楊少君 周乃珍 王曉霞

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是缺血性心血管疾病的潛在病理特征，是目前全球范圍內(nèi)病死率最高的疾病[1]。當(dāng)巨噬細(xì)胞大量吸取來自于人體內(nèi)氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein，oxLDL)時(shí)，會極大地增加巨噬細(xì)胞中的脂滴含量[2]，進(jìn)而發(fā)展成為具有AS特征的巨噬源性泡沫細(xì)胞，最終形成AS[3]。避免AS的發(fā)生，減少泡沫細(xì)胞形成[4]，是目前科學(xué)家們關(guān)注的焦點(diǎn)。大量研究表明，自噬可參與調(diào)節(jié)AS的發(fā)生發(fā)展過程，并且抑制自噬會加速AS的發(fā)展，促進(jìn)自噬則可抑制AS[5]。AMPK/mTOR通路是參與細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)的通路[6]，已有研究證明阿托伐他汀可通過此通路激活細(xì)胞自噬，進(jìn)而延緩AS進(jìn)程[7]。阿昔莫司是一種煙酰類的降脂藥，可參與調(diào)控心血管疾病發(fā)生，有研究發(fā)現(xiàn)，阿昔莫司可明顯降低大鼠高脂飲食造成的血脂升高及頸動(dòng)脈粥樣硬化[8]。本研究通過探究阿昔莫司對oxLDL誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞自噬的影響，并進(jìn)一步探究AMPK/mTOR通路在此過程中的作用，為阿昔莫司治療AS的分子機(jī)制提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人單核細(xì)胞株THP-1購自武漢益普科技生物有限公司(貨號：YCL-0233)；10%胎牛血清購自美國GEMINI(貨號：900-108)；0.25%胰蛋白酶購自美國Hyclone(貨號：SH30042.01B)；RPMI-1640培養(yǎng)基購自北京百奧萊博(貨號：GL0182-LWE)；阿昔莫司購自美國NIFDC(貨號：CP-100750)；氯喹購自美國MP Biomedicals(貨號：0219391910)；佛波醇酯購自中國absin(貨號：abs9107)；oxLDL購自上海經(jīng)科(貨號：JK-002)；油紅O染色試劑盒購自美國Sciencell(貨號：SC-0843)；LC3、P62、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、GAPDH抗體均購自中國Bioss；AMPK抑制劑Compound C購自美國Merck(貨號：171260-1MG)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購自中國萬類生物(貨號：WLA023)；聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)購自美國Millipore(貨號：IPVH00010)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天(貨號：P0018FM)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):在RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中培養(yǎng)人單核細(xì)胞株THP-1，在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)單核細(xì)胞生長面積>80%培養(yǎng)瓶面積后，進(jìn)行1次傳代培養(yǎng)(具體詳細(xì)操作步驟參考購買細(xì)胞時(shí)附帶的細(xì)胞培養(yǎng)操作指南)。

1.2.2 細(xì)胞分組與處理:收集對數(shù)期THP-1細(xì)胞，添加佛波醇酯(100 ng/ml)培養(yǎng)48 h誘導(dǎo)形成巨噬細(xì)胞，將巨噬細(xì)胞分為空白組(不添加oxLDL)、對照組、阿昔莫司組、氯喹組、阿昔莫司+氯喹組、Compound C(AMPK抑制劑)組、阿昔莫司+Compound C組，各組均添加對應(yīng)藥物作用于細(xì)胞0.5 h，隨后再添加oxLDL(50 mg/L)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 油紅O染色檢測細(xì)胞內(nèi)脂滴含量:收集培養(yǎng)后的空白組、對照組細(xì)胞，使用PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定30 min。再次用PBS沖洗3次，油紅O進(jìn)行染色大約30 min，60%異丙醇進(jìn)行沖洗5 s，然后立即使用PBS進(jìn)行漂洗3次，最后使用蘇木素復(fù)染3～5 s，迅速使用流水沖洗，最后在顯微鏡下拍照觀察。

1.2.4 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu):收集培養(yǎng)后的空白組、對照組細(xì)胞，用4%戊二醛固定后用PBS漂洗，然后添加1%餓酸固定，用一定濃度梯度的乙醇丙酮脫水，隨后包埋，切片，最后再將切片用乙酸雙氧鈾及檸檬酸鉛染色，于電子顯微鏡下觀察自噬體結(jié)構(gòu)。

1.2.5 Western Blot檢測細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3、P62及AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR表達(dá):收集培養(yǎng)后的對照組、阿昔莫司組、氯喹組、阿昔莫司+氯喹組、Compound C組、阿昔莫司+Compound C組細(xì)胞，分別加入裂解液充分裂解細(xì)胞，使用蛋白提取試劑盒依次提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測定各組蛋白濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉過程后，依次添加LC3、P62、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、GAPDH抗體(GAPDH作為內(nèi)參)，4℃孵育過夜后，添加二抗，然后使用ECL發(fā)光液顯色，最后采用凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像并分析各目的蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 油紅O染色檢測泡沫細(xì)胞模型構(gòu)建結(jié)果 THP-1細(xì)胞添加佛波酯誘導(dǎo)后又添加oxLDL培養(yǎng)，與空白組比較，對照組細(xì)胞紅色脂滴含量明顯提高(P<0.05)，標(biāo)志著泡沫細(xì)胞模型成功構(gòu)建。見圖1，表1。

表1 細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴含量比較

空白組 對照組

2.2 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu) oxLDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后，透射電子顯微鏡觀測細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)。空白組中并未見到自噬體。與空白組比較，對照組細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量明顯增多(箭頭所示)，發(fā)現(xiàn)添加oxLDL可增加THP-1細(xì)胞自噬。見圖2。

