賴斯華，孫平良，歐海玲，梁運特，廖志遠，張 琴，湯 勇

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

潰瘍性結(jié)腸炎屬于炎癥性腸病，以慢性非特異性腸道炎癥為特征，病變主要累及結(jié)腸和直腸[1]。潰瘍性結(jié)腸炎病機復(fù)雜，尚缺乏長期有效的治療藥物，患者反復(fù)發(fā)病，影響生活，探討該病發(fā)病機制及治療方法一直是研究的熱點。安腸湯是廣西名老中醫(yī)肖振球教授治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床經(jīng)驗方，該方以脾腎陽虛立論，臨床上用于治療潰瘍性結(jié)腸炎療效顯著[2-3]，但其作用機制尚有待明確。目前研究發(fā)現(xiàn)，在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病過程中，存在著核因子κB(NF-κB)蛋白通路的持續(xù)活化[4-5]。而蛋白激酶C(PKC)的激活能調(diào)控NF-κB核轉(zhuǎn)移使其激活，導(dǎo)致NF-κB蛋白的高表達[6]，這一環(huán)節(jié)在SOCS3表達過程中起重要作用[7]。甘氨酸是一種非必需氨基酸，能干擾NF-κB的活化，可顯著降低血清促炎細(xì)胞因子水平，增加抗炎細(xì)胞因子水平[8]。本實驗主要通過觀察安腸湯對重癥潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中PKC、NF-κB、SOCS3表達和糞便、血漿中甘氨酸含量的影響，探討該方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級6～8周Wistar大鼠72只，雌雄各半，體重(200±20)g，購于長沙天勤生物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(湘)2014-0011，許可證號：SYXK(桂)2010-0001。實驗大鼠采光晝夜交替(光照時間7:00—18:00)，自由飲食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度25 ℃左右、濕度50%左右，通風(fēng)良好，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。本實驗研究經(jīng)過廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2實驗藥物 安腸湯(藥物組成：熟附子15 g、干姜10 g、白術(shù)10 g、白頭翁15 g、茯苓15 g、補骨脂25 g、黃芪20 g、黨參15 g、檳榔15 g、雞內(nèi)金10 g、薏苡仁10 g、木香10 g、地榆15 g、赤芍15 g、玄胡索10 g、甘草10 g)，購于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院仙葫院區(qū)藥房，按處方取藥材洗凈、溫水浸泡30 min，熟附子先煎30 min,倒入余藥，水煎3次，濃縮至100 mL含生藥量5 g水溶液，4 ℃保存?zhèn)溆?；美沙拉嗪腸溶片,葵花藥業(yè)集團佳木斯鹿靈制藥有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字H19980149，用生理鹽水配成5 mg/mL混懸液。

1.1.3主要試劑及耗材 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma公司)，水合氯醛、無水乙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，無菌生理鹽水(上海晶都生物技術(shù)有限公司)，伊紅染液(法國梅里埃公司)，Takara公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time，RR047A)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus，RR082A)、PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time，RR036A)，MonAmpTMSYBR?Green qRT-PCR Mix(Monad公司，High ROX，MQ10301)，TransScript?-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金公司，AU311)，0.2 mL熒光定量RT-PCR透明八排管八連管蓋(ABI公司，4323032)，Solarbio公司的蘇木精、TriQuick Reagent(R1100)、高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(R0010)、蛋白酶抑制劑混合液(100×PIC)(P6730)、4×Buffer(P1016)、BCA(PC0020)、脫脂奶粉(D8340)，Biosharp品牌的ECL化學(xué)發(fā)光底物(超敏)(BL523A)、PKC抗體(BL3531R)、NF-κB抗體(BL20355R)、p-NF-κB抗體(BL3440R)、SOCS3抗體、Actin，Goat anti-rabbit(美國 Abcam 公司，GR312354-1、ab8227、ab6721)，L-甘氨酸(標(biāo)準(zhǔn)品，meilunbio，MB4166-S)。

