謝平，陳秋樺，許鑫鑫，沈金海，郝春莉，林麗麗，陳良華

1.廈門華廈學(xué)院環(huán)境與公共健康學(xué)院，福建 廈門 361024；2.生化制藥福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361024；3.廈門市食品藥品安全重點實驗室，福建 廈門 361024；4.福建省亞熱帶植物研究所，福建 廈門 361006

涼粉草為唇形科涼粉草屬多年生草本植物涼粉草Benth.的干燥全草。藥理研究表明，涼粉草具有抗心腦血管疾病、抗衰老、抗氧化、降血糖、降血壓及保肝等多種功效。涼粉草已收載于《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（第三冊）》、《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 第二卷（2011年版）》及《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》等，尚缺乏完善的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，隨著研究不斷深入及藥材需求量不斷提高，建立全面的藥材質(zhì)量分析和控制方法尤為重要。

單一成分無法全面評價中藥材的整體質(zhì)量，而指紋圖譜可以全面反映中藥材成分的數(shù)量及種類；化學(xué)模式識別可以對指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)降維、識別和分類，強(qiáng)調(diào)其差異性，用于篩選質(zhì)量差異標(biāo)志物；TOPSIS（逼近理想解排序法）對評價對象與最優(yōu)項的接近程度進(jìn)行綜合排序，可用于藥材的質(zhì)量綜合評價。本研究建立15批不同來源涼粉草的指紋圖譜，結(jié)合聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）等化學(xué)模式識別方法，評價不同來源涼粉草的穩(wěn)定性和一致性，篩選質(zhì)量差異標(biāo)志物，對其進(jìn)行含量測定，構(gòu)建TOPSIS模型，進(jìn)行綜合評價分析，實現(xiàn)對涼粉草藥材的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

LC-20A高效液相色譜儀、SPD-M20A PDA檢測器、LCsolution色譜工作站，日本島津公司；XS205十萬分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；CT15RT型臺式高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；BSA224S萬分之一電子天平，賽多利斯上海有限公司；HH-2型恒溫水浴鍋，江蘇常州華普達(dá)有限公司；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FW-80型中草藥粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司。

異槲皮苷對照品（批號RP200202，純度≥98%）、迷迭香酸對照品（批號RP180607，純度≥98%），成都麥德生科技有限公司；紫云英苷對照品（批號D20021105，純度≥98%）、咖啡酸對照品（批號D18121724，純度≥98%）、紫草酸對照品（批號D19041017，純度≥98%）、丹酚酸B對照品（批號D19110407，純度≥98%），南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。15批涼粉草樣品，經(jīng)廈門華廈學(xué)院環(huán)境與公共健康學(xué)院賴源發(fā)副教授鑒定為唇形科植物涼粉草Benth.的干燥全草，來源信息見表1。

表1 15批涼粉草樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液制備

精密稱定對照品適量，加入甲醇制成濃度分別為咖啡酸0.086 mg/mL、異槲皮苷0.115 mg/mL、紫云英苷0.167 mg/mL、迷迭香酸0.187 mg/mL、紫草酸0.089 mg/mL、丹酚酸B 0.093 mg/mL的混合對照品溶液，置4 ℃冰箱冷藏備用。

2.2 供試品溶液制備

精密稱取涼粉草樣品粉末（過3號篩）約1.0 g，置索氏提取器中，加石油醚（60～90 ℃）100 mL，加熱回流至近無色，棄去石油醚，揮干，加入60%乙醇30 mL回流提取2 h，濃縮至浸膏，20%乙腈復(fù)溶，定量轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

采用中譜紅RD-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～9.5 min，18%A；9.5～18.5 min，18%→19%A；18.5～20 min，19%→20%A；20～25 min，20%→22%A；25～35 min，22%→24%A；35～42 min，24%→30%A；42～50 min，30%→18%A），流速1.0 mL/min，檢測波長320 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗

取涼粉草樣品（S1），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以7號峰的保留時間和峰面積為參照，計算共有色譜峰的相對保留時間（RRT）和峰面積比值（PAR），結(jié)果各共有峰RRT的RSD均小于0.5%，PAR的RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗

取涼粉草樣品（S1）6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算各共有峰RRT的RSD均小于0.5%，PAR的RSD均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

取同一批（S1）涼粉草樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件，于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測定，記錄色譜峰，結(jié)果各共有峰RRT的RSD均小于1.5%，PAR的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 指紋圖譜建立及相似度評價

