薦 坤，李蘭石，王 穎

（遼寧中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，遼寧 沈陽 110847）

急性心肌梗死（AMI）是基于冠脈粥樣硬化，由冠狀動脈急性缺血、缺氧導致的心肌壞死性疾?。?］。心肌細胞的急性缺血缺氧是AMI 發(fā)生發(fā)展的機制，因此，能有效遏制心肌細胞發(fā)生急性缺血缺氧是治療的中心。ATP 敏感性鉀離子通道（ATP sensitive potassium channel ，KATP通道）是被ATP 濃度影響的內(nèi)向整流鉀通道［2］，被稱作是心肌缺血、缺氧缺血再灌注損傷及缺血預適應的終末段效應通道，現(xiàn)已經(jīng)成為保護心肌細胞相關研究的新方向［3］。KATP通道是由內(nèi)向整流鉀通道亞基（Kir6.1/Kir6.2）和磺酰脲類受體亞基（SUR1/SUR2）兩個部分構(gòu)成的，Kir6.1/Kir6.2 在 通 道 上 形 成 小 孔，SUR1/SUR2 從旁起調(diào)節(jié)作用。KATP通道在生理情況下處于關閉狀態(tài)，而當發(fā)生缺血或壞死時，會經(jīng)刺激活化開放，表達量大大增加，加強了IKATP電流的密度，介導了對心肌的保護［4］。

在前期的相關領域，針刺內(nèi)關穴對瞬時外向鉀離子通道和內(nèi)向整流鉀離子通道相關蛋白的調(diào)節(jié)作用已經(jīng)被證實［5，6］，本實驗將進一步探討針藥結(jié)合對AMI 大鼠KATP通道相關蛋白（Kir6.1、Kir6.2）表達的影響，為臨床治療心肌梗死提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康雄性SD 大鼠65 只，購自遼寧長生生物科技有限公司［許可證號：SYXK（遼）2013-0009］，體質(zhì)量（200±20）g，實驗操作中遵守實驗動物倫理規(guī)范，倫理批號：21000092018010，所有大鼠在室溫23～25℃、相對濕度45%～55%的同等條件動物飼養(yǎng)房下適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機取10 只SD 大鼠作空白對照組，其余大鼠經(jīng)MI 誘導成心肌梗死模型，將造模成功的40 只存活大鼠，隨機等分為4 組，包括模型組、針刺組、西藥組、針藥結(jié)合組。

1.2 實驗用藥與儀器

水合氯醛（索萊公司T8590）；鹽酸異丙腎上腺素（美國SIGMA 公司）；生理鹽水（辰欣藥業(yè)股份有限公司）；阿司匹林腸溶片（Bayer，國藥準字J20171021）；單硝酸異山梨酯（Lu-nan，國藥準字H10940039）。高脂飼料［科澳協(xié)力，許可證號：SCXK（京）2019-0001］。自擬蹊徑通脈湯由蜈蚣、牛膝、茯苓、水蛭、土鱉蟲、降香、白僵蠶、丹參、石菖蒲、麥冬、甘草、川芎、當歸組成，來源于遼寧中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院并由其制成湯劑。冷藏保存。

生物機能實驗系統(tǒng)（泰盟科技，BL-420S）；6805-D 型電針儀（汕頭市醫(yī)用設備有限公司）；華佗牌針灸針（規(guī)格0.18 mm×25 mm）（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；?80 ℃超低溫冰箱（日本SANYO 電器集團）；EPS600 電泳儀（Tanon）；低溫離心機（Jouan SA）；多功能酶標儀（TECAN）；超微量核酸蛋白分析儀（Biodrop）等。

1.3 模型制備

對照組大鼠采用普通飼料（15 g/只）喂養(yǎng)3 周，其余大鼠飼以等量高脂肪食物3 周。飲水不限，3 周后描記心電圖。對照組的大鼠進行皮下多點位注射生理鹽水（85 mg/kg），其他各組大鼠以相同方法進行注射相對等量鹽酸異丙腎上腺素（85 mg/kg），間隔24 h 注射1 次，共計2 次，描記心電圖。當心電圖出現(xiàn)R 波下移、ST 段抬高、病理性Q 波、QRS 波增寬等其他心律失常現(xiàn)象時則可認為造模成功［7］。

