張 超， 喻先偉， 劉文建， 李婉怡， 郭軍康

(陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)

0 引言

鹽堿地是指土壤中含有大量鈉、鉀、鈣、鎂等的硫酸鹽和碳酸鹽成分.在自然環(huán)境或人為因素協(xié)同作用下，該類土壤會(huì)富集大量鹽分[1].我國鹽堿化土壤分布范圍廣，主要分布于干旱、半干旱的東北、西北和華北等地區(qū)，其總面積超過3 000萬hm2[2].

鹽脅迫是影響微藻正常生長發(fā)育的非生物脅迫因子之一[3].目前鹽脅迫對微藻所造成的影響主要表現(xiàn)在滲透壓、光合作用與呼吸作用、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和酶活性四方面.楊蕾等[4]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤溶液中存在大量Na+、K+、Ca2+、Mg2+等離子時(shí)，藍(lán)藻細(xì)胞外會(huì)形成高滲環(huán)境，細(xì)胞失水，影響細(xì)胞與外部環(huán)境正常的水鹽交換；鹽脅迫下，斜生柵藻細(xì)胞PSⅡ活性會(huì)受到抑制，光合色素對光的吸收轉(zhuǎn)化能力下降[5].另外，因胞內(nèi)外水鹽不平衡，有氧呼吸消耗糖類釋放ATP的多個(gè)過程受到干擾；黃開耀等[6]發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫導(dǎo)致株胞魚腥藻細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)皺縮、體積變小，細(xì)胞膜和類囊體緊緊貼合在一起，部分細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損；細(xì)胞結(jié)構(gòu)損壞與失水情況下，萊茵衣藻相關(guān)特定酶合成受到抑制，影響細(xì)胞正常的新陳代謝[7].

研究表明，藻類在鹽脅迫下會(huì)積累活性自由基(ROS)，過量的ROS會(huì)引起細(xì)胞中DNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等分子的損傷[8].耐鹽微藻能抵御鹽脅迫對其生長發(fā)育所帶來的危害，其耐鹽機(jī)理也引起了研究者的興趣.本研究利用在關(guān)中平原某中輕度鹽堿化土地中篩選得到的一株土著微藻，通過分析不同濃度鹽脅迫下微藻的抗氧化體系、脂質(zhì)過氧化、可溶性蛋白、胞外多糖分泌等生理指標(biāo)，試圖解釋其耐鹽機(jī)制，以期為規(guī)?；迷孱惛牧见}堿化土地提供部分理論支持.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 土壤微藻的篩選與鑒定

采集關(guān)中平原某中輕度鹽堿化(34 °49 ′31 ″N，108 °38 ′9 ″E；土壤可溶性鹽含量1.02～3.82 g/kg)土地中長有微藻的表層土(0～1 cm)，將土壤樣品快速封裝于滅菌培養(yǎng)皿，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微藻的篩選.微藻篩選參照蘇杭[9]的方法，略有改進(jìn).具體操作為：將土壤樣品置于滅菌后的250 mL透明錐形瓶中，加入BG-11液體培養(yǎng)基至樣品大部分浸沒而不完全淹沒，然后置于24 ℃、光照強(qiáng)度為8 000 Lux、光/暗比為16/8 h的光照培養(yǎng)箱中富集培養(yǎng).待土壤樣品表面明顯變綠后，挑取少許樣品轉(zhuǎn)移至新的BG-11液體培養(yǎng)基，再次富集培養(yǎng)，之后用平板涂布法將藻液稀釋涂布至固體BG-11培養(yǎng)基上進(jìn)行分離、純化，得到單個(gè)藻細(xì)胞菌落.繼續(xù)用液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，用顯微鏡觀察藻細(xì)胞形態(tài)，直至得到單一純凈的藻體為止.最后將純化后的微藻送樣至北京六合華大基因科技有限公司檢測鑒定.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 NaCl梯度設(shè)置

取對數(shù)生長期的藻液5 mL，離心(5 000 r/min，10 min)收集藻體，使用無菌水重懸在含有不同濃度NaCl(0 g/L(對照)、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L)的100 mL BG-11液體培養(yǎng)基中.連續(xù)光照培養(yǎng)15天，每個(gè)NaCl濃度處理三個(gè)重復(fù)，每隔3天取樣進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的分析測定.每天定時(shí)將BG-11液體培養(yǎng)基搖勻3次.

1.2.2 測定方法

葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和總?cè)~綠素含量采用紫外分光光度法測定[10]，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[11]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法測定[12]，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定[13]，胞外多糖(EPS)含量采用苯酚-硫酸法測定[14].藻細(xì)胞梯度脫水后通過掃描電鏡(SEM)，并結(jié)合光學(xué)顯微鏡對藻細(xì)胞表面形態(tài)進(jìn)行觀察.

