取各組細胞，以2×104/mL的密度、每孔100 μL接種于96孔板中，每組重復(fù)3次。放入37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入含CCK-8溶液的完全培養(yǎng)基150 μL，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h，在波長450 nm處檢測各組各孔的吸光值。

1.4.3細胞凋亡檢測 分組同1.4.2，收集各組細胞，150×g離心5 min，棄上清，預(yù)冷的PBS洗滌3次。用500 μL PBS重懸細胞，按細胞凋亡試劑盒說明書操作加入Annexin V-FITC/PI 雙標記，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，每組重復(fù)3次。

1.4.4細胞中CyclinD1、PCNA、Bcl-2蛋白表達Western blot 檢測 實驗分為3組：對照組常規(guī)培養(yǎng)，PDGF-BB組加入 PDGF-BB培養(yǎng)，PDGF-BB+NR1組加入 PDGF-BB和40 μmol/L NR1培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后取各組細胞，采用蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白并進行定量。每孔加入30 μg進行蛋白分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，室溫封閉2 h。加入兔抗人CyclinD1、PCNA、Bcl-2和β-actin單克隆抗體(體積稀釋比例均為1∶1 000)4 ℃搖床過夜。次日10 min/次洗膜5次后加入二抗(體積稀釋比例為1∶20 000)，孵育1 h。用TBST 10 min/次洗膜5次，使用化學發(fā)光成像儀進行發(fā)光，使用Image J進行灰度掃描分析，將目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參蛋白的灰度值，進行歸一化處理。

1.4.5細胞中CyclinD1、PCNA、Bcl-2 mRNA表達qRT-PCR檢測 實驗分為3組：對照組常規(guī)培養(yǎng)，PDGF-BB組加入 PDGF-BB培養(yǎng)，PDGF-BB+NR1組加入 PDGF-BB和40 μmol/L NR1培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后取各組細胞，根據(jù)Total RNA試劑盒說明書提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后以cDNA為模板，以18 S為內(nèi)參，進行熒光定量PCR。引物序列：CyclinD1上游5’-GCCCGTGAGGCAGAGGCTGC-3’，下游5’-TGGTGAGGACGATTATGGCCC-3’；PCNA上游5’-CATCCCATGGTTCATCGTGGCTGAACT-3’，下游5’-GAAGTAGGTGAAGATGAAGAACAGAAC-3’；Bcl-2 上游5’-ATGGCAACTCTAAAGGATCA-3’，下游5’-GCAACTTGCAGTTCGGGC-3’；18 S上游5’-TGCGAGTACTCAACACCAACA-3’，下游5’-GCATATCTTCGGCCCACA-3’。各組均設(shè)3個復(fù)孔。以2-ΔΔCt法表示各目的基因的相對表達量。

1.5統(tǒng)計學方法 采用Graphad 8.0軟件繪圖并進行統(tǒng)計處理，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1各組內(nèi)皮細胞增殖情況 PDGF-BB組培養(yǎng)24 h和48 h細胞增殖率均明顯高于空白組(P均<0.05)；PDGF-BB+20 μmol/L NR1組、PDGF-BB+40 μmol/L NR1組、PDGF-BB+80 μmol/L NR1組細胞增殖率均明顯低于PDGF-BB組(P均<0.05)，且呈時間和劑量依賴性降低。見表1。

表1 空白組和各干預(yù)組內(nèi)皮細胞增殖率比較

2.2各組內(nèi)皮細胞凋亡情況 空白組、PDGF-BB組和PDGF-BB+10 μmol/L NR1組培養(yǎng)24 h和48 h細胞凋亡率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；PDGF-BB+20 μmol/L NR1組、PDGF-BB+40 μmol/L NR1組、PDGF-BB+80 μmol/L NR1組培養(yǎng)24 h和48 h細胞凋亡率均明顯高于PDGF-BB組(P均<0.05)，且呈時間和劑量依賴性增高。見表2。

表2 空白組和各干預(yù)組內(nèi)皮細胞凋亡率比較

2.3各組內(nèi)皮細胞中CyclinD1、PCNA及Bcl-2蛋白表達情況 與對照組比較，PDGF-BB組CyclinD1、PCNA 蛋白表達量均明顯增高(P均<0.05)，Bcl-2蛋白表達量明顯降低(P<0.05)；與PDGF-BB組比較，PDGF-BB+NR1組CyclinD1、PCNA 蛋白表達量均明顯降低(P均<0.05)，Bcl-2蛋白表達量明顯增高(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組內(nèi)皮細胞中CyclinD1、PCNA及Bcl-2蛋白表達情況

