王悟敏,匡雪韶,胡佳瑤,劉文勝

中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410004

錳(Mn)是植物體所必需的微量元素。適量的錳在進(jìn)行植物光合作用以及酶反應(yīng)等新陳代謝中發(fā)揮重要作用[1]。然而,環(huán)境中過(guò)量的錳會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害[2],甚至通過(guò)食物鏈危害人類健康。錳礦開(kāi)采與利用在帶來(lái)經(jīng)濟(jì)利益的同時(shí),長(zhǎng)期不合理的開(kāi)采也導(dǎo)致礦區(qū)生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞,錳礦區(qū)污染土壤的治理與修復(fù)成了亟待解決的問(wèn)題。植物修復(fù)技術(shù)是礦區(qū)重要的治理技術(shù),與傳統(tǒng)技術(shù)相比,植物修復(fù)具有成本低、效果久、環(huán)境友好等特點(diǎn)[3]。其中,木本植物具有生物量較高、修復(fù)體系穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)。篩選出適合的植物并揭示其抗脅迫機(jī)理是進(jìn)行植物修復(fù)的關(guān)鍵。

種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)是植物對(duì)環(huán)境最敏感的階段[4]。逆境脅迫下,種子的萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)受到極大的影響,植物的種子萌發(fā)情況與幼苗生理響應(yīng)在一定程度上反映其抗逆性。研究表明,低濃度的必需元素對(duì)植物的種子萌發(fā)有促進(jìn)作用,而高濃度脅迫對(duì)種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制甚至毒害作用[5]。脅迫條件下植物的生長(zhǎng)受到抑制,生物量減少,幼苗存活率降低[6]。同時(shí),幼苗會(huì)產(chǎn)生一系列生理響應(yīng)機(jī)制來(lái)適應(yīng)該逆境環(huán)境,減輕毒害作用。例如,錳脅迫下大豆(Glycinemax)的超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性升高[7],鹽脅迫下小麥(Triticumaestivum)中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)大量積累[8],從而減輕脅迫產(chǎn)生的危害。當(dāng)然,隨著脅迫強(qiáng)度的增加與脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),植物抗脅迫體系將受到破壞,其生長(zhǎng)受到抑制。如長(zhǎng)時(shí)間高錳脅迫下青葙(Celosiaargentea)[9]、美洲商陸(PhytolaccaAmericana)[10]幼苗葉片的光合色素合成受到抑制,SOD、POD、CAT活性降低,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量下降,植物細(xì)胞受到損傷,丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量增加。因而,進(jìn)行植物種子萌發(fā)與幼苗生理的研究可揭示植物抗逆境脅迫的相關(guān)機(jī)理,這是開(kāi)展植物修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié) 。

鹽膚木(Rhuschinensis)為漆樹(shù)科(Anacardiaceae)鹽膚木屬(Rhus)落葉小喬木,在我國(guó)大部分省區(qū)均有分布,資源豐富。該植物能適應(yīng)各種環(huán)境,耐干旱、耐貧瘠,抗逆性強(qiáng),在重金屬銅、鉻、鉛脅迫下均表現(xiàn)出良好的耐受性,是廢棄地恢復(fù)的先鋒植物[11—13]。鹽膚木具有良好的觀賞價(jià)值,其蟲(chóng)癭稱“五倍子”,是一種可供醫(yī)藥、墨水、鞣革和塑料等工業(yè)用的化工原料,因而,該植物也是一種重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種[14—15]。在湖南湘潭錳礦廢棄地現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查顯示,鹽膚木在該區(qū)已自然恢復(fù)成林,生長(zhǎng)良好,開(kāi)花結(jié)實(shí)正常,說(shuō)明該植物對(duì)高錳污染土壤具有較好的適應(yīng)能力。因而,鹽膚木具有較高的生態(tài)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值,在錳污染土壤修復(fù)中具有較高的應(yīng)用潛力。然而,目前對(duì)鹽膚木在錳脅迫下的種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)及生理生化響應(yīng)機(jī)制尚未系統(tǒng)研究,這限制了該植物在礦區(qū)修復(fù)中的推廣應(yīng)用。