取15批涼粉草樣品適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，導(dǎo)入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件》（2012版），設(shè)置時間窗寬度為0.1 min，采用中位數(shù)法生成指紋圖譜共有模式，選取S1作為參照，進(jìn)行多點校正，建立涼粉草藥材指紋圖譜。15批樣品共確定14個共有峰，指認(rèn)出其中6種成分，分別為咖啡酸（2號峰）、異槲皮苷（5號峰）、紫云英苷（7號峰）、迷迭香酸（9號峰）、紫草酸（10號峰）、丹酚酸B（12號峰），見圖1。經(jīng)前期試驗確認(rèn)，涼粉草藥材中迷迭香酸含量較高，分離度較好，出峰時間穩(wěn)定，故以其作為參照峰，計算其他峰的RRT和PAR。15批不同來源涼粉草的相似度為0.718～0.998，除S8樣品外，其他涼粉草樣品的相似度均大于0.900，表明樣品整體差異較小。見表2。

表2 15批涼粉草指紋圖譜相似度評價結(jié)果

圖1 15批涼粉草HPLC指紋圖譜及色譜峰指認(rèn)

2.5 聚類分析

采用SPSS22.0軟件將14個共有峰峰面積標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行聚類分析（組間聯(lián)接法結(jié)合平方歐式距離），結(jié)果見圖2。當(dāng)分類距離為10時，可分為3類：S3、S15樣品各為一類，其他樣品為一類；當(dāng)分類距離為5時，15批樣品可聚為5類。

圖2 15批涼粉草樣品聚類分析樹狀圖

2.6 主成分分析

以14個共有峰的峰面積為變量，采用SPSS22.0軟件進(jìn)行主成分分析。4個主成分特征值＞1，坡度較陡，累計方差貢獻(xiàn)率為83.165%，可反映指紋圖譜的主要信息。主成分1貢獻(xiàn)率為29.981%，色譜峰3、8、9、10、11、13具有較高載荷值；主成分2貢獻(xiàn)率為22.538%，色譜峰2、5、6具有較高載荷值；主成分3貢獻(xiàn)率為17.385%，色譜峰1、7、12、14具有較高載荷值；主成分4貢獻(xiàn)率為13.261%，色譜峰7、11具有較高載荷值。表明多種成分共同引起涼粉草的質(zhì)量差異。見表3、表4、圖3。

圖3 涼粉草樣品主成分分析碎石圖

根據(jù)表3、表4計算得到4個主成分的特征向量，綜合評分模型F＝0.299 81F＋0.225 38F＋0.173 85F＋0.132 61F，其中，系數(shù)為各主成分的方差貢獻(xiàn)率，F(xiàn)、F、F、F為4個主成分的得分（見表5）。

表3 涼粉草樣品主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

表4 涼粉草樣品特征圖譜共有峰旋轉(zhuǎn)后因子載荷矩陣

表5 15批涼粉草樣品主成分得分

2.7 正交偏最小二乘判別分析

以15批涼粉草樣品為研究對象，以指紋圖譜14個共有峰的相對峰面積作為變量，導(dǎo)入SIMCA14.1軟件，OPLS-DA得分圖見圖4。可以看出，S4、S10、S1、S6、S7、S5、S14為第1類，S9、S12、S11、S2、S8為第2類，其余為第3類，與聚類分析結(jié)果一致。以變量重要性投影（VIP）＞1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選引起質(zhì)量差異的標(biāo)志性成分，共有峰VIP見圖5。結(jié)果表明，VIP值由大到小依次為色譜峰11、5、1、2、12、7、3，其中5、2、12、7號峰分別為異槲皮苷、咖啡酸、丹酚酸B、紫云英苷，其他成分有待鑒別。

圖4 15批涼粉草樣品OPLS-DA得分

圖5 涼粉草樣品指紋圖譜共有峰VIP

2.8 咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B含量測定

2.8.1 系統(tǒng)適用性試驗

按“2.3”項下色譜條件，精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL進(jìn)樣，結(jié)果表明，各色譜峰分離度良好，樣品測定無干擾。

2.8.2 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 mL，置10 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL，進(jìn)樣測定，以對照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表6。

表6 涼粉草中4種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.8.3 精密度試驗

取混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積，計算RSD，結(jié)果咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B峰面積的RSD分別為1.82%、0.10%、0.92%、1.28%，表明儀器精密度良好。

