劉 敏，雷薈融，成延娟，唐元艷，黃知平

0 引 言

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是血液系統(tǒng)惡性腫瘤，約占成年人白血病的2/3，常用化療、造血干細胞移植等手段治療，AML化療的完全緩解率僅為65%～75%，老年患者5年生存率較低，因此研究AML的發(fā)生發(fā)展機制，尋找靶向治療分子標志物具有重要意義[1-2]。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)與AML發(fā)生發(fā)展有關，lncRNA人類白細胞抗原復合體18(human leucocyte antigen complex group 18，HCG18)為lncRNA之一，研究表明，lncRNA HCG18在胃癌中表達水平升高，干擾lncRNA HCG18表達，可抑制胃癌細胞增殖、遷移與侵襲[3-5]，但lncRNA HCG18在AML中的表達尚不清楚。研究表明，lncRNA通常通過海綿微小RNA(microRNAs，miRNAs)而影響miRNAs對其靶基因的調控，在多種腫瘤中發(fā)揮作用[6]。miR-324-5p是miRNAs的一種，在多發(fā)性骨髓瘤中呈低表達[7]，并與患者預后相關，研究顯示[8]，miR-324-5p可通過靶向膠質瘤相關基因同源蛋白1(Glioma-related gene homologous protein 1，GLI1)抑制膠質瘤生長，GLI1具有轉錄激活子的功能，可調控細胞增殖、分化、藥物抗性等多種生理病理過程[9]。目前，lncRNA HCG18、miR-324-5p/GLI1軸對AML細胞的影響尚不清楚。因此，本研究探索lncRNA HCG18對AML細胞增殖、侵襲的及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑人AML細胞HL-60購自美國ATCC細胞庫；人淋巴細胞分離液、Trizol試劑、逆轉錄試劑盒購于日本Takara公司，miR-324-5p、lncRNA HCG18、U6、GAPDH引物及qRT-PCR試劑盒購自美國賽默飛公司(Thermo Fisher)；miR-324-5p mimics、抑制miR-324-5p表達質粒(miR-324-5p inhibitor)、干擾lncRNA HCG18表達質粒(lncRNA HCG18 siRNA)、GLI1過表達質粒(GLI1)及其相應陰性對照(miR-NC、NC inhibitor、si-NC、GLI1 NC)購自廣州銳博生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、EDTA-胰酶、胎牛血清購自美國Gibco公司；細胞計數(shù)試劑盒(cell counting Kit-8，CCK-8)、Lipofectamine 3000、雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega公司；兔抗人GLI1、Cyclin D1、MMP-9、MMP-2單克隆抗體購自Abcam公司。

1.2實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組收集2017年1月-2021年3月在本院血液科住院治療的AML患者以及同期在本院治療并進行骨髓穿刺檢查的非血液系統(tǒng)腫瘤性疾病患者新鮮骨髓2～3 mL[10]，提取單個核細胞，qRT-PCR檢測單個核細胞中l(wèi)ncRNA HCG18與miR-324-5p的表達。

HL-60細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(含青鏈霉素雙抗)常規(guī)條件培養(yǎng)，細胞生長至對數(shù)期時，胰蛋白酶消化，調整細胞濃度，將HL-60細胞接種至6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將HL-60細胞分為對照組(不做轉染)、si-NC組、 lncRNA HCG18 siRNA組、miR-NC組、miR-324-5p mimics組、miR-324-5p mimics+GLI1 NC組、miR-324-5p mimics+GLI1組、lncRNA HCG18 siRNA+NC inhibitor組、lncRNA HCG18 siRNA+miR-324-5p inhibitor組，利用Lipofectamine 3000對細胞進行轉染，每組做6個平行實驗，轉染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，篩選陽性克隆，進行后續(xù)實驗。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測細胞中 lncRNA HCG18、miR-324-5p表達使用Trizol試劑提取細胞總RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，qRT-PCR檢測 lncRNA HCG18、miR-324-5p表達，反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s，40個循環(huán)，獲取熒光信號溫度為62 ℃。以GAPDH為lncRNA HCG18表達水平的內參，以U6為miR-324-5p表達水平的內參，采用2-ΔΔCt方法計算各組細胞中 lncRNA HCG18、miR-324-5p相對表達量。引物序列見表1。