本文以鹽膚木作為研究對(duì)象,設(shè)置錳濃度梯度開(kāi)展鹽膚木種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn),測(cè)定脅迫后不同時(shí)間鹽膚木幼苗生理生化特征。其目的是揭示鹽膚木抗脅迫機(jī)理,為利用鹽膚木進(jìn)行重金屬錳污染土壤的植物修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鹽膚木種子在2019年11月采集于湖南省湘潭市錳礦廢棄地(27°58′N,112°51′E,海拔26 m)。該區(qū)土壤錳含量達(dá)52319.25 mg/kg,鹽膚木種群平均高度約5.0 m。采集時(shí),隨機(jī)選取50株鹽膚木采摘其果實(shí),采回的果實(shí)儲(chǔ)藏于實(shí)驗(yàn)室陰涼通風(fēng)處。果實(shí)呈褐色時(shí)去除果皮及其他雜質(zhì),將得到的種子裝入種子袋中。種子千粒重為9.785 g；種子長(zhǎng)為3 mm,寬為 4 mm 。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1萌發(fā)試驗(yàn)

根據(jù)王瓊和宋桂龍[16]的研究,鹽膚木種子硬實(shí)率高達(dá)90.2%,其種皮對(duì)于種子吸水有明顯的機(jī)械阻礙作用。因而,本研究采用徐莉清等[17]方法對(duì)種子進(jìn)行酸蝕處理以提高種子萌發(fā)率,即用98%濃硫酸浸泡90 min,然后在0.5%的KMnO4溶液中浸泡30 min,接著用去離子水徹底洗凈。

萌發(fā)實(shí)驗(yàn)參照潘高等[18]方法進(jìn)行,即用MnCl2·4H2O設(shè)置1、5、10、15、20 mmol/L共5個(gè)Mn2+濃度,以等量蒸餾水設(shè)置為對(duì)照組(CK)。每個(gè)培養(yǎng)皿25粒種子,每個(gè)濃度6個(gè)重復(fù),將培養(yǎng)皿放入人工氣候箱(溫度25 ℃,12 h光照+12 h黑暗)中進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。每24 h換一次錳溶液與濾紙,以保持脅迫濃度的恒定。每天定時(shí)記錄種子萌發(fā)情況,以胚根達(dá)到種子長(zhǎng)度的1/2時(shí)為種子萌發(fā)的標(biāo)志,連續(xù)3天內(nèi)沒(méi)有新種子萌發(fā)時(shí)萌發(fā)結(jié)束。測(cè)定幼苗生物量,計(jì)算種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)與根冠比。

1.2.2幼苗生長(zhǎng)

將預(yù)處理后的種子播種到裝有150 mL干凈純沙的杯中,放入人工氣候箱中,適量澆水,伸出子葉后用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)鹽膚木幼苗。待幼苗伸出5—6片真葉時(shí),設(shè)置與萌發(fā)試驗(yàn)相同的Mn2+濃度梯度,對(duì)照組(CK)施以等量Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。幼苗培養(yǎng)在培養(yǎng)箱中進(jìn)行,期間每3 d澆一次營(yíng)養(yǎng)液,分別在脅迫后的第7、15、30 天時(shí)測(cè)定幼苗葉片生理生化指標(biāo)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1種子萌發(fā)指標(biāo)測(cè)定

發(fā)芽率=13 d正常發(fā)芽種子數(shù)/總種子數(shù)×100%

發(fā)芽勢(shì)=4 d正常發(fā)芽種子數(shù)/總種子數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)

活力指數(shù)(VI)=GI×S

式中,Gt為在t日的發(fā)芽種子數(shù)；Dt為發(fā)芽天數(shù)；S為幼苗高度。

1.3.2幼苗生物量測(cè)定

萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,每個(gè)Mn2+濃度隨機(jī)選取20株幼苗,用游標(biāo)卡尺(0.1 mm)測(cè)量最長(zhǎng)的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)。將所有幼苗(每個(gè)濃度梯度100株,共計(jì)600株)洗凈,分成地上和地下兩個(gè)部分裝袋；于105 ℃殺青5 min,再于烘箱中70 ℃烘干24 h直至恒重,用萬(wàn)分之一天平測(cè)定生物量。