空白組 對照組

2.3 阿昔莫司對oxLDL誘導(dǎo)后細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，阿昔莫司組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平升高(P<0.05)，P62水平降低(P<0.05)，而氯喹組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平降低(P<0.05)，P62水平升高(P<0.05)；與阿昔莫司組比較，阿昔莫司+氯喹組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平降低(P<0.05)，P62水平升高(P<0.05)。見圖3，表2。

表2 4組細(xì)胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62蛋白表達(dá)量比較

圖3 Western Blot檢測細(xì)胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62蛋白水平

2.4 阿昔莫司對oxLDL誘導(dǎo)后細(xì)胞中自噬及AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，阿昔莫司組p-AMPK/AMPK和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平升高(P<0.05)，p-mTOR/mTOR和P62水平降低(P<0.05)；Compound C組p-AMPK/AMPK和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平顯著降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR和P62水平升高(P<0.05)。與阿昔莫司組比較，阿昔莫司+Compound C組p-AMPK/AMPK和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR和P62水平升高(P<0.05)。見圖4，表3。

圖4 Western Blot檢測細(xì)胞中p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62水平

表3 4組細(xì)胞中p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62蛋白表達(dá)量比較

3 討論

AS屬于血管炎癥疾病的一種，嚴(yán)重威脅人類身體健康[9]，其特征主要是血管壁中大量積聚脂質(zhì)、纖維性物質(zhì)以及礦物質(zhì)等物質(zhì)，產(chǎn)生AS損傷有多方面的原因，其中由單核細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)變?yōu)榈木奘稍葱耘菽?xì)胞在此過程中至關(guān)重要[10]。大量的脂質(zhì)沉積引起巨噬細(xì)胞中膽固醇脂含量升高，進(jìn)而形成泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞的形成是AS早期的主要特征之一，參與AS的發(fā)生發(fā)展過程[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道，通過使用誘導(dǎo)成為巨噬細(xì)胞，進(jìn)而添加oxLDL誘導(dǎo)48 h形成泡沫細(xì)胞，通過油紅O染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有大量的紅色脂滴，則成功構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型[2]。本研究結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞內(nèi)有大量的紅色脂滴，且顯著高于空白組，與之前報(bào)道結(jié)果相同，驗(yàn)證了泡沫細(xì)胞模型的成功構(gòu)建。

自噬是機(jī)體內(nèi)一種高度保守的溶酶體降解機(jī)制，在維持細(xì)胞完整性和能量穩(wěn)態(tài)方面起著至關(guān)重要的作用[12]，在生物發(fā)育及衰老過程中均有可能會發(fā)生，是凈化機(jī)體自身的一個(gè)必要循環(huán)機(jī)制[13]。在研究自噬機(jī)制中廣泛使用的分子標(biāo)志蛋白有：LC3，Beclin1，P62(SQSTM1)，Atg32等多個(gè)因子[14]，本研究主要選用LC3和P62蛋白。已有研究證明，LC3在形成自噬體膜過程中具有重要作用，主要表現(xiàn)為LC3Ⅱ和LC3Ⅰ兩種相互轉(zhuǎn)換的形式，檢測LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平可直接反映其自噬水平[15]。P62可以用來作為貨車蛋白，它參與機(jī)體多種信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，且在多種細(xì)胞中均能檢測到其表達(dá)[16]。P62可以直接與LC3泛素化底物直接作用后進(jìn)入到自噬體中，進(jìn)而被其他自噬溶酶體降解，P62蛋白水平在一定意義上可反映出自噬的能力變化[17]。已有研究證實(shí)，阿昔莫司可以有效地改善高脂飲食大鼠所引起的血脂水平提高[8]。且阿昔莫司能夠通過激活LXRα通路，誘導(dǎo)ABCA1表達(dá)，進(jìn)而抑制其形成泡沫細(xì)胞達(dá)到延緩AS發(fā)生發(fā)展的目的[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，阿昔莫司組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)明顯提高，P62表達(dá)顯著降低，而氯喹組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)降低，P62水平升高；與氯喹組比較，阿昔莫司+氯喹組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平升高，P62水平降低。此結(jié)果表明了阿昔莫司可抑制形成泡沫細(xì)胞且可以在一定程度上削弱氯喹對細(xì)胞自噬的抑制作用。

本研究為了更深入的探討阿昔莫司與細(xì)胞自噬的作用機(jī)制，進(jìn)一步探究了AMPK/mTOR通路對此過程的作用。已有多篇研究報(bào)道AMPK/mTOR通路可參與多種疾病過程，也可參與細(xì)胞自噬過程[19]。有研究證明，在培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞中，外源添加槲皮素和AMPK抑制劑Compound C后，可降低p-AMPK蛋白水平，升高p-mTOR蛋白水平，且A549細(xì)胞自噬泡明顯減少，進(jìn)而得出槲皮素可能通過激活A(yù)MPK/mTOR信號通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生自噬過程[20]。本研究證明了阿昔莫司可以激活A(yù)MPK/mTOR通路，可通過此通路在一定程度上增強(qiáng)泡沫細(xì)胞的自噬作用。

綜上所述，阿昔莫司可通過調(diào)控AMPK/mTOR通路促進(jìn)oxLDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞自噬作用。本研究為阿昔莫司在治療AS機(jī)制中提供了新的見解，且對AMPK/mTOR通路研究開辟了新的研究方向。但本研究并未深入探究是否還有其他的通路蛋白參與調(diào)控細(xì)胞自噬，有待后續(xù)更加完善的研究。