表 1 引物序列

1.2.3CCK-8法檢測細胞增殖轉染后的各組HL-60細胞，制備細胞懸液接種至96孔板中，置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、2、3、4 d，每個時間點每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃避光孵育2 h終止培養(yǎng)，酶標儀檢測波長450 nm處吸光度(A)值，繪制細胞生長曲線。

1.2.4Transwell小室法檢測細胞遷移與侵襲將轉染后的各組HL-60細胞接種在裝有Transwell小室到的培養(yǎng)皿中，無血清DMEM培養(yǎng)基制備HL-60細胞細胞懸液，接種于上室中，下室加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，用棉簽拭去未遷移細胞，下室用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，顯微鏡下隨機挑取6個視野觀察，計數(shù)穿膜細胞數(shù)(細胞遷移數(shù))。侵襲實驗中使用Matrigel膠包被Transwell小室上室，其余處理與遷移操作相同，計數(shù)細胞侵襲數(shù)。

1.2.5蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測細胞中GLI1、Cyclin D1、MMP-9、MMP-2蛋白表達RIPA裂解液提取HL-60細胞總蛋白，用Bradford法測定蛋白含量，用10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕法轉至PVDF膜，封閉后分別加入GLI1、Cyclin D1、MMP-9、MMP-2一抗稀釋液(按說明書進行稀釋)，4 ℃過夜孵育，TBST洗膜，加入HRP標記的二抗，室溫孵育1h，加入發(fā)光試劑，以GAPDH為內參，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-324-5p與 lncRNA HCG18、GLI1的靶向關系starbase 數(shù)據(jù)庫顯示lncRNAHCG18、GLI1基因3′UTR均有與miR-324-5p的結合位點，對結合位點區(qū)域進行擴增，分別構建野生型 lncRNA HCG18-WT、GLI1-WT質粒，以此質粒對模板，使用GeneArtTM定點誘變系統(tǒng)構建lncRNA HCG18-MUT和GLI1-MUT突變質粒。將重組質粒分別和miR-NC、miR-324-5p mimics共轉染至HL-60細胞中，轉染48 h后，檢測相對熒光素酶活性。

2 結 果

2.1 lncRNA HCG18、miR-324-5p在AML中表達與對照組比較，AML組患者骨髓單個核細胞中l(wèi)ncRNA HCG18表達水平(2.85±0.32)較對照組(1.03±0.11)顯著升高(P<0.01)，而miR-324-5p表達水平(0.47±0.05)較對照組(1.05±0.09)顯著降低(P<0.01)。

2.2沉默 lncRNA HCG18對HL-60細胞增殖、遷移與侵襲的影響與對照組和si-NC組比較， lncRNA HCG18 siRNA組細胞增殖、細胞遷移與侵襲數(shù)、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著降低(P<0.05)，見表2。表明沉默 lncRNA HCG18表達可顯著抑制細胞增殖、遷移與侵襲，見圖1、圖2、圖3。其中圖2顯微鏡下可見遷移與侵襲的穿膜細胞呈紫色，lncRNA HCG18 siRNA組遷移與侵襲細胞數(shù)較對照組和si-NC組明顯減少。