1.1.4主要儀器 PreviColor Gram革蘭染色儀(法國梅里埃公司)，賽默飛Excelsior AS自動組織脫水機[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，Leica HistoCore BIOCUT石蠟切片機(徠卡微系統(tǒng)有限公司)，Nikon50i顯微圖文系統(tǒng)(日本Nikon公司),組織勻漿機(德國IKA、T18)，恒溫金屬浴鍋(上海一恒,TU-100C)，普通離心機(上海盧湘儀,TD4)，Haier醫(yī)用低溫保存箱(青島海爾特種電器,DW-86L728J)，超微量核酸檢測儀(遂真,FC-1100)，Ariamx Real-Time RT-PCR(Agilent Technologies，G8830-64001)，VeritiTM96-Well Thermal Cycler(Applied Biosystems?，4375786)，低溫離心機(eppendorf、5418R)，多功能酶標(biāo)儀(美國MD，F(xiàn)ilterMax F3)，水平搖床(其林貝爾，TS-3D)，電泳儀(Bio-Rad，PowerPac Basic)，蛋白轉(zhuǎn)印模塊(濕轉(zhuǎn))(Bio-Rad，Mini Trans-Blot Cell)，凝膠成像系統(tǒng)(上海天能，Tanon 5200)，臺式恒溫培養(yǎng)振蕩器搖床(空氣)(上海智誠，ZWYR-2102C)，高效液相色譜儀(Shima-dzu，LC30AD)，Hypersil GOLD HILIC C18 色譜柱(Thermo，100×2.1 mm×1.9 μm)。

1.2實驗方法 將72只Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、美沙拉嗪組及安腸湯低、中、高劑量組，每組12只。在禁食不禁飲24 h后，用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹部皮內(nèi)注射進行麻醉后，將導(dǎo)尿管緩緩插入大鼠肛門7 cm，注入50 mg/kg的2，4，6-三硝基苯磺酸液+等容積的50%乙醇溶液，使藥液緩慢進入腸道，將大鼠提尾倒置2 min，讓藥液充分停留在結(jié)腸內(nèi)，待大鼠清醒后少量飲食、進水。繼續(xù)禁食不禁飲24 h,上述造模方法重復(fù)2次，共連續(xù)3 d。造模后第7天開始，美沙拉嗪組給予5 mg/mL美沙拉嗪混懸液0.35 mL灌胃，安腸湯低、中、高劑量組分別給予50 mg/mL安腸湯0.53 mL(相當(dāng)于臨床用藥0.5倍量)、1.1 mL(相當(dāng)于臨床用藥等效量)、3 mL(相當(dāng)于臨床用藥3倍量)灌胃，空白組和模型組給予生理鹽水灌胃，每只灌胃量均為3 mL，每日1次，連續(xù)7 d。

1.3檢測指標(biāo)及方法

1.3.1大鼠一般情況 觀察各組大鼠造模后及灌胃后臨床表現(xiàn)，記錄各組大鼠死亡情況及體重。

1.3.2病情嚴(yán)重程度 分別于造模第7天和灌胃第7天，采用疾病指數(shù)評分(DAI評分)[8]評估大鼠病情嚴(yán)重程度，DAI評分=(體重下降計分+大便性狀計分+大便便血情況計分)/3，DAI評分越高提示病情越嚴(yán)重。糞便隱血情況采用隱血試紙測試。

1.3.3標(biāo)本采集、處理 灌胃第7天次日禁食24 h后處死各組大鼠，無菌環(huán)境下取腸系膜下靜脈血5 mL，3 000 r/min離心2 min，取血漿于EP管中，迅速予液氮速凍，其后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存。取各組大鼠病變結(jié)腸段糞便5～10 g于EP管，用液氮速凍后存至-80 ℃冰箱。取出結(jié)腸，于冰上操作，沿腸系膜緣剪開腸腔，用細(xì)胞保護液清洗腸黏膜表面糞便，用于病理檢測部分放于細(xì)胞固定液中；余放置于凍存管，液氮速凍，轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱存放。