1.4 干預方法

針藥結(jié)合組針刺內(nèi)關、心俞、足三里穴每日1次，灌服蹊徑通脈湯19.35 g·kg-1·d-1，每日1 次；針刺組針刺相同腧穴每日1 次；西藥組每日灌服阿司匹林9.00 mg/kg、單硝酸異山梨酯3.6 mg 每日1 次；對照組和模型組均每日灌服等量生理鹽水每日1 次。所用腧穴均根據(jù)《實驗針灸學》［8］中大鼠針灸定位方法進行定位，選取型號為0.18 mm×25.00 mm 的“華佗牌”針灸毫針，順經(jīng)斜刺入各組穴位皮下2 mm。接6805-D 型電針儀施以疏密波，頻率為2～20 Hz，以大鼠四肢出現(xiàn)輕微震顫為度，留針15 min。依據(jù)《實驗動物學》確定大鼠每次灌胃劑量，參照公式：成人一日有效量/成人體重（按70 kg 計算）×6.3（折算系數(shù)）=X（大鼠一日有效量）×大鼠體重［9］。

1.5 取材

經(jīng)15 d 干預治療后，次日將實驗大鼠斷脊處死，迅速分離心臟組織置于冰袋上，生理鹽水清洗后，切取一部分心尖組織，4%的多聚甲醛固定1 d，轉(zhuǎn)至?80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 指標檢測

1.6.1 心電圖檢測 于造模前、后及干預治療后分別描記心電圖。10%水合氯醛麻醉大鼠，隨后以腹部向上的姿態(tài)固定于操作臺，按人體標準導聯(lián)（Ⅱ）的連接方式，將正極接在左下肢，負極接在右上肢，借助生物機能實驗系統(tǒng)描記心電圖，觀察大鼠T 波電壓變化。

1.6.2 各組大鼠心肌組織HE 染色 切取1 cm2的大鼠心尖組織，4%的多聚甲醛進行固定，共1 d，石蠟包埋，二甲苯脫蠟，用于HE 染色。準備70%、80%、90%、95%、100% 各級乙醇，分步進行梯度脫水后甩干，二甲苯透明，鏡下觀察。

1.6.3 Western Blot 分析 將心肌組織粉碎，裝入玻璃勻漿容器內(nèi)，加入10%裂解液，充分裂解后，置于冷凍離心機（4℃，12 000 r/min）離心，共10 min，取上清液，嚴格遵循BCA 蛋白試劑盒測定濃度，配置凝膠進行電泳。濕法轉(zhuǎn)入膜上，封閉1 h。配置一抗，將目標蛋白一起放入雜交袋中，37℃的水浴進行震蕩1 h 之后，4℃孵育過夜，用TBST 洗膜3 次（5 min/次），同樣方法配置二抗，用TBST 洗膜4 次（5 min/次）。使用Tanon5200 化學發(fā)光成像儀觀察結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 24.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料數(shù)據(jù)用（±s）表示，當P＜0.05 時表示差異存在統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心電圖T 波電壓變化分析

組內(nèi)比較：與造模前比較，對照組造模后心電圖T 波電壓無明顯改變（P＞0.05），其余4 組造模后心電圖T 波電壓均顯著降低（P＜0.05）；與造模后比較，對照組、模型組、針刺組治療后T 波電壓無明顯改變（P＞0.05），西藥組、針藥結(jié)合組T 波電壓均顯著升高（P＜0.05）。

組間比較：造模前，各組大鼠心電圖T 波電壓無明顯改變（P＞0.05）；造模后，與對照組比較，模型組、西藥組、針刺組、針藥結(jié)合組T 波電壓均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組、針刺組、針藥結(jié)合組均無明顯改變（P＞0.05）。治療后，與對照組比較，模型組、西藥組、針刺組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），針藥結(jié)合組T 波電壓無明顯改變（P＞0.05）；與模型組比較，西藥組、針刺組、針藥結(jié)合組T 波電壓均顯著升高（P＜0.05）；與西藥組比較，針刺組、針藥結(jié)合組組T 波電壓無明顯改變（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠T 波電壓變化（mV，n=8，±s）Tab 1 T wave voltage changes of rats in each group（mV，n=8，±s）

表1 各組大鼠T 波電壓變化（mV，n=8，±s）Tab 1 T wave voltage changes of rats in each group（mV，n=8，±s）

注：與造模前比較，△P＜0.05；與造模后比較，□P＜0.05。與對照組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，■P＜0.05；與西藥組比較，●P＜0.05。