表 2 沉默 lncRNA HCG18對HL-60細胞遷移與侵襲的影響

圖 1 沉默 lncRNA HCG18對HL-60細胞增殖的影響

圖 2 沉默 lncRNA HCG18對HL-60細胞遷移與侵襲的影響

1：對照組；2：si-NC組；3：lncRNA HCG18 siRNA組

2.3過表達miR-324-5p對HL-60細胞增殖、遷移和侵襲的影響與對照組和miR-NC組比較，miR-324-5p mimics組細胞增殖、細胞遷移與侵襲數(shù)、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著降低(P<0.05)，見表3。表明過表達miR-324-5p可顯著抑制細胞增殖、遷移與侵襲，和圖4、圖5、圖6。

表 3 過表達miR-324-5p對HL-60細胞遷移與侵襲的影響

圖 4 過表達miR-324-5p對HL-60細胞增殖的影響

圖 5 過表達miR-324-5p對HL-60細胞遷移與侵襲的影響

1：對照組；2：miR-NC組；3：miR-324-5p mimics組

2.4lncRNA HCG18、GLI1與miR-324-5p的靶向關系驗證經(jīng)生物信息學分析(starbase數(shù)據(jù)庫)分析顯示， lncRNA HCG18、GLI1與miR-324-5p均有結合位點，其可能的結合位點為lncRNA HCG18-3′UTR：5′- GGACAGCCCCUCUGUGGGGAUGCG-3′；miR-324-5p：3′-UGUGGUUACGGGAU--CCCCUACGC-5′；GLI1-3′UTR：5′-GCACAAGAUGCCCCA-GGGAUGGG-3′。雙熒光素酶報告基因實驗結果表明，miR-324-5p mimics與lncRNA HCG18和GLI1野生型質粒共轉染HL-60 細胞后，相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，見圖7。

a:lncRNA HCG18與miR-324-5p; b:GLI1與miR-324-5p

沉默lncRNA HCG18表達后可顯著上調miR-324-5p表達水平，下調GLI1蛋白表達水平(P<0.05)，見圖8；過表達miR-324-5p后lncRNA HCG18表達水平顯著降低，GLI1表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖9。

1：對照組；2：si-NC組；3： lncRNA HCG18 siRNA組

2.5過表達GLI1逆轉過表達miR-324-5p對HL-60細胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用與miR-324-5p mimics組和miR-324-5p mimics+GLI1 NC組比較，miR-324-5p mimics+GLI1組細胞增殖、細胞遷移與侵襲數(shù)、GLI1、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見表4和圖10、圖11。

表 4 過表達miR-324-5p和GLI1對HL-60細胞遷移與侵襲的影響

圖 10 過表達miR-324-5p和GLI1對HL-60細胞增殖的影響

圖 11 過表達miR-324-5p和GLI1對HL-60細胞遷移與侵襲的影響

2.6抑制miR-324-5p表達逆轉沉默lncRNA HCG18表達對HL-60細胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用與lncRNA HCG18 siRNA組和lncRNAHCG18 siRNA+NC inhibitor組比較， lncRNA HCG18 siRNA+miR-324-5p inhibitor組細胞增殖、細胞遷移與侵襲數(shù)、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著升高(P<0.05)，表明抑制miR-324-5p表達可明顯逆轉沉默 lncRNA HCG18表達對HL-60細胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用，見表5和圖12、圖13、圖14。

1：miR-324-5p mimics組；2：miR-324-5p mimics+GLI1 NC組；3：miR-324-5p mimics+GLI1組

表 5 抑制miR-324-5p與lncRNA HCG18表達對HL-60細胞遷移與侵襲的影響

圖 13 抑制lncRNA HCG18與miR-324-5p表達對HL-60細胞增殖的影響

圖 14 抑制lncRNA HCG18與miR-324-5p表達對HL-60細胞遷移與侵襲的影響

1：lncRNA HCG18 siRNA組；2：lncRNA HCG18 siRNA+NC inhibitor；3：lncRNA HCG18 siRNA+miR-324-5p inhibitor組