1.3.3.1結(jié)腸組織病理觀察 將組織樣本脫水處理，經(jīng)包埋、蠟塊凝固、切片、撈片，烤片過夜，次日經(jīng)切片脫蠟水化，蘇木、伊紅染色，脫水封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3.2結(jié)腸組織中PKC、NF-κB、p-NF-κB、SOCS3蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測：用無菌剪刀把各樣品組織剪成細(xì)小的碎片，取40 mg置于冰盒上的2 mL離心管中，加400 μL RIPA-PMSF-PIC后用勻漿機勻漿，勻漿5 s放回冰盒冷卻再繼續(xù)，無沉淀后停止。12 000 r/min離心5 min后取上清液，BCA法測定蛋白含量。將濃度定量至2 μg/μL，加4×蛋白上樣buffer，100 ℃變性10 min。90 V恒壓電泳約20 min，待分離膠層有樣品進入后，換120 V恒壓電泳1～1.5 h。300 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min。用TBST配8%脫脂奶粉配置封閉液。將膜放入封閉液中3 h。按說明書上的比例將一抗用封閉液稀釋，把膜放入稀釋后的一抗中，4 ℃冰箱孵育12 h后用TBST洗膜3次，每次15 min。將膜放入按1∶4 000比例稀釋，在37 ℃條件下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次15 min。用ECL顯色劑對膜顯色，曝光成像放入凝膠成像儀中。利用Image J軟件計算條帶的灰度值。

1.3.3.3結(jié)腸組織中PKC、NF-κB、SOCS3mRNA表達檢測 采用RT-PCR法檢測：采用Solarbio公司TriQuick Reagent總RNA提取試劑盒按說明提取總RNA后，取1 μL的RNA樣本，用超微量核酸檢測儀直接測定A260/280比值的RNA濃度，若比值在1.7～2.1之間的RNA純度較好，否則重新提取。試劑5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)4 μL、Total RNA 1 μg、RNase Free dH2O 20 μL，可根據(jù)反應(yīng)體系加大需求量，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后得到cDNA模板；根據(jù)所需檢測的樣本和基因數(shù)量，配制好所有PCR反應(yīng)體系(單樣本單基因)，SYBR Premix Ex Taq(Ti RNaseH Plus)(2×)7.5 μL、primer-F 0.6 μL、primer-R 0.6 μL、cDNA 模板1 μL、dH2O 5.3 μL，設(shè)定反應(yīng)程序，檢測反應(yīng)體系中的熒光強度檢測所需基因的表達量。記錄每個樣本所對應(yīng)基因的Ct值并算出均值，最后算出每個樣本目的基因mRNA的相對表達量為目的基因的2-△△ct。引物序列見表1。

表1 結(jié)腸組織中PKC、NF-κB、p-NF-κB、SOCS3mRNA表達RT-PCR檢測引物序列

1.3.3.4血漿及糞便中甘氨酸含量檢測 采用液相色譜法檢測：①取500 μL血漿,加入1 500 μL乙腈，混勻后12 000 r/min離心10 min，取上清，離心濃縮后，使用300 μL乙腈溶解濃縮析出物，溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進行上機檢測。②取糞便樣本100 mg，加入1 mL乙腈，于低溫狀態(tài)下進行超聲波破碎處理，震蕩混勻后12 000 r/min離心10 min，取上清，再次離心以去除內(nèi)部沉淀物，取上清溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進行上機檢測。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 大鼠造模后逐漸出現(xiàn)精神萎靡、懶動、弓背、扎堆，毛發(fā)色澤暗淡發(fā)黃，繼而出現(xiàn)腹脹，體重下降，出現(xiàn)肉眼黏液膿血便和稀水樣黃便、黑便；造模第7天，模型組、美沙拉嗪組及安腸湯低、高劑量組各死亡3只，安腸湯中劑量組死亡4只。灌胃第7天，模型組存活6只，美沙拉嗪組及安腸湯低、高劑量組各存活7只，安腸湯中劑量組存活8只，各藥物組存活大鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，其中美沙拉嗪組血便減少，但是部分仍腹瀉，體重逐漸恢復(fù)；安腸湯中劑量組部分大鼠出現(xiàn)成形較黏性的大便，血便明顯減少，體重緩慢恢復(fù)，由于安腸湯味苦，部分大鼠灌胃后嘔吐，尤其安腸湯高劑量組反應(yīng)大。實驗全程雌性大鼠、體重較輕大鼠死亡較多。