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010和SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，Origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖.采用 Duncan′s法進(jìn)行多重比較分析，P<0.05表示不同處理間具有顯著性差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 微藻的鑒定

從鹽堿化表層土壤中初步篩選得到一株微藻，將其命名為GA-2.將測序數(shù)據(jù)利用MAGE-X軟件中的鄰近法neighbor-joining進(jìn)行分析，并基于1 000次重復(fù)的bootstrap analysis可信度分析校正來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖1所示).分離純化后的微藻經(jīng)18S rRNA測序，并與美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫對比，鑒定結(jié)果其為柵藻(Scenedesmussp.).

圖1 GA-2的18S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 鹽脅迫對柵藻葉綠素的影響

光合藻類依靠其類囊體薄膜上的光合色素吸收轉(zhuǎn)化太陽光，合成有機(jī)質(zhì)儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi).葉綠素含量不僅直接關(guān)系著植物光合同化能力，也是衡量植物耐鹽性的重要生理指標(biāo)之一[15].不同濃度鹽脅迫下，柵藻Chla、Chlb和總?cè)~綠素含量變化如圖2(a)、(b)、(c)所示.同一培養(yǎng)時(shí)間下，Chla、Chlb和總?cè)~綠素含量均隨著鹽濃度的升高而逐漸降低，且與對照組相比呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05).同一鹽濃度下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，Chla、Chlb和總?cè)~綠素含量均表現(xiàn)出增加的趨勢.葉綠體是對鹽脅迫最敏感的細(xì)胞器之一，當(dāng)藻細(xì)胞受到鹽脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)積累過量的ROS，其強(qiáng)氧化性會(huì)導(dǎo)致部分葉綠素的分解或合成受阻[16-19].本研究中，長時(shí)間的鹽脅迫對柵藻葉綠素的合成有明顯的抑制作用，且鹽濃度越高，抑制程度越明顯.高鹽濃度下(≥15 g/L)，溶液中形成大量顏色偏黃且肉眼可見的團(tuán)聚體，原因可能是葉綠素的分解造成藻細(xì)胞顏色偏黃，以及由鈉離子形成的高滲環(huán)境造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變(皺縮、膜結(jié)構(gòu)損壞等)而形成團(tuán)聚體.

(a)藻細(xì)胞葉綠素a含量(不同小寫字母表示同一培養(yǎng)時(shí)間下不同鹽濃度處理間差異顯著(P<0.05)，下同)

2.3 鹽脅迫對柵藻抗氧化酶活性與脂質(zhì)過氧化的影響

鹽脅迫刺激下，藻體會(huì)發(fā)生快速ROS猝發(fā)，短期內(nèi)造成ROS積累，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，同時(shí)會(huì)刺激藻體抗氧化酶系統(tǒng)，產(chǎn)生抗氧化酶(SOD、POD、CAT等)來緩解鹽脅迫造成的細(xì)胞損傷[20-23].其作用機(jī)理為，SOD能夠催化植物細(xì)胞內(nèi)的超氧化物發(fā)生歧化反應(yīng)，產(chǎn)生O2和H2O2[24].MDA是最重要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，可以表示藻細(xì)胞膜的受損程度[25,26].研究表明，MDA積累越多，植物組織的保護(hù)能力越弱[27].

如圖3(a)和3(b)所示，同一培養(yǎng)時(shí)間下，柵藻SOD活性和MDA含量與鹽濃度均呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，鹽脅迫越大，SOD活性和MDA含量也越大，說明高鹽脅迫對SOD和MDA的合成有刺激作用.同一鹽濃度下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，SOD活性和MDA含量也均呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，原因可能是鹽脅迫初期，藻細(xì)胞為消除過量的ROS而產(chǎn)生大量的SOD，隨著脅迫時(shí)間的增加，ROS積累量的減少，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化減輕以及對抗氧化酶系統(tǒng)刺激變?nèi)?，?dǎo)致MDA含量和SOD活性降低.整體來看，SOD在第9 d能保持最高活性，而MDA含量在第6 d達(dá)到最大值，之后逐漸降低.

(a)藻細(xì)胞SOD活性

2.4 鹽脅迫對柵藻可溶性蛋白和EPS含量的影響

植物體內(nèi)可溶性蛋白的增加有利于其對水分的固定，達(dá)到調(diào)節(jié)胞內(nèi)外滲透壓，維持細(xì)胞膜完整性的目的[28].當(dāng)藻體處于長期鹽脅迫環(huán)境中時(shí)，細(xì)胞失水，體內(nèi)Na+的過量積累會(huì)導(dǎo)致脂膜蛋白合成受阻，可溶性蛋白減少，對鹽脅迫的調(diào)節(jié)能力減弱[29].如圖4(a)所示，同一培養(yǎng)時(shí)間，高鹽濃度下柵藻可溶性蛋白含量顯著高于低鹽濃度，說明鹽脅迫能刺激柵藻細(xì)胞產(chǎn)生可溶性蛋白，緩解鹽脅迫所帶來的細(xì)胞損傷，這與SOD活性和MDA含量的變化趨勢一致.宮慶友等[30]也發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻Anabaenavariabilis會(huì)合成一種耐鹽蛋白SSP以應(yīng)對鹽脅迫對其的損害.同一鹽濃度下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，在第9 d達(dá)到最大值，其原因可能是柵藻在長期鹽脅迫下，細(xì)胞膜和合成蛋白質(zhì)相關(guān)的細(xì)胞器遭到破壞，可溶性蛋白含量合成減少.王曉慶等[31]在研究鹽藻耐鹽特異性表達(dá)蛋白也發(fā)現(xiàn)長時(shí)間鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致相關(guān)耐鹽蛋白含量下降.

