皮娜 朱振東 何琴 鐘燕 靳璇 張旋

肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是由各種肺內(nèi)外致病因素所致的慢性、進(jìn)展性、致死性的間質(zhì)性肺疾病，可導(dǎo)致患者肺功能不可逆下降、進(jìn)行性呼吸衰竭，甚至死亡，其治療困難，預(yù)后差，嚴(yán)重危害人類健康[1,2]。因此，肺纖維化也被俗稱為不是癌癥的癌癥。同時(shí)，肺纖維化也是發(fā)生肺癌的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，肺纖維化患者繼發(fā)肺癌的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通人群[3]。因此，對(duì)于肺纖維化患者，如何延緩或逆轉(zhuǎn)肺纖維化進(jìn)程，最大限度地改善肺功能一直是醫(yī)學(xué)界的一個(gè)難題。2014年，美國(guó)FDA同時(shí)批準(zhǔn)了兩個(gè)治療特發(fā)性肺纖維化的新藥：吡非尼酮和尼達(dá)尼布[4]。然而，這兩種新藥長(zhǎng)期服用會(huì)引起一系列不良反應(yīng)如肝功能損害，而且價(jià)格昂貴，普通患者難以承受。因此研發(fā)高效、低毒、經(jīng)濟(jì)的抗肺纖維化新藥十分必要。滇龍膽草(Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.)為龍膽科龍膽屬植物，也被稱為堅(jiān)龍膽、苦膽草、小秦艽，為云南道地中藥材，主產(chǎn)于云南，在四川、貴州、廣西、湖南等地也有分布[5]。滇龍膽草主要以根及根莖入藥，味苦、性寒，歸肝、膽經(jīng)。目前滇龍膽草已被《中國(guó)藥典》收錄，作為傳統(tǒng)中藥材龍膽的重要基源植物。研究表明，從該屬植物中分離出的主要生物活性成分為環(huán)烯醚萜、黃酮類化合物，具有廣泛的藥理活性，此外，源于該植物的天然產(chǎn)物沒(méi)有明顯的動(dòng)物毒性、細(xì)胞毒性和基因毒性[6]。在抗纖維化方面，研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于該植物的苦膽草能改善大鼠肝纖維化程度，對(duì)大鼠肺纖維化也有保護(hù)作用[7,8]，但作用機(jī)制尚不明確。本研究在博萊霉素制備小鼠肺纖維化模型上進(jìn)一步觀察滇龍膽草的抗肺纖維化作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物:SPF級(jí)雄性昆明種小鼠120只，5～7周齡，體重18～22 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滇)2020-0004。

1.1.2 藥物與試劑:滇龍膽草購(gòu)自昆明市螺螄灣中藥材市場(chǎng)，并經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院陸露教授鑒定為滇龍膽，樣本編號(hào)：20200625；吡非尼酮(PFD)，生產(chǎn)批號(hào)：J1001A，購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；注射用鹽酸博萊霉素(BLM)，生產(chǎn)批號(hào)：19012311，購(gòu)自海正輝瑞制藥有限公司；蘇木精-伊紅染色液，生產(chǎn)批號(hào)：190815，購(gòu)自廈門邁威生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)，生產(chǎn)批號(hào)：090119191205，SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒，生產(chǎn)批號(hào)：071820200727，購(gòu)于碧云天；Masson三色染色試劑盒，生產(chǎn)批號(hào)：1911278004，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司；羥脯氨酸試劑盒(堿水解法)，生產(chǎn)批號(hào)：20200722，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，生產(chǎn)批號(hào)：QR3252482-10，購(gòu)自美國(guó)Abcom公司 ；GAPDH Rabit Polyclonal antibody，生產(chǎn)批號(hào)：10494-1-AP，HRP-偶聯(lián)Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，生產(chǎn)批號(hào)：20000243，購(gòu)自美國(guó) Proteintech公司；Bio-rad Clarity Western ECL化學(xué)發(fā)光底物，生產(chǎn)批號(hào)：170-5060，購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司；彩虹180廣譜蛋白Marker(11-180 KDa)，生產(chǎn)批號(hào)：828A021，購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理:小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NS)，模型組(BLM)，吡非尼酮組(PFD)，滇龍膽草低、中、高劑量組(Gen50、Gen100、Gen200)，每組20只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，暴露氣管，正常對(duì)照組一次性氣管內(nèi)滴注無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液，其余各組一次性氣管內(nèi)滴注博萊霉素5 mg/kg，滴注后立即將小鼠直立旋轉(zhuǎn)，使博萊霉素溶液或0.9%氯化鈉溶液均勻分布于肺內(nèi)。從造模當(dāng)天開(kāi)始，滇龍膽草低、中、高劑量組分別灌胃給予50、100、200 mg/kg滇龍膽草0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，每日給藥1次；對(duì)照組和模型組小鼠灌胃給予相應(yīng)體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；吡非尼酮組組灌胃給予50 mg/kg吡非尼酮。在給藥第14天和第28天，分別麻醉處死每組10只小鼠，收集肺組織標(biāo)本，進(jìn)行HE染色、Masson染色、羥脯氨酸(Hyp)檢測(cè)及Western blot檢測(cè)。