2.2各組大鼠DAI評分 空白組大鼠實驗期間DAI評分為0分；造模第7天，各造模組大鼠的DAI評分均明顯增高，各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；灌胃第7天，各藥物組大鼠的DAI評分均明顯低于造模第7天及模型組(P均<0.05)，且美沙拉嗪組和安腸湯中劑量組均明顯低于安腸湯低劑量組(P均<0.05)，安腸湯中劑量組明顯低于安腸湯高劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 各組重度潰瘍性結(jié)腸炎大鼠造模及灌胃后DAI評分比較分)

2.3各組大鼠結(jié)腸組織HE染色情況 空白組大鼠結(jié)腸黏膜表面未見糜爛，細(xì)胞排列整齊；模型組大鼠結(jié)腸黏膜糜爛、破潰，細(xì)胞排列紊亂；各藥物組大鼠結(jié)腸黏膜損傷均有好轉(zhuǎn)，其中安腸湯中劑量組、美沙拉嗪組恢復(fù)最佳，安腸湯低、高劑量組相對較差。見圖1。

圖1 空白組和重度潰瘍性結(jié)腸炎各組大鼠結(jié)腸組織HE染色情況(×10)

2.4各組大鼠結(jié)腸組織中PKC、NF-κB、p-NF-κB、SOCS3蛋白表達情況 模型組大鼠結(jié)腸組織中PKC、NF-κB、p-NF-κB、SOCS3蛋白表達量均明顯高于空白組(P均<0.05)；各藥物組大鼠結(jié)腸組織中PKC、NF-κB、p-NF-κB、SOCS3蛋白表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且安腸湯中、高劑量組PKC、p-NF-κB蛋白表達量和安腸湯高劑量組NF-κB蛋白表達量均明顯低于安腸湯低劑量組(P均<0.05)，安腸湯低、中劑量組間NF-κB蛋白表達量和各藥物組間SOCS3蛋白表達量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖2及表3。

表3 空白組和重度潰瘍性結(jié)腸炎各組大鼠結(jié)腸組織中PKC、NF-κB、SOCS3蛋白相對表達量比較

圖2 空白組和重度潰瘍性結(jié)腸炎各組大鼠結(jié)腸組織中PKC、NF-κB、SOCS3蛋白表達條帶

2.5各組大鼠結(jié)腸組織中PKC、NF-κB、SOCS3mRNA表達情況 模型組大鼠結(jié)腸組織中PKC、NF-κB、SOCS3mRNA表達量均明顯高于空白組(P均<0.05)；各藥物組大鼠結(jié)腸組織中NF-κB、SOCS3 mRNA表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，PKC mRNA表達量均高于模型組(P均<0.05)；安腸湯中、高劑量組PKC、NF-κBmRNA表達量和安腸湯高劑量組SOCS3mRNA表達量均明顯低于安腸湯低劑量組(P均<0.05)，安腸湯中、高劑量組間PKC、NF-κB、SOCS3mRNA表達量和安腸湯低、中劑量組間SOCS3mRNA表達量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表4。

表4 空白組和重度潰瘍性結(jié)腸炎各組大鼠結(jié)腸組織中PKC、NF-κB、SOCS3mRNA表達量比較

2.6各組大鼠血漿和糞便中甘氨酸濃度 模型組大鼠血漿及糞便中甘氨酸濃度均明顯高于空白組(P均<0.05)；各給藥組大鼠血漿及糞便中甘氨酸濃度均明顯低于模型組(P均<0.05)，美沙拉嗪組和安腸湯中、高劑量組血漿及糞便中甘氨酸濃度均明顯低于安腸湯低劑量組(P均<0.05)，安腸湯中、高劑量組間血漿及糞便中甘氨酸濃度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；各組大鼠糞便中甘氨酸濃度均明顯高于血漿中甘氨酸濃度(P均<0.05)。見表5。