組別對照組模型組西藥組針刺組針藥結(jié)合組F P造模前0.157±0.018 0.140±0.042 0.146±0.034 0.138±0.039 0.148±0.032 0.367 0.830造模后0.153±0.015 0.056±0.029△▲0.075±0.032△▲0.079±0.029△▲0.062±0.021△▲19.891 0.000治療后0.147±0.011 0.060±0.020△▲0.110±0.029△□▲■0.114±0.034▲■0.124±0.022△□■12.071 0.000 0.738 19.671 9.683 5.771 20.706 0.490 0.000 0.001 0.010 0.000 FP

2.2 各組大鼠心肌組織形態(tài)學變化

如圖1 所示，通過顯微鏡觀察HE 染色的心肌細胞。通過將針刺組、西藥組、針藥結(jié)合組的細胞與空白對照組、模型組的細胞進行比較，發(fā)現(xiàn)空白組心肌組織結(jié)構(gòu)正常，排列整齊緊密有序，組織內(nèi)無明顯變性和炎癥細胞浸潤。但模型組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)異常，大量心肌細胞排列不整齊、不有序，部分心肌細胞較空白組明顯萎縮，少量炎癥細胞浸潤于心肌間隙，部分心肌細胞肥大。針刺組心肌組織結(jié)構(gòu)輕度異常，心肌細胞排列方式較為整齊，心肌間隙可見少量炎癥反應細胞浸潤。西藥組輕度異常，視野上心肌細胞為橫切，部分區(qū)域間隙較大，可能為制樣所致，可見少量結(jié)締組織。心肌組織中含有平行的膠原纖維束及炎性因子。而針藥結(jié)合組大鼠與其他組大鼠相比，大鼠的心肌組織結(jié)構(gòu)基本正常，排列層次較分明，無明顯的炎性細胞浸潤組織。

圖1 各組大鼠心肌組織HE 染色后的形態(tài)學變化（×200）Fig 1 Morphological changes of myocardial tissue of rats in each group after HE staining（× 200）

2.3 各組大鼠KATP 通道相關蛋白Kir6.1、Kir6.2 表達的比較

經(jīng)Western blot 檢測結(jié)果表明，與對照組比較，模型組、西藥組、針刺組、針藥結(jié)合組大鼠KATP通道相關蛋白Kir6.1、Kir6.2 的表達量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組、西藥組、針藥結(jié)合組的Kir6.1、Kir6.2 表達量顯著降低（P＜0.05）；與西藥組比較，針刺組蛋白表達量變化不顯著（P＞0.05），針藥結(jié)合組顯著下降（P＜0.05）。見圖2、表2。

圖2 各組大鼠心肌組織中Kir6.1 和Kir6.2 蛋白表達條帶Fig 2 Kir6.1 and Kir6.2 protein expression bands in myocardial tissue of rats in each group

表2 各組大鼠心肌組織中Kir6.1 、Kir6.2 蛋白表達的變化（n=8，±s）Tab 2 Changes of Kir6.1 and Kir6.2 protein expression in myocardial tissue of rats in each group（n=8，±s）

表2 各組大鼠心肌組織中Kir6.1 、Kir6.2 蛋白表達的變化（n=8，±s）Tab 2 Changes of Kir6.1 and Kir6.2 protein expression in myocardial tissue of rats in each group（n=8，±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，∧∧P＜0.01；與西藥組比較，##P＜0.01；與針刺組比較，＆＆P＜0.01。

Kir6.2 1.104±0.018 2.068±0.078**1.641±0.041**∧∧1.711±0.069**∧∧0.958±0.055**∧∧##＆＆198.789 0.000組別對照組模型組西藥組針刺組針藥結(jié)合組FP Kir6.1 1.453±0.026 2.843±0.040**1.589±0.074**∧∧1.604±0.029**∧∧1.263±0.026**∧∧##＆＆636.099 0.000

3 討論

隨著人們物質(zhì)生活水平的不斷提高，人們對高脂肪食物攝入量的增加，導致心血管疾病發(fā)病率極高，已成為世界三大致死疾病之一，因此尋找有效改善AMI 的治療方法具有重要的臨床意義［10］。ATP 作為KATP通道最有效的一種內(nèi)源性阻滯劑［11］，在大多數(shù)情況下，細胞內(nèi)有足夠的ATP 含量，可以與KATP通道上相應的位點結(jié)合，達到飽和，從而關閉KATP通道［12］。在心肌缺血狀態(tài)下，ATP 含量較生理狀態(tài)有所下降，ATP/ADP 比率下降，KATP通道上的ATP 結(jié)合不足，KATP通道活化開放，K+外流增多，心肌細胞復極化或超極化，動作電位時間減少。同時Na+-Ca2+通道受到抑制，細胞Ca2+濃度下降，導致收縮力下降，耗氧量減少，對心肌產(chǎn)生保護［13］。本實驗結(jié)果表明，AMI 模型中，Kir6.1、Kir6.2 的蛋白表達量均有明顯變化，其機制可能與ATP 敏感性鉀離子通道的開放有關。