根冠比=地下部分干重/地上部分干重

1.3.3幼苗生理生化指標(biāo)測(cè)定

在脅迫第7、15、30天時(shí)取不同處理下鹽膚木幼苗新鮮葉片進(jìn)行測(cè)定,各個(gè)生理指標(biāo)做3個(gè)重復(fù)。

(1)葉綠素含量

取新鮮葉片0.2 g用80%丙酮研磨提取,上清液在紫外分光光度計(jì)下測(cè)646 nm、663 nm和470 nm處的吸光值,按Chavoushi等[19]的方法計(jì)算葉綠素含量(mg/g FW(鮮重))。

(2)抗氧化酶活性

參照Gao等[20]的方法,取新鮮葉片0.1 g于預(yù)冷的研缽中,用5 mL的磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L,pH 7.8)將葉子研磨至勻漿,于4 ℃下8000 r/min離心15 min,取上清液待測(cè)。SOD活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定,以抑制NBT光還原的50%為一個(gè)SOD酶活性單位(U/g FW)；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定,以每分鐘內(nèi)470 nm處吸光值升高0.01為一個(gè)POD酶活性單位(U g-1min-1FW)；CAT活性采用紫外吸收法測(cè)定,以每分鐘內(nèi)240 nm處吸光值減少0.01為一個(gè)CAT酶活性單位(U g-1min-1FW)。

(3)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量

參照等Li[21]的方法,取新鮮葉片0.2 g?？扇苄蕴呛坑幂焱壬y(cè)定,在紫外分光光度計(jì)下測(cè)620 nm處的吸光值；可溶性蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)G—250法測(cè)定,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn),在紫外分光光度計(jì)下測(cè)595 nm處的吸光值；脯氨酸含量用酸性茚三酮顯色法測(cè)定,使用3%磺基水楊酸溶液5 mL,在沸水浴中提取10 min,冷卻后過(guò)濾至干凈管子。將2 mL濾液與2 mL酸性茚三酮和2 mL冰醋酸混合,混合物在沸水浴中加熱30 min。冷卻后加入4 mL甲苯,于3000 r/min離心5 min。以甲苯作為空白,上層液在紫外分光光度計(jì)下測(cè)520 nm處的吸光值。

(4)MDA含量

參照Gao等[20]的方法,取新鮮葉片0.2 g,加入石英砂和10%三氯乙酸磨成勻漿狀,于3000 r/min離心10 min。取2 mL提取液,以等量蒸餾水作對(duì)照,加入0.67% TBA溶液2 mL混勻,沸水浴15 min,冷卻后再離心。使用紫外分光光度計(jì)在450 nm、532 nm和600 nm處測(cè)量上清液。

1.3.4數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),計(jì)算平均值與標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 22.0進(jìn)行ANOVA單因素方差分析,運(yùn)用LSD多重比較法(顯著性水平設(shè)為0.05)對(duì)不同濃度處理下的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)進(jìn)行差異性分析。利用Sigma Plot 12.5進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度錳脅迫對(duì)鹽膚木種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)的影響

萌發(fā)試驗(yàn)開(kāi)始后第2天發(fā)現(xiàn)有種子開(kāi)始萌發(fā),第13天后種子大部分種子已萌發(fā)完畢。錳脅迫下鹽膚木種子發(fā)芽率在80.0%—81.6%之間,不同Mn2+濃度下種子發(fā)芽率差異不顯著。種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)則呈先升后降的趨勢(shì)。Mn2+濃度為1 mmol/L時(shí)種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)最高；20 mmol/L時(shí)最低,分別比CK下降19.05%、9.65%、85.70%(表1)。

表1 錳脅迫下鹽膚木種子發(fā)芽情況Table 1 Germination of R. chinensis seeds under manganese stress

根長(zhǎng)、幼根干重、幼苗干重、總干重等呈先升后降的趨勢(shì)。總干重在Mn2+濃度為1 mmol/L時(shí)最大,10—20 mmol/L處理下比CK顯著下降(P<0.05),20 mmol/L時(shí)比CK下降23.98%,說(shuō)明在高濃度時(shí)鹽膚木幼苗生長(zhǎng)受到抑制。根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、幼根干重、幼苗干重表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)(表2)。