表5 空白組和重度潰瘍性結(jié)腸炎各組大鼠血液和糞便中甘氨酸濃度比較

3 討 論

潰瘍性結(jié)腸炎作為一種反復(fù)發(fā)作的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其病程長、纏綿難愈，嚴(yán)重影響患者健康和生活質(zhì)量。目前尚無長期有效的治療藥物，針對潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機制的研究和中醫(yī)藥治療至關(guān)重要。安腸湯中熟附子、干姜為君，溫補脾腎；黃芪、黨參、茯苓、白術(shù)補氣為臣，氣能生血，改善患者長期黏液血便的失血；佐以補骨脂助君藥溫腎助陽、溫脾止瀉；白頭翁祛濕止痢，雞內(nèi)金、地榆涼血止?。晦曹尤世疂B濕，健脾止瀉；赤芍活血散瘀止痛；玄胡索、木香行氣止痛；檳榔行氣止瀉，起行氣排水之用；甘草調(diào)和諸藥。縱觀全方，具有補脾溫腎、健脾益氣、活血化瘀、利水滲濕、行氣導(dǎo)滯之功效，切中潰瘍性結(jié)腸炎病機。

NF-κB蛋白是一種多功能的核轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號傳導(dǎo)途徑的匯聚點，其在炎癥的調(diào)控中起著關(guān)鍵性作用[4，9]。PKC是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有不同的功能和組織分布，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡或細(xì)胞運動等多種重要的分子過程，可激活NF-κB蛋白通路[10-11]。PKC參與磷脂酰肌醇二甘露醇(PIM2)誘導(dǎo)SOCS3表達過程，可使NF-κB p65核轉(zhuǎn)移[12]。Li等[13]報道，潰瘍性結(jié)腸炎復(fù)發(fā)與SOCS3的高表達有關(guān)。因此，PKC/NF-κB/SOCS3通路的表達與潰瘍性結(jié)腸炎息息相關(guān)。本實驗證實，TNBS+乙醇致重癥潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中存在PKC、NF-κB、SOCS3蛋白和mRNA高表達，安腸湯干預(yù)能促進PKC mRNA表達，抑制PKC蛋白及NF-κB、SOCS3蛋白和mRNA表達，促進病變結(jié)腸黏膜的恢復(fù)。安腸湯干預(yù)后PKC蛋白和mRNA表達不一致，考慮基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄-翻譯成蛋白，以及翻譯后修飾的過程中mRNA可被利用多次，或者存在一條mRNA被翻譯幾次，也可能有非編碼RNA的參與。

本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜中蘇氨酸濃度降低、甘氨酸含量升高[14]。甘氨酸可以激活細(xì)胞膜上L型電壓依賴性鈣通道的開放[15]，可致細(xì)胞膜上Ca2+減少，影響Ca2+依賴的PKC，PKC能使蘇氨酸磷酸化，使蘇氨酸的含量減少。本實驗用液相色譜法檢測發(fā)現(xiàn)重癥潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血漿和糞便中甘氨酸濃度升高，證實甘氨酸可作為診斷潰瘍性結(jié)腸炎的標(biāo)志物；安腸湯干預(yù)后，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血漿、糞便中甘氨酸濃度明顯降低。提示安腸湯可能通過降低甘氨酸濃度，抑制PKC蛋白表達，進一步影響PKC下游的NF-κB和SOCS3表達，從而減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述，PKC/NF-κB/SOCS3及甘氨酸在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病中起到了重要作用；安腸湯可能通過降低潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血漿和糞便甘氨酸的濃度，影響PKC/NF-κB/SOCS3通路相關(guān)因子的表達而促進結(jié)腸黏膜損傷修復(fù)。后期課題組將以此為基礎(chǔ)，從代謝產(chǎn)物及免疫學(xué)方面進一步探討安腸湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的機制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。