2.8.4 重復(fù)性試驗

分別稱取同一批（S1）涼粉草樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定，結(jié)果咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B的平均含量分別為0.151 3、0.514 1、0.566 8、0.742 1 mg/g，RSD分別為0.72%、1.15%、1.06%、0.74%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8.5 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，室溫放置0、2、4、6、8、12 h，按“2.3”項下色譜條件測定，記錄峰面積，結(jié)果咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.86%、2.03%、0.39%、2.42%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8.6 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的涼粉草樣品粉末（過3號篩）0.5 g，平行6份，分別加入約與樣品中待測成分含量相等的對照品，按“2.2”項下方法制備，按“2.3”項下色譜條件測定，計算咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B的加樣回收率及RSD，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確性良好，見表7。

表7 涼粉草中4種成分加樣回收率試驗結(jié)果

2.8.7 樣品含量測定

取15批涼粉草樣品粉末（過3號篩），按“2.2”項下方法制備，按“2.3”項下色譜條件測定，每批重復(fù)測定3次，取平均值，結(jié)果見表8。15批涼粉草樣品的咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B含量分別為0.085 2～0.298 5 mg/g、0.061 6～1.424 5 mg/g、0.079 3～1.507 2 mg/g、0.074 4～0.897 5 mg/g。

表8 15批涼粉草藥材含量測定結(jié)果（mg/g，n＝3）

2.9 TOPSIS分析

表9 15批涼粉草TOPSIS歸一化處理后矩陣

表10 15批涼粉草樣品TOPSIS分析結(jié)果

3 討論

本試驗分別考察甲醇、乙腈與0.1%磷酸水、0.1%甲酸水、0.2%甲酸水組成的流動相系統(tǒng)。其中乙腈洗脫能力優(yōu)于甲醇，分析時間較短；0.1%甲酸水溶液作為水相可有效改善峰形，系統(tǒng)能達(dá)到較好的分離，且基線平穩(wěn)。因此，選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相系統(tǒng)。比較檢測波長為280、320、330、360 nm時各色譜峰的出峰情況，在波長320 nm處所得共有峰多，各峰分離度較好、響應(yīng)較強(qiáng)且基線較平穩(wěn)。

15批涼粉草藥材指紋圖譜共確定了14個共有峰，并指認(rèn)出6種成分。不同提取方式對藥材成分的溶出有一定影響，經(jīng)比較水提、醇提的指紋圖譜峰，水提成分較少、含量較低、分離度較差，故采用乙醇回流方法提取。15批涼粉草樣品的相似度為0.718～0.998，原因可能為種植模式、氣候條件、地理環(huán)境及市售混合等對次生代謝成分的積累不同。

涼粉草主要生長在福建、廣東，野生資源相對較多，導(dǎo)致其品質(zhì)存在一定差異，進(jìn)而可能影響藥效及使用。本研究采用HPLC建立涼粉草藥材的指紋圖譜，并進(jìn)行聚類分析、主成分分析、OPLS-DA。確定了14個共有峰，共有峰的相對保留時間差異較小，但相對峰面積差異較大，表明化學(xué)成分相同但其含量差異較大；由聚類分析結(jié)果可知，除S3、S15外均聚為一類，S3、S15樣品為市售，可能與其系多個產(chǎn)地的混合樣品有關(guān)；氣候環(huán)境、提取工藝同樣對藥材及其制劑的內(nèi)在品質(zhì)產(chǎn)生影響。主成分分析共提取出4個主成分，可反映15批樣品83.17%的信息。結(jié)合OPLS-DA，異槲皮苷、咖啡酸、丹酚酸B、紫云英苷為涼粉草藥材質(zhì)量差異的主要標(biāo)志性成分。15批不同來源涼粉草藥材含量測定結(jié)果顯示，S13（越南）樣品中除咖啡酸外，其他成分含量均較高，可能與其生長地理位置、土壤、水源、光照等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。異槲皮苷具有保護(hù)心腦血管、降壓、降脂、抗抑郁等生物活性，咖啡酸是抗炎抑菌、調(diào)節(jié)代謝等生物活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，丹酚酸B為治療冠心病、心絞痛的主要藥效物質(zhì)，紫云英苷能保護(hù)心臟、神經(jīng)系統(tǒng)、抗?jié)儭⒖估w維化，可作為質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。本研究通過建立HPLC指紋圖譜和含量測定方法，結(jié)合化學(xué)模式識別及TOPSIS分析，可為評價涼粉草藥材質(zhì)量提供依據(jù)。