表2 錳脅迫下鹽膚木幼苗生物量Table 2 Biomass of R. chinensis seedlings under manganese stress

2.2 錳脅迫對(duì)鹽膚木葉片中光合色素含量的影響

脅迫7 d時(shí),鹽膚木葉片中葉綠素a、葉綠素b含量、葉綠素a/b呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)。葉綠素a、葉綠素b含量在Mn2+濃度為10 mmol/L時(shí)最高,比CK增加6.84%、4.92%,葉綠素a/b基本保持不變；類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì),Mn2+濃度為15、20 mmol/L時(shí)均顯著高于CK(P<0.05),20 mmol/L時(shí)比CK增加17.50%(表3)。

表3 錳脅迫下鹽膚木葉片光合色素含量Table 3 Photosynthetic pigment content of R. chinensis leaves under manganese stress

脅迫15 d時(shí),鹽膚木葉片中葉綠素a、葉綠素b含量呈先增后降的趨勢(shì),Mn2+濃度為1 mmol/L時(shí)最高,15、20 mmol/L時(shí)顯著降低(P<0.05),20 mmol/L時(shí)分別比CK下降18.32%、13.33%,葉綠素a/b變化不顯著。類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì),Mn2+濃度為15 mmol/L時(shí)最高,比CK增加11.90%,20 mmol/L時(shí)最低,比CK下降7.14%。

脅迫30 d時(shí),鹽膚木葉片中葉綠素a、葉綠素b含量呈先增后降的趨勢(shì),Mn2+濃度為20 mmol/L時(shí)最低,分別比CK下降29.50%、20.68%,葉綠素a/b變化不顯著。類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),Mn2+濃度為10—20 mmol/L時(shí)比CK顯著降低(P<0.05),20 mmol/L時(shí)比CK下降22.45%。

2.3 錳脅迫對(duì)鹽膚木葉片中抗氧化酶活性的影響

脅迫7、15 d時(shí),鹽膚木葉片中SOD活性均顯示出隨Mn2+濃度的升高而升高的趨勢(shì),Mn2+濃度為20 mmol/L時(shí)達(dá)到最高,分別為CK的1.40、1.72倍。脅迫30 d時(shí),鹽膚木葉片中SOD活性在Mn2+濃度小于為10 mmol/L時(shí)隨濃度的升高而升高(P<0.05),20 mmol/L時(shí)SOD活性為CK的1.76倍(圖1)。

脅迫7 d時(shí),鹽膚木葉片中POD活性隨Mn2+濃度的升高而升高,Mn2+濃度為20 mmol/L時(shí)達(dá)到最高,為CK的11.21倍。脅迫15、30 d時(shí),POD活性隨Mn2+濃度升高呈現(xiàn)出先升高再下降的趨勢(shì)。脅迫15 d時(shí),Mn2+濃度為10 mmol/L時(shí)達(dá)到最高,為CK的4.96倍；脅迫30 d時(shí),Mn2+濃度為5 mmol/L時(shí)達(dá)到最高,為CK的3.64倍,均顯著高于20 mmol/L時(shí)的POD活性(P<0.05)(圖1)。

脅迫7 d時(shí),鹽膚木葉片中CAT活性隨Mn2+濃度的升高而升高,Mn2+濃度為20 mmol/L時(shí)達(dá)到最高,為CK的1.95倍。脅迫15、30 d時(shí),CAT活性隨Mn2+濃度升高呈現(xiàn)出先升高再下降的趨勢(shì)。脅迫15 d時(shí),Mn2+濃度為15 mmol/L時(shí)達(dá)到最高,為CK的3.28倍；脅迫30 d時(shí),Mn2+濃度為10 mmol/L時(shí)達(dá)到最高,為CK的4.39倍,均顯著高于20 mmol/L時(shí)的CAT活性(P<0.05)(圖1)。

圖1 錳脅迫下鹽膚木葉片SOD、POD、CAT活性Fig.1 SOD,POD and CAT activities of R. chinensis leaves under manganese stressSOD:超氧化物歧化酶Superoxide dismutase;POD:過(guò)氧化物酶Peroxidase;CAT:過(guò)氧化氫酶Catalase;FW:鮮重Fresh weight;柱狀圖上不同的小寫字母代表不同濃度之間差異顯著(P<0.05)