AMI 的 中 醫(yī) 病 名 為“真 心 痛”［14］，證 屬 痰 瘀 互結(jié)，因脾失健運，胃失和降而痰濁內(nèi)生，從而導致經(jīng)絡淤滯，出現(xiàn)心胸憋悶疼痛等癥狀，其治療原則為祛瘀化痰，疏通胸中閉塞之氣。本實驗選取雙側(cè)內(nèi)關穴、足三里穴、心俞穴作為三個刺激點，與王穎教授自擬的蹊徑通脈湯結(jié)合，針藥并用。蹊徑通脈湯以丹參為君，活血化瘀止痛，可急救于危難發(fā)生之時。王穎教授以水蛭、蜈蚣等“血肉有情之物”為臣，可搜剔疏拔，通達全身。方中配伍麥冬養(yǎng)陰生津潤燥，用以制約蟲類藥物的峻猛及燥烈之性。以川芎、降香為佐，一升一降宣暢氣機，理氣活血止痛。石菖蒲與茯苓可健脾化痰開竅。報道稱，丹參有血管擴張的有效藥理學功效，從而增強血運［15］，四種蟲類藥能使血黏下降，總膽固醇和三酰甘油降至標準范圍［16］，麥冬可增強心肌纖維的收縮度，提高心排血量，減少患者心肌耗氧量［17］，牛膝是公認的神經(jīng)系統(tǒng)保護藥物，有效控制梗死面積，減少細胞凋零，遏抑炎癥反應，改善心肌功能損傷［18］。

《針灸甲乙經(jīng)》有：“心澹澹而善驚恐，心悲，內(nèi)關主之?！敝d。內(nèi)關作為手厥陰心包經(jīng)的絡穴及八脈交會穴，是治療心臟病的首選［19］，與蹊徑通脈湯中的丹參、當歸、降香、川芎功效類似，具有寧心安神，理氣活血止痛之功。心俞穴乃心之背俞穴，是心氣匯聚的地方，可直接通過調(diào)節(jié)患者心功能，養(yǎng)血寧心，配合蟲類藥的使用，既活血補血，又通經(jīng)活絡，通補兼施?！队颀堎x》中記載：“心悸虛煩，刺三里?！保闳镒鳛槲钢潞涎?，有扶正黜邪之效，可調(diào)節(jié)脾胃、活化經(jīng)絡、化痰除痹止痛［20］，有助于全身氣機升降得宜，協(xié)同增強內(nèi)關、心俞穴與湯藥的作用?，F(xiàn)代社會醫(yī)學研究證明，針刺足三里可提高多種胃消化酶的活性，也能增加血量促進血液循環(huán)［21］。杜慧靜等［22］研究發(fā)現(xiàn)，電針內(nèi)關、心俞穴可以調(diào)控心肌組織中細胞因子、生長因子以及炎癥因子的釋放，調(diào)節(jié)組織周圍的微環(huán)境，從而保護缺血梗死區(qū)的心肌組織，改善心功能。三穴共用，活血化瘀，和胃化痰，通絡止痛。

針藥相須，雜合以治，共奏“活血化瘀，化痰通絡”之功。針藥的協(xié)同作用使功能增強，讓心肌梗死的胸悶疼痛癥狀得以緩解。因此，本實驗研究表明，針藥結(jié)合、單純針刺及臨床常規(guī)西藥均可有效改善MI 大鼠狀態(tài)，但以針藥結(jié)合治療的療效最佳，其機制可能是通過降低Kir6.1、Kir6.2 的蛋白表達量，影響ATP 敏感性鉀離子通道的功能來實現(xiàn)的，Kir6.1、Kir6.2 在心臟中有表達，說明對心臟功能可能有著某些影響，但目前對其研究仍較少，其具體機制還有待進一步研究。

作者貢獻度說明：

薦坤：論文主要攥寫人；李蘭石：論文主要修改者；王穎：論文審稿人及課題項目主要負責人，蹊徑通脈湯創(chuàng)作者。