胡樂玉，宋 鵬，崔嘉琪，鄒 玲，劉文華，張 燦，韓先杰，任慧英

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109）

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）是引起新生仔豬及斷奶仔豬腹瀉的主要致病菌之一，其致病作用與其具有的黏附性菌毛密切相關(guān)[1-2]。致仔豬腹瀉ETEC 的血清型主要有K88、K99 和987p，其中含有K88 菌毛的ETEC 是引起仔豬腹瀉最主要的病原菌，該菌感染后治療不及時會導(dǎo)致仔豬發(fā)病死亡[1-4]。

目前，抗生素是治療仔豬細(xì)菌性腹瀉最常用的手段，但隨著抗生素在臨床的大量使用，大腸桿菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，抗生素的臨床應(yīng)用效果逐漸變差。預(yù)防ETEC 腹瀉的首選方法是使用能激發(fā)宿主產(chǎn)生針對黏附素免疫力和抗腸毒素免疫力的疫苗，但ETEC 血清型眾多，至今尚無一種疫苗能有效防治各個血清型ETEC 的感染[5]。長期以來，我國養(yǎng)豬業(yè)一直遭受著ETEC 感染帶來的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，亟需研發(fā)防治仔豬腹瀉的理想藥物。

噬菌體可以特異性感染宿主菌，在其中增殖并快速殺滅宿主菌，增殖后釋放的子代噬菌體還可以繼續(xù)感染并殺滅細(xì)菌，這種作用不受細(xì)菌耐藥性的限制，而且噬菌體作用的特異性決定了其不會破壞動物體的正常菌群，對人和動物安全，是一種綠色的抗生素替代品，在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床已有過許多成功的應(yīng)用[6-8]。本研究通過小鼠模型來探究噬菌體對致仔豬腹瀉ETEC 感染的防治效果，旨在為噬菌體用于仔豬大腸桿菌病的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 ETEC K88、K99 和987p 菌株由本實驗室保存；噬菌體DS2 及其宿主菌S2 均由本實驗室從驢的糞便樣品中分離并保存；DS2 噬菌體增殖液經(jīng)離心及0.22 μm 濾膜過濾，無菌檢驗合格。S2 為經(jīng)16S rRNA 測序鑒定的沙門氏菌；SPF 級BALB/c 成年小鼠購自青島大任富城畜牧有限公司。普通營養(yǎng)瓊脂、LB 瓊脂、SS 瓊脂等購自青島海博生物技術(shù)有限公司；內(nèi)毒素檢測鱟試劑盒購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司；小鼠細(xì)胞因子IL-1β ELISA 試劑盒購自南京建成科技有限公司。

1.2 噬菌體的增殖及效價測定 參照文獻(xiàn)[9]中的方法將噬菌體與ETEC 共增殖，即在5 mL LB 肉湯中分別 加 入100 μL 新 鮮S2 菌 液 及10 μL DS2 噬 菌 體（2.5×109pfu/mL），并設(shè)立不加噬菌體的對照，37 ℃220 r/min 培養(yǎng)。待對照組液體逐漸渾濁，噬菌體組先渾濁隨后逐漸清亮?xí)r，采用LB 肉湯將噬菌體增殖液10 倍倍比稀釋，取106、107倍稀釋液各220 μL，分別與新鮮S2 菌液220 μL 混合加入到無菌EP 管中，37 ℃孵育5 min 后，取200 μL 加入預(yù)熱融化的上層瓊脂（瓊脂濃度為0.7%）中，混勻后迅速倒入下層營養(yǎng)瓊脂（瓊脂濃度為1.5%）板上，傾斜旋轉(zhuǎn)使分布均勻，每個稀釋度做兩個平行。待瓊脂凝固后37 ℃倒置培養(yǎng)6 h～8 h，參照文獻(xiàn)[10]中的雙層平板法觀察結(jié)果并計算噬菌體效價。