2.4 錳脅迫對(duì)鹽膚木葉片中可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量的影響

脅迫7、15 d時(shí),鹽膚木葉片中可溶性糖含量隨Mn2+濃度的升高而升高,Mn2+濃度達(dá)到20 mmol/L時(shí)均顯著高于CK(P<0.05),分別為CK的1.46、1.50倍。脅迫30 d時(shí),可溶性糖含量呈先升后降的趨勢(shì),Mn2+濃度為15 mmol/L時(shí)達(dá)到峰值,為CK的1.55倍(圖2)。

脅迫7、15 d時(shí),鹽膚木葉片中可溶性蛋白含量呈先升高后降趨勢(shì),Mn2+濃度為15 mmol/L時(shí)達(dá)到峰值,分別為CK的2.40、2.39倍。脅迫30 d時(shí),與脅迫7、15 d時(shí)的趨勢(shì)相同,10 mmol/L時(shí)達(dá)到峰值,為CK的2.14倍(圖2)。

脅迫7 d時(shí),鹽膚木葉片中游離脯氨酸含量呈增加的趨勢(shì),在Mn2+濃度為10—20 mmol/L時(shí)顯著升高(P<0.05),Mn2+濃度達(dá)到20 mmol/L時(shí)為CK的5.80倍。在脅迫15、30 d時(shí),游離脯氨酸含量呈先升后降的趨勢(shì),15 mmol/L時(shí)達(dá)到峰值,分別為CK的7.96、3.69倍(圖2)。

圖2 錳脅迫下鹽膚木葉片可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量Fig.2 Contents of soluble sugar,soluble protein and free proline in leaves of R. chinensis under manganese stress

2.5 錳脅迫對(duì)鹽膚木葉片中MDA含量的影響

脅迫7 d時(shí),鹽膚木葉片中MDA含量在不同Mn2+濃度處理之間沒(méi)有顯著差異。脅迫15 d時(shí),MDA含量在Mn2+濃度為1、5 mmol/L處理下與CK之間沒(méi)有顯著差異,10—20 mmol/L時(shí)MDA含量顯著升高(P<0.05)。脅迫30 d時(shí),MDA含量在Mn2+濃度為5—20 mmol/L處理下均顯著升高(P<0.05),分別為CK的2.69、4.31、5.73、7.03倍(圖3)。

圖3 錳脅迫下鹽膚木葉片MDA含量Fig.3 MDA content of R. chinensis leaves under manganese stressMDA:丙二醛Malondialdehyde

3 討論

3.1 種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)

植物種子的萌發(fā)情況可反映出植物在脅迫情況下的生命力。種子發(fā)芽勢(shì)反映脅迫下植物種子的出芽速度與整齊度。發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)反映污染物對(duì)種子發(fā)芽的脅迫情況。本文研究結(jié)果顯示,錳脅迫下鹽膚木種子發(fā)芽率均達(dá)80%以上,且不同Mn2+濃度下發(fā)芽率無(wú)顯著差異。這與鎘脅迫對(duì)不同品種糜子(Panicummiliaceum)的種子發(fā)芽率的影響[22]結(jié)果類似。這說(shuō)明鹽膚木種子具有一定的錳耐受性。而種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)則存在顯著差異,呈先升后降的趨勢(shì)。這與錳脅迫下蒼耳(Xanthiumsibiricum)種子萌發(fā)[18]規(guī)律一致。Mn2+濃度為1 mmol/L時(shí),種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)均升高,這是因?yàn)楸匦柙胤e累是植物種子發(fā)芽的先決條件。錳作為必需元素,其在種子萌發(fā)過(guò)程中在種子胚根中積累,可促進(jìn)種子萌發(fā)[23]。

錳脅迫下鹽膚木幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)出隨著錳濃度的升高而先升后降的現(xiàn)象。這與鉛鋅脅迫下毛竹(Phyllostachyspubescens)[5]、鉛脅迫下金花茶(Camelliapetelotii)[24]幼苗生長(zhǎng)影響結(jié)果一致,說(shuō)明重金屬對(duì)植物生長(zhǎng)的低促高抑作用是一種普遍現(xiàn)象。本文研究結(jié)果顯示,錳脅迫對(duì)鹽膚木幼苗地上部分影響較小,而對(duì)根的抑制顯著,說(shuō)明錳脅迫對(duì)鹽膚木根的抑制大于芽。這與錳脅迫對(duì)紫花苜蓿(Medicagosativa)和地三葉草(Trifoliumrepens)[6]幼苗的影響相同。錳脅迫對(duì)鹽膚木根部生長(zhǎng)的影響顯著高于對(duì)芽生長(zhǎng)的影響,這與鉛脅迫下綠豆(Vignaradiata)種子及幼苗生長(zhǎng)規(guī)律相似[25]。其原因是幼根作為直接吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)土壤中重金屬的器官,與脅迫環(huán)境直接接觸,這使得其受到的毒害作用大于芽。