1.2.2 小鼠行為學(xué)觀察及體重測(cè)量:觀察小鼠呼吸、活動(dòng)及飲食情況，毛發(fā)顏色變化。在造模給藥第1天稱體重，之后每周稱一次體重，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 肺系數(shù):小鼠麻醉處死后，分離肺組織，稱量肺臟重量。根據(jù)小鼠體重和肺臟重量計(jì)算各組小鼠肺系數(shù)。肺系數(shù)=肺臟重量(mg)/體重(g)×100%。

1.2.4 Hyp含量測(cè)定:取每組小鼠右上肺采用堿水解法操作，根據(jù)試劑盒說(shuō)明將組織放入試管中并加入水解液1 ml，沸水浴水解20 min，加指示劑10 μl，調(diào)整pH值至6.0～6.8，加雙蒸水定容至10 ml并混勻，取3 ml水解液加入活性炭20 mg，3 500 r/min離心10 min，取上清液1 ml按照試劑盒操作加入對(duì)應(yīng)試劑，混勻，水浴離心后取上清于550 nm處做吸光度(A)值檢測(cè)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)肺組織α-SMA蛋白表達(dá):取小鼠肺組織100 mg，剪碎勻漿，加入蛋白裂解液裂解，收集上清液，采用BCA 定量蛋白試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)。取20 μg蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白組分后，轉(zhuǎn)印蛋白于PVDF膜上。α-SMA(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 500)一抗4℃過(guò)夜，TBST漂洗。加入山羊抗兔 IgG-HRP 二抗(1∶5 000)室溫下孵育2 h，TBST漂洗，ECL液顯影。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值之比定量分析蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 病理組織學(xué)觀察:肉眼觀察肺組織大體病理改變，然后取小鼠左肺，用10%中性甲醛固定液固定24 h 后，由低濃度到高濃度酒精梯度分別脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋組織，蠟塊室溫冷卻后以5 μm厚度切片行常規(guī)HE染色和Masson染色，顯微鏡下分別觀察肺組織炎癥程度和膠原纖維沉積情況，參照Szapiel等[9]的方法對(duì)肺泡炎進(jìn)行評(píng)分，參照Fulmer等[10]的方法對(duì)肺間質(zhì)纖維化程度進(jìn)行評(píng)分。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 對(duì)照組小鼠飲食狀況良好、毛發(fā)光澤發(fā)亮、活動(dòng)正常、呼吸平穩(wěn)。模型組小鼠安靜少動(dòng)、精神萎靡、毛發(fā)粗糙無(wú)光澤，其余組與對(duì)照組比較，未見(jiàn)明顯變化。

2.2 體重變化 每天觀察小鼠的生長(zhǎng)情況并每隔一周稱量小鼠體重。由生長(zhǎng)曲線可見(jiàn)，NS組小鼠體重增長(zhǎng)最快而模型組小鼠增長(zhǎng)最慢，其余各組增長(zhǎng)幅度相似。見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠生長(zhǎng)曲線；NS-正常對(duì)照組；BLM-模型組；PFD-吡非尼酮組；Gen50-滇龍膽草低劑量組；Gen100-滇龍膽草中劑量組；Gen200-滇龍膽草高劑量

2.3 肺系數(shù) 肺系數(shù)是表征肺組織水腫程度的重要指標(biāo)，模型組小鼠肺系數(shù)均明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與模型組比較，吡非尼酮組和滇龍膽草各劑量組小鼠肺系數(shù)均有所降低，14 d的吡非尼酮組和滇龍膽草中劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組內(nèi)14 d與28 d比較，14 d各組小鼠肺系數(shù)均高于28 d。見(jiàn)表1。

2.4 肺組織Hyp含量 在14 d時(shí)，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織Hyp含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與模型組比較，滇龍膽草高劑量組小鼠肺組織Hyp含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)；隨著時(shí)間增加，在28 d時(shí)，模型組Hyp含量達(dá)到峰值，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織Hyp含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)，各藥物組與模型組比較，Hyp含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)果表明，滇龍膽草可顯著降低肺纖維化小鼠肺組織中Hyp含量。見(jiàn)表1。

表1 肺系數(shù)和肺組織Hyp含量統(tǒng)計(jì)表

2.5 Western blot檢測(cè)肺組織α-SMA蛋白含量 與正常對(duì)照組比較，模型組α-SMA蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，滇龍膽草除28 d低劑量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各劑量組均能顯著降低肺組織中α-SMA的相對(duì)表達(dá)量(P<0.01)，療效與吡非尼酮組相當(dāng)。見(jiàn)圖2，表2。