1.3 DS2 噬菌體對ETEC 體外裂解作用的測定 參照文獻(xiàn)[11]中雙層瓊脂空斑試驗，將200 μL 新鮮K88、K99 和987p 菌液分別加至溶解好的上層瓊脂中，混勻后迅速傾倒在下層營養(yǎng)瓊脂板上，傾斜旋轉(zhuǎn)使分布均勻，待瓊脂凝固后，將10 μL DS2 噬菌體點于其上，正置于37 ℃培養(yǎng)4 h～5 h 后觀察結(jié)果，若有空斑產(chǎn)生則證明DS2 對該菌具有裂解能力。另外，將100 μL 新鮮K88、K99 和987p 菌液分別采用1.2 所述方法處理，若對照組液體逐漸渾濁，噬菌體組先渾濁隨后逐漸清亮，則說明DS2 可有效裂解該菌株。

1.4 小鼠實驗設(shè)計 將30 只健康小鼠隨機(jī)分為高劑量噬菌體預(yù)防組（簡稱高劑量組）、低劑量噬菌體預(yù)防組（簡稱低劑量組）及無噬菌體的感染對照組（簡稱對照組），每組10 只。參照文獻(xiàn)[12-13]，將小鼠經(jīng)腹腔分別注射0.2 mL 高（1×108pfu/只）、低劑量（1×107pfu/只）的DS2 噬菌體，對照組小鼠經(jīng)腹腔注射0.2 mL 的噬菌體培養(yǎng)液LB 肉湯。1 h 后，對各組 小 鼠 經(jīng) 腹 腔 注 射0.2 mL 的K88、K99 及987p混合菌液（每種菌終濃度均為3×108cfu/只），并作后續(xù)試驗。

1.5 各組小鼠肝臟載菌量及噬菌體含量的測定 分別于感染后12 h、24 h、48 h 采用引頸法迫殺各組3只小鼠，無菌采集肝臟，稱重后加入1 mL PBS 使用無菌研磨器研磨。將研磨液10 倍倍比稀釋至104倍，取各濃度肝臟稀釋液50 μL，分別分多次點在SS 瓊脂培養(yǎng)基上，每個稀釋梯度做兩個平行，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)，觀察結(jié)果并采用平板計數(shù)法計算小鼠的肝臟載菌量。將各濃度肝臟稀釋液與新鮮S2 菌液共孵育，采用1.2 所述雙層平板法，測定小鼠肝臟噬菌體的含量。

1.6 小鼠血液IL-1β 及內(nèi)毒素含量的測定 感染后24 h，各組隨機(jī)選擇3 只小鼠，摘眼球采血，分離血清，利用ELISA 試劑盒檢測小鼠細(xì)胞因子IL-1β含量。感染后48 h，各組隨機(jī)選擇3 只小鼠采集抗凝血，3 000 r/min 離心30 min，分離血漿，置于不含熱原質(zhì)和內(nèi)毒素的試管中，使用內(nèi)毒素檢測鱟試劑盒測定各組小鼠血漿內(nèi)毒素的含量。

1.7 小鼠臨床癥狀評分及存活率的測定 將60 只小鼠分成3 組，每組20 只，參照1.4 的實驗設(shè)計，對小鼠注射相應(yīng)培養(yǎng)物后，觀察并記錄感染后72 h內(nèi)各組小鼠的發(fā)病率和死亡率，并統(tǒng)計感染后12 h、21 h、24 h、36 h、48 h、72 h 每只小鼠的體況得分，判定標(biāo)準(zhǔn)為：死亡0 分，瀕臨死亡1 分，部分閉眼、眼周有滲出液2 分，嗜睡、弓背3 分，運動減少、被毛粗亂4 分，正常、健康者5 分，根據(jù)結(jié)果繪制小鼠體況計分圖及存活率曲線。

2 結(jié) 果

2.1 DS2 噬菌體效價的測定及其對ETEC 的體外裂解結(jié)果 采用雙層平板法測得DS2 噬菌體的效價為6.9×109pfu/mL，并采用雙層瓊脂空斑試驗及與ETEC共增殖檢測噬菌體對ETEC 的體外裂解作用。雙層瓊脂空斑試驗結(jié)果顯示，DS2 噬菌體均可在K88、K99 及987p 平板上形成透明噬斑（圖1A）；與ETEC共增殖結(jié)果顯示，DS2 噬菌體可在共增殖6 h 時使3 株菌的液體培養(yǎng)物變得清亮，而對照組菌液渾濁（圖1B）。以上結(jié)果表明，噬菌體DS2 可體外裂解ETEC K88、K99 及987p 菌株。