3.2 光合色素

光合色素是植物進(jìn)行光合作用時(shí)吸收、傳遞光能,引起光化學(xué)反應(yīng)的色素,它能夠較好反映植物光合作用的能力[26]。本文研究結(jié)果顯示,鹽膚木葉片的葉綠素a、葉綠素b含量均呈現(xiàn)隨著Mn2+濃度升高而先升后降的趨勢(shì),葉綠素a/b則變化不顯著。脅迫7 d時(shí),在Mn2+濃度為10 mmol/L時(shí)出現(xiàn)明顯的促進(jìn)作用；脅迫15、30 d時(shí),1 mmol/L時(shí)促進(jìn),15—20 mmol/L時(shí)出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。這與錳脅迫下青葙[9]、鎘脅迫下梭魚(yú)草(Pontederiacordata)[27]葉片的葉綠素含量變化趨勢(shì)一致。這是由于錳元素是光合色素形成的重要元素,還直接參與光合作用中的光合放氧過(guò)程。適量的錳可以促進(jìn)鹽膚木葉片中葉綠素的合成,但在高濃度錳脅迫下植物葉綠體正常結(jié)構(gòu)遭到破壞,葉綠素合成減少[28—29]。其次,Mn2+的結(jié)合能力較強(qiáng),過(guò)量的錳會(huì)抑制Mg2+、Fe2+的吸收,Mg2+和Fe2+是葉綠素的重要組成,Mg2+、Fe2+的吸收的減少使得葉綠素的合成減少,光合能力減弱[30]。另外,葉綠素a主要作為光合中心色素等參與光系統(tǒng)反應(yīng),葉綠素b主要作為天線色素參與能量傳遞,二者具有不同的功能。本文研究中,鹽膚木幼苗在錳脅迫下較好地保持了葉綠素a/b值,說(shuō)明其在高錳脅迫下仍能有效地利用葉綠體進(jìn)行光合作用。

3.3 抗氧化酶活性

脅迫15、30 d時(shí),高M(jìn)n2+濃度下SOD活性仍然較高；POD、CAT活性則明顯下降。這與鉻脅迫下鹽膚木[14]、錳脅迫下野大豆(Glycinesoja)[34]、鎘與鋅脅迫下煙草(Nicotianatabacum)[35]抗氧化酶活性變化規(guī)律一致。這是由于SOD、POD、CAT為植物體內(nèi)重要的抗氧化酶,在一定程度脅迫時(shí)可提高其含量來(lái)應(yīng)對(duì)脅迫環(huán)境。但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)、強(qiáng)度的增加,SOD、POD、CAT活性受到一定程度的抑制,說(shuō)明過(guò)高濃度、過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的錳脅迫使鹽膚木抗氧化體系遭到破壞,從而削弱了其保護(hù)能力,造成對(duì)植物體的損傷,最終導(dǎo)致其生物量的降低。因而,抗氧化酶系統(tǒng)通過(guò)調(diào)節(jié)酶活性來(lái)緩解脅迫環(huán)境,是植物體響應(yīng)逆境脅迫的一種適應(yīng)機(jī)制。