3 討 論

LncRNA為非編碼RNA，多位于細胞核或細胞質內，可通過調控基因轉錄而發(fā)揮生物學作用，其表達失調與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[11]，多項報道顯示，LncRNA在AML中的表達發(fā)生變化，與AML的進展、轉移和預后有關[12]，如LncRNA KCNQ1OT1在AML患者中的表達明顯增高，與患者的NCCN風險分級及生存狀態(tài)相關[13]。本研究結果顯示lncRNA HCG18在AML患者骨髓單個核細胞中表達水平顯著升高，提示lncRNA HCG18表達水平升高與AML的發(fā)生發(fā)展有關。多項研究表明，lncRNA HCG18在胃癌、肝癌等腫瘤中上調表達，其在腫瘤中發(fā)揮類似癌基因的作用[14-15]。Li等[16]研究報道顯示，lncRNA HCG18在結直腸癌組織和細胞系中顯著上調，敲除lncRNA HCG18能顯著抑制結直腸癌細胞的生長和侵襲。表明lncRNA HCG18可能發(fā)揮促癌的作用，為探索lncRNA HCG18在AML細胞中的功能，本研究在HL-60細胞中沉默 lncRNA HCG18表達，結果顯示，HL-60細胞增殖、遷移與侵襲數(shù)、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著降低，表明沉默 lncRNA HCG18表達可顯著抑制細胞增殖、遷移與侵襲，提示lncRNA HCG18可能在AML中發(fā)揮癌基因的作用，然而其具體作用機制尚不清楚。

多項研究表明，lncRNA HCG18可靶向多種miRNA而發(fā)揮生物學作用，如曲寶亮等[17]研究表明，lncRNA HCG18可通過調控miR-17-5p/高遷移率族蛋白A2(HMGA2)軸促進非小細胞肺癌(NSCLC)細胞的增殖及遷移。miR-324-5p為miRNA一種，在多種腫瘤中表達水平降低，發(fā)揮抑癌基因的作用[18]，如在血液腫瘤中，miR-324-5p通過抑制SCFβ-TrCP E3連接酶抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞的遷移和侵襲[19]。本研究經(jīng)生物信息學分析和雙熒光素酶報告基因實驗結果表明，lncRNA HCG18、GLI1與miR-324-5p存在靶向關系。GLI1是Hh通路末端核轉錄因子，具有轉錄激活作用，GLI1的上調是Hh通路激活的重要標志，Hh通路對維持胚胎生長發(fā)育及組織生長分化有重要作用，但其異?；罨c腫瘤形成有關，抑制Hh通路可抑制AML細胞增殖，促進其凋亡[20]。研究表明，miR-324-5p通過靶向hedgehog信號通路調控多發(fā)性骨髓瘤細胞的干性、發(fā)病機制和對硼替佐米的敏感性[21]。本研究結果顯示AML患者骨髓單個核細胞中miR-324-5p表達水平降低，HL-60細胞中沉默 lncRNA HCG18表達后，可上調miR-324-5p表達，抑制miR-324-5p可逆轉沉默 lncRNA HCG18表達對HL-60細胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用，表明lncRNA HCG18靶向miR-324-5p調控AML細胞增殖、遷移與侵襲。本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達miR-324-5p后lncRNA HCG18表達水平顯著降低，GLI1表達水平顯著降低，且過表達miR-324-5p可顯著抑制細胞增殖、遷移與侵襲。已有研究報道，GLI1在AML細胞中表達上調，激活GLI1可導致體內骨髓增生異常綜合征的白血病轉化，抑制GLI1可抑制腫瘤活性[22]。過表達GLI1可逆轉miR-324-5p對HL-60細胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用，這些結果表明miR-324-5p可能通過靶向抑制GLI1表達，抑制HL-60細胞增殖、遷移與侵襲。

綜上所述，lncRNA HCG18在AML細胞中高表達，抑制lncRNA HCG18表達可通過調控miR-324-5p/GLI1軸抑制AML細胞增殖、遷移與侵襲，其具體作用機制將聯(lián)合動物模型進行更深入研究。