圖1 分別采用雙層瓊脂空斑試驗（A）和與ETEC共增殖（B）檢測DS2噬菌體對ETEC的體外裂解作用Fig.1 In vitro lysis of ETEC by DS2 phage was examined by double agar overlay plaque assay(A)and co-incubation with ETEC(B)

2.2 噬菌體對感染小鼠肝臟載菌量影響的檢測結(jié)果 分別將不同濃度的DS2 噬菌體經(jīng)腹腔注射小鼠1 h 后，對各組小鼠經(jīng)腹腔注射0.2 mL的K88、K99及987p 混合菌液，于感染后12 h、24 h、48 h 分別檢測各組小鼠肝臟載菌量。結(jié)果顯示，高劑量組（1×109pfu/mL）小鼠的肝臟載菌量在感染后12 h、24 h較對照組有所升高，48 h 后下降，低劑量組小鼠肝臟的載菌量在感染后48 h 內(nèi)較對照組均有所下降（圖2），但以上各組差異均不顯著（P＞0.05）。表明，噬菌體可以降低感染小鼠的肝臟載菌量，且低劑量組的效果優(yōu)于高劑量組。

2.3 感染小鼠肝臟內(nèi)噬菌體含量的檢測結(jié)果 將上述注射不同濃度DS2 噬菌體的小鼠分別感染K88、K99 及987p 混合菌液并于感染后12 h、24 h、48 h，采用雙層平板法檢測各組小鼠肝臟噬菌體的含量。結(jié)果顯示，對照組小鼠肝臟中均未檢測到噬菌體。隨著感染時間的延長，高、低劑量組小鼠肝臟噬菌體的含量均在下降，且在感染后48 h 內(nèi)低劑量組小鼠肝臟噬菌體的含量均高于高劑量組（圖3）。其中，在感染后24 h 時，低劑量組小鼠肝臟噬菌體的含量極顯著高于高劑量組（P＜0.01）。表明，噬菌體在低劑量組小鼠體內(nèi)的增殖能力優(yōu)于高劑量組。

圖3 各組小鼠肝臟噬菌體含量的檢測結(jié)果Fig.3 Results of phage numbers in livers of mice in each group

2.4 各組小鼠血清細(xì)胞因子IL-1β 的檢測結(jié)果 感染后24 h，分別采集每組各3 只小鼠的血清，利用ELISA 方法檢測IL-1β 含量。結(jié)果顯示，與對照組相比，高、低劑量組小鼠血清中的IL-1β 含量均有所下降（圖4），且高劑量組與對照組間差異顯著（P＜0.05）。表明，噬菌體可以使小鼠體內(nèi)的炎性細(xì)胞因子IL-1β 含量下降，從而降低炎性反應(yīng)，且高劑量組效果優(yōu)于低劑量組。

圖4 各組小鼠血清IL-1β含量的檢測結(jié)果Fig.4 The serum IL-1β content test results of mice in each group

2.5 感染小鼠血漿內(nèi)毒素的檢測結(jié)果 感染后48 h，分別采集每組各3 只小鼠的血漿，利用試劑盒檢測其中的內(nèi)毒素含量。結(jié)果顯示，高、低劑量組小鼠血漿內(nèi)毒素的含量較對照組均有所升高（圖5），且低劑量組與對照組間差異顯著（P＜0.05）。表明，噬菌體可在小鼠體內(nèi)裂解上述3 種ETEC，使其釋放出內(nèi)毒素，且低劑量組的裂解能力優(yōu)于高劑量組。

圖5 各組小鼠肝臟中內(nèi)毒素含量的檢測結(jié)果Fig.5 Liver endotoxin content test results of mice in each group