3.4 可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量

在逆境環(huán)境中,植物都會(huì)產(chǎn)生逆境脅迫導(dǎo)致的直接或者間接水分缺失,其生理生化過(guò)程可以反映植物的應(yīng)對(duì)機(jī)制,此時(shí)植物體內(nèi)會(huì)大量的積累可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)保持細(xì)胞內(nèi)水分平衡,以維持細(xì)胞正常生命代謝活動(dòng),減輕脅迫對(duì)植物帶來(lái)的傷害[36]。本文研究結(jié)果表明,鹽膚木葉片中可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量在植物受到錳脅迫時(shí)隨Mn2+濃度升高而升高,但在長(zhǎng)期、高濃度錳脅迫下其含量降低。這與錳脅迫下黃花草(Cleomeviscosa)[37]、小飛蓬(Comnyzacanadensis)、杠板歸(Polygonumperfoliatum)、美洲商陸[38]的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化趨勢(shì)相同。脯氨酸和可溶性糖是2種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),脯氨酸具有很高的水溶性,可溶性糖是合成有機(jī)溶質(zhì)的碳架和能量來(lái)源,它們可使水分的跨膜運(yùn)輸朝著有利于植物生長(zhǎng)的方向發(fā)展。植物體內(nèi)的可溶性蛋白大多是參與代謝的酶類,其含量高低反映植物代謝強(qiáng)度；同時(shí),可溶性蛋白具較強(qiáng)的親水性,可提高細(xì)胞保水性能,有效防止其脫水。在本研究中,一定時(shí)間內(nèi)隨Mn2+濃度的升高,鹽膚木幼苗能夠通過(guò)提高體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來(lái)緩解錳毒害,使其具有一定抗逆性。但隨著脅迫強(qiáng)度的增強(qiáng)與脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成受阻,其含量減少,這種滲透調(diào)節(jié)機(jī)制被破壞,導(dǎo)致鹽膚木幼苗受到一定傷害[39]。因而,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的調(diào)節(jié)是植物應(yīng)對(duì)錳脅迫的一種重要機(jī)制。

3.5 MDA含量

MDA是植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物。在逆境環(huán)境下,植物細(xì)胞中的活性氧產(chǎn)生與清除平衡會(huì)被破壞,自由基大量積累造成細(xì)胞膜脂過(guò)氧化,植物體內(nèi)MDA含量增加。因而,MDA含量高低可反映植物遭受毒害的程度,同時(shí)也能體現(xiàn)植物抗逆性高低[10]。本文研究結(jié)果顯示,脅迫7 d或Mn2+濃度低于10 mmol/L時(shí)鹽膚木幼苗葉片中MDA含量無(wú)明顯變化；脅迫30 d或Mn2+濃度高于10 mmol/L時(shí)鹽膚木幼苗葉片中MDA含量增加。這與中等鹽水平下蓖麻(Ricinuscommunis)幼苗葉片中MDA含量沒(méi)有顯著增加[40],錳脅迫下蒼耳[41]、鹽脅迫下越橘(Vaccinumcorymbosum)[42]、馬尾松(Pinusmassoniana)[43]MDA含量隨脅迫濃度增加均增加的趨勢(shì)一致。這說(shuō)明在短時(shí)間或較低錳濃度的脅迫時(shí)細(xì)胞未受到明顯傷害,鹽膚木具有一定的抗逆能力。而當(dāng)脅迫濃度過(guò)高或脅迫時(shí)間延長(zhǎng)時(shí),鹽膚木受到毒害作用,葉片細(xì)胞遭受破壞,細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度隨Mn2+濃度的升高和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而加重,從而在體內(nèi)積累MDA。

本文研究結(jié)果表明,鹽膚木在錳脅迫下發(fā)芽率較高,在Mn2+濃度為10 mmol/L時(shí)SOD、POD、CAT活性、滲透調(diào)節(jié)物種含量仍然較高,說(shuō)明該植物適應(yīng)錳脅迫能力較強(qiáng),為修復(fù)錳污染土壤的候選植物。

4 結(jié)論

錳脅迫下鹽膚木種子發(fā)芽率較高,Mn2+濃度對(duì)發(fā)芽率影響較小；幼苗生長(zhǎng)隨著Mn2+濃度的增加而呈先升后降的趨勢(shì)。鹽膚木幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b含量在低Mn2+濃度下上升,但隨著脅迫程度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),葉綠素a、葉綠素b含量均降低。短期或低Mn2+濃度下幼苗SOD、POD、CAT活性隨Mn2+濃度的升高而增強(qiáng)；長(zhǎng)期的高錳脅迫下POD、CAT活性下降。短期Mn2+濃度處理下可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量增加,長(zhǎng)期高錳脅迫下則下降。隨著脅迫程度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),MDA含量增加。本研究說(shuō)明鹽膚木具有較強(qiáng)的耐錳能力,是錳礦區(qū)修復(fù)的理想候選植物,它能通過(guò)產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及提高抗氧化酶活性等方式來(lái)適應(yīng)錳脅迫環(huán)境。