大量研究證明，鹽脅迫下植物細(xì)胞積累的EPS，一方面作為滲透保護(hù)物質(zhì)，構(gòu)成細(xì)胞與外界高滲環(huán)境之間的擴(kuò)散緩沖屏障；另一方面，這類多糖物質(zhì)具有的特定官能團(tuán)，能清除ROS，從而有效緩解鹽脅迫帶來的膜脂過氧化損傷[32,33].如圖4(b)所示，與可溶性蛋白不同，鹽脅迫下柵藻細(xì)胞分泌的EPS含量隨培養(yǎng)時(shí)間持續(xù)增加.在培養(yǎng)前9 d，各鹽脅迫處理下EPS含量均已顯著高于對照，可能是因?yàn)闁旁寮?xì)胞在鹽脅迫下會(huì)分泌大量EPS，調(diào)節(jié)滲透壓和清除部分ROS，保持細(xì)胞膜通透性，減輕細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度.多糖類物質(zhì)和可溶性蛋白、抗氧化酶等協(xié)同組成柵藻細(xì)胞自我防御系統(tǒng)，可緩解柵藻細(xì)胞受鹽脅迫造成的機(jī)能失常.

(a)藻細(xì)胞可溶性蛋白含量

2.5 鹽脅迫下柵藻各生理指標(biāo)間相關(guān)性分析

將培養(yǎng)9 d的柵藻各生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析.如表1所示，總?cè)~綠素與SOD、MDA、可溶性蛋白之間均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，與EPS呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān).SOD、MDA、可溶性蛋白和EPS兩兩之間均呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系.

表1 不同鹽脅迫處理下各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

2.6 不同濃度鹽脅迫對柵藻細(xì)胞形態(tài)的影響

藻體受到一定程度外部脅迫時(shí)，會(huì)出現(xiàn)明顯的物理性損傷.如圖5和6所示，分別利用光學(xué)顯微鏡和SEM觀察鹽脅迫前后柵藻細(xì)胞表面形態(tài)的變化.對照處理下(如圖5(a)和6(a)所示)，柵藻細(xì)胞通常是2、4或8個(gè)相互疊加的形式，在平面上呈現(xiàn)柵欄狀或四角狀排列，細(xì)胞壁光滑，具刺、齒或隆起線.隨著鹽脅迫程度的增加，柵藻細(xì)胞體積變大，細(xì)胞由柵欄狀或四角狀變成圓球狀，細(xì)胞之間不再平行連接，藻體分布更加聚集緊密(如圖5(e)所示)，柵藻細(xì)胞刺、齒或隆起線消失，細(xì)胞表面出現(xiàn)褶皺和破損現(xiàn)象(如圖6(b)所示).

李哲等[34]通過研究黑磷納米片來對斜生柵藻的毒性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在100 mg/L黑磷納米片的脅迫下，斜生柵藻細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞邊緣不再完整、細(xì)胞破裂等.華棟等[35]也觀察到在鹽脅迫下，杯狀葉綠體逐漸離解為多個(gè)相互連結(jié)或分離的部分，葉綠體內(nèi)的類囊體片層系統(tǒng)解體.微藻細(xì)胞破損會(huì)導(dǎo)致其內(nèi)容物流出，使其失去正常的生理代謝功能，可能是柵藻細(xì)胞受到鹽脅迫累積的ROS量過多，超出可清除的閾值，導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞器遭到氧化性破壞.此外，高鹽環(huán)境下，鹽離子在擴(kuò)散作用下會(huì)由胞外濃度高的地方向胞內(nèi)濃度低的地方滲透，相反水分子在滲透作用下會(huì)由胞內(nèi)濃度低的一邊向胞外濃度高的一邊流動(dòng)，導(dǎo)致胞內(nèi)大量水分流出，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，表面正常結(jié)構(gòu)難以維持.

(a)～(e)分別為0 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L和20 g/L NaCl圖5 光學(xué)顯微鏡下柵藻細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)隨鹽脅迫的變化

(a)、(b)分別為0 g/L和20 g/L NaCl圖6 SEM下柵藻細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)隨鹽脅迫的變化

3 結(jié)論

本研究成功地在原生鹽堿地篩選得到一株耐鹽微藻，經(jīng)過分離、純化和分子生物學(xué)鑒定，確定其為柵藻(Scenedesmussp.).

鹽脅迫下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，柵藻葉綠素合成受到抑制，SOD活性、MDA和可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，EPS含量持續(xù)積累.

通過光學(xué)顯微鏡和SEM觀察，高鹽脅迫下柵藻細(xì)胞難以維持正常的表面結(jié)構(gòu)，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的聚集、皺縮、破裂等現(xiàn)象，造成不可逆的細(xì)胞損傷.