圖2 肺組織α-SMA蛋白表達(dá)(n=10)

表2 肺組織α-SMA蛋白表達(dá)

2.6 肺組織病理學(xué)變化 正常對(duì)照組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)較完整、清晰，未見(jiàn)肺泡壁增厚肺泡間有少量膠原，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，部分肺泡塌陷融合，肺泡間隔破壞，肺泡壁明顯增厚，其間可見(jiàn)纖維組織成條索樣、斑片狀分布及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)在肺間質(zhì)及支氣管周圍可見(jiàn)大量纖維組織增生和膠原沉積。肺泡炎和組織纖維化評(píng)分結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組肺泡炎及間質(zhì)纖維化評(píng)分明顯增加；與模型組比較，滇龍膽草中、高劑量組和吡非尼酮組肺泡炎評(píng)分明顯降低，滇龍膽草低、中、高劑量組和吡非尼酮組間質(zhì)纖維化評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3、4，表3。

表3 肺組織病理形態(tài)學(xué)評(píng)分 n=10,分,

圖3 病理學(xué)形態(tài)(HE染色×200)

3 討論

肺纖維化的病理改變以普遍間質(zhì)性肺炎、廣泛肺內(nèi)纖維化和瘢痕化、肺內(nèi)成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞異常增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)聚集于肺泡細(xì)胞周圍并伴炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞，正常肺泡組織被損壞后異常修復(fù)導(dǎo)致肺內(nèi)疤痕形成[11]。持續(xù)的炎性損傷、異常的肺泡上皮修復(fù)、成纖維細(xì)胞的活化和分化是肺纖維化形成的重要病理過(guò)程。

圖4 病理學(xué)形態(tài)(Masson染色×200)

博萊霉素是一種用于治療腫瘤的抗生素，廣泛用于治療某些類型的惡性腫瘤，包括睪丸癌、霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤，肺纖維化是其常見(jiàn)不良反應(yīng)[12]。氣管內(nèi)滴注博萊霉素是一種常用的制備肺纖維化動(dòng)物模型的經(jīng)典方法。本研究在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型上評(píng)價(jià)了不同劑量滇龍膽草對(duì)肺纖維化形成的干預(yù)作用。病理組織學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，滇龍膽草能夠明顯減輕肺纖維化早期肺部炎性反應(yīng)和后期肺內(nèi)膠原纖維沉積，能夠干預(yù)肺纖維化的形成。

肺系數(shù)是表征肺組織水腫程度和炎癥損傷的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組氣管滴注博來(lái)霉素14 d肺系數(shù)明顯高于28 d，表明肺纖維化早期主要以炎性反應(yīng)為主，與模型組比較，不同劑量的滇龍膽草能夠降低小鼠肺系數(shù)。羥脯氨酸是膠原纖維的重要組成部分，其含量可以反映膠原纖維的含量，常作為纖維化標(biāo)記物用于表征纖維化組織中膠原蛋白沉積的程度[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，氣管滴注博萊霉素28 d時(shí)模型組小鼠肺組織羥脯氨酸達(dá)到峰值，不同劑量的滇龍膽草均能明顯降低肺纖維化小鼠肺組織的羥脯氨酸含量，表明滇龍膽草能夠抑制肺纖維化小鼠肺組織膠原纖維沉積。

活化的肌成纖維細(xì)胞是纖維化中最主要的效應(yīng)細(xì)胞，是產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，引起膠原纖維沉積的主要細(xì)胞，可特異性表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)。肺纖維化時(shí)，肺內(nèi)肌成纖維細(xì)胞主要來(lái)源與成纖維細(xì)胞的增殖分化、肺上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及循環(huán)纖維細(xì)胞遷移[14,15]。α-SMA異常高表達(dá)是成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志，也是肌成纖維細(xì)胞具有收縮和遷徙能力的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組在氣管滴注博萊霉素14 d和28 d時(shí)，小鼠肺組織α-SMA表達(dá)水平均明顯高于正常對(duì)照組，表明肺纖維化時(shí)肺組織α-SMA表達(dá)明顯上調(diào)，這與文獻(xiàn)報(bào)道[16]一致。不同劑量滇龍膽草和吡非尼酮均可以明顯下調(diào)肺纖維化小鼠肺組織α-SMA的表達(dá)。結(jié)果表明，滇龍膽草可能抑制了肺內(nèi)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化。

綜上所述，滇龍膽草具有抗肺纖維化作用，能夠抑制肺纖維化形成早期肺部炎癥和后期膠原纖維沉積，其抗肺纖維化作用與下調(diào)α-SMA表達(dá)，抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化有關(guān)。本研究可為滇龍膽草防治肺纖維化提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為肺纖維化的治療提供新的治療策略。