2.4各組內(nèi)皮細胞中CyclinD1、PCNA及Bcl-2 mRNA表達情況 與對照組比較，PDGF-BB組CyclinD1、PCNA mRNA表達量均明顯增高(P均<0.05)，Bcl-2mRNA表達量明顯降低(P<0.05)；與PDGF-BB組比較，PDGF-BB+NR1組CyclinD1、PCNA mRNA表達量均明顯降低(P均<0.05)，Bcl-2mRNA表達量明顯增高(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組內(nèi)皮細胞中CyclinD1、PCNA及Bcl-2 mRNA表達情況

3 討 論

目前治療腫瘤的西藥存在耐藥性和明顯不良反應(yīng)，尋找和探尋抗腫瘤的新型藥物一直是研究的熱點[10-11]。NR1是三七總皂苷中有效活性成分之一，其具有抗動脈粥樣硬化、抑制腫瘤血管新生、提高免疫力等多系統(tǒng)的預(yù)防和治療作用[12-15]。Qin等[16]報道，NR1能通過抑制細胞周期素D2(CCND2)和Y盒結(jié)合蛋白3(YBX3)的表達而發(fā)揮抑制乳腺癌細胞增殖作用。Wang等[17]和Zhu等[18]研究表明，NR1具有保護缺氧缺血神經(jīng)和抗細胞凋亡的作用。Zhao等[19]研究發(fā)現(xiàn)，NR1可通過抑制XIST/miR-221-3p/TRAF6軸減輕低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎性和氧化應(yīng)激反應(yīng)。馮磊等[20]采用尾靜脈注射HL-60細胞方法制備白血病小鼠模型，顯示NR1能通過抑制VEGF表達及PI3K/AKT信號通路磷酸化而發(fā)揮抑制腫瘤細胞侵襲和遷移作用。但是NR1對內(nèi)皮細胞增殖作用的機制研究尚未見報道。因此，本研究通過體外實驗，探討了NR1對內(nèi)皮細胞(EAhy926細胞)增殖的影響及機制。

本研究細胞增殖和凋亡實驗結(jié)果顯示，PDGF-BB可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖；20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的NR1對細胞增殖有明顯抑制作用，可誘導(dǎo)細胞凋亡，且呈劑量依賴性。40 μmol/L的NR1作用24 h后對內(nèi)皮細胞的增殖抑制率達50%，為了避免由于藥物毒性造成的細胞死亡，因此選擇該濃度和作用時間進行后續(xù)實驗。

既往眾多研究表明，CyclinD1和PCNA是細胞增殖和分化過程中的重要成員，二者的高表達可促進乳腺癌、肝癌、卵巢癌等多種腫瘤的進展[21-23]。細胞受到外界刺激信號，由Bcl-2家族主導(dǎo)引起的線粒體外膜通透性改變，促進凋亡相關(guān)小體的形成和Caspase家族級聯(lián)的激活，誘導(dǎo)細胞凋亡[24-25]。本實驗結(jié)果顯示，PDGF-BB組內(nèi)皮細胞中CyclinD1、PCNA 蛋白及mRNA 表達量較對照組明顯上調(diào)，Bcl-2蛋白及mRNA表達量較對照組明顯下調(diào)，說明PDGF-BB能夠通過促進內(nèi)皮細胞中促增殖的蛋白周期蛋白CyclinD1和細胞核增殖抗原PCNA的表達，抑制凋亡基因Bcl-2的表達而促進內(nèi)皮細胞增殖；PDGF-BB+NR1組內(nèi)皮細胞中CyclinD1、PCNA 蛋白及mRNA表達量較PDGF-BB組明顯下調(diào)，Bcl-2 mRNA及蛋白表達量較對照組明顯上調(diào)，說明NR1能夠通過抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的CyclinD1和PCNA表達，促進Bcl-2表達而誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡。

綜上所述，PDGF-BB可促進內(nèi)皮細胞增殖，NR1可抑制內(nèi)皮細胞增殖并誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡，NR1可能對腫瘤抗血管新生的治療具有重要作用，有待動物實驗進行驗證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。