2.6 各組小鼠臨床癥狀評分及存活率測定結(jié)果 對小鼠注射高、低劑量的噬菌體再感染K88、K99 及987p 混合菌液后，統(tǒng)計72 h 內(nèi)各組小鼠的病死率并記錄每組小鼠的平均體況得分。結(jié)果顯示，對照組小鼠在感染后接近24 h 時的體況計分降至25 分以下，分?jǐn)?shù)最低，高劑量組小鼠在感染24 h 后體況計分下降為70 分左右并持續(xù)至試驗結(jié)束，而低劑量組小鼠在感染24 h 后體況計分一直維持在90 分以上。高、低劑量組及對照組小鼠的存活率分別為65%、95%及15%（圖6、圖7）。表明，噬菌體可以有效降低小鼠感染ETEC 后的死亡率，且低劑量組的防治效果優(yōu)于高劑量組。

圖6 各組小鼠體況計分統(tǒng)計結(jié)果Fig.6 Body condition score test results of mice in each group

圖7 各組小鼠存活率的統(tǒng)計結(jié)果Fig.7 Survival rate test results of mice in each group

3 討 論

耐藥ETEC 引發(fā)的新生仔豬腹瀉廣泛存在于多個國家和地區(qū)，2017 年WHO 公布的最危急的耐藥菌清單中就將超級耐藥的大腸桿菌等列入其中[14]。噬菌體具有對細(xì)菌特異、高效、快速殺傷的特點，廣泛應(yīng)用于防治呼吸道、消化道、泌尿生殖道及表皮的感染[15-18]。

噬菌體在宿主體內(nèi)的藥代動力學(xué)規(guī)律與藥物不同，且與宿主組織載菌量及治療效果之間的確切關(guān)系尚未可知。當(dāng)噬菌體的劑量很高時，大量的噬菌體吸附到細(xì)菌表面，不需要依賴于噬菌體的復(fù)制就可以殺死細(xì)菌，這種被動治療條件下噬菌體在宿主體內(nèi)不會有明顯的增殖過程[19]；噬菌體在合適的濃度下，可以通過吸附并感染細(xì)菌釋放裂解酶和穿孔素而裂解細(xì)菌，這種情況下噬菌體的殺菌過程就會伴隨噬菌體數(shù)量的增加。本研究利用噬菌體DS2開展針對K88、K99、987p 感染小鼠的防治作用發(fā)現(xiàn)，在感染后24 h 及48 h，低劑量組小鼠肝臟噬菌體的含量極顯著高于或高于高劑量組，且低劑量組小鼠的存活率和體況得分均高于高劑量組，提示低劑量噬菌體的治療效果優(yōu)于高劑量，推測這可能與低劑量噬菌體在宿主體內(nèi)增殖并且發(fā)揮了殺菌作用而高劑量噬菌體僅發(fā)揮了快速的非增殖殺菌過程有關(guān)。

噬菌體裂解宿主菌后可引起細(xì)胞外膜層脂多糖（即內(nèi)毒素）的大量釋放[20]。本研究中預(yù)防組小鼠肝臟內(nèi)毒素的含量較對照組均有所升高，與上述理論一致，但內(nèi)毒素含量與動物死亡之間的規(guī)律還未知。另外，本研究結(jié)果顯示，當(dāng)被ETEC 侵染后，對照組小鼠炎性細(xì)胞因子IL-1β 含量升高，預(yù)防組則降低，說明噬菌體可降低宿主ETEC 帶來的炎性反應(yīng)。襲恒豫等利用噬菌體治療乳腺炎分離菌株感染的小鼠時同樣發(fā)現(xiàn)，噬菌體治療組小鼠乳腺中的炎性細(xì)胞因子含量顯著低于對照組[21]，也與本研究實驗結(jié)果類似。

噬菌體通過特異識別宿主菌表面的脂多糖、外膜蛋白、鞭毛等結(jié)構(gòu)侵入細(xì)菌體內(nèi)并增殖，最終通過噬菌體產(chǎn)生的裂解酶和穿孔素等物質(zhì)導(dǎo)致宿主菌的裂解，并釋放子代噬菌體。噬菌體的殺菌過程高效、特異，無毒副作用。本研究結(jié)果表明噬菌體具有良好的體內(nèi)外殺菌能力，可大幅度降低由ETEC 導(dǎo)致的小鼠死亡，為仔豬ETEC感染的防控提供了新思路。