劉園園 張培培 陳忠美

缺血性中風發(fā)生時，部分腦部供血減少，導致葡萄糖和氧氣供應不足，最終導致腦損傷。重組組織型纖溶酶原激活劑是目前惟一確立的腦卒中治療藥物，但由于時間窗限制具有較大的局限性[1]。腦損傷相關神經(jīng)功能障礙影響患者的語言、認知和運動功能，嚴重降低患者生活質量。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類通過特殊的選擇性切割機制產(chǎn)生的非編碼RNA。circRNA可與特定的微小RNA(miRNA)結合，阻止miRNA翻譯，并影響細胞增殖、凋亡、自噬等生物學過程，進而在心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥的病理過程中發(fā)揮作用[2-4]。研究報道急性心肌梗死大鼠心肌組織和缺氧復氧誘導的心肌細胞中circRNA SAMD4A(circSAMD4A)抑制水平上調，circSAMD4A低表達可降低缺氧復氧誘導的心肌細胞凋亡和炎性反應[5]。靶基因數(shù)據(jù)庫預測到miR-410-3p是circSAMD4A的潛在靶點。研究發(fā)現(xiàn)，糖氧剝奪的原發(fā)皮層神經(jīng)元中miR-410-3p水平顯著下調，過表達miR-410-3p可增強神經(jīng)元存活，抑制神經(jīng)元凋亡，增加軸突長度，并顯著恢復缺氧缺血性腦損傷大鼠的運動和認知功能[6]。本研究利用PC-12細胞建立體外缺氧缺糖細胞損傷模型模擬缺血性腦損傷過程[7]，研究circSAMD4A靶向miR-410-3p對缺氧缺糖神經(jīng)細胞凋亡和氧化應激的影響，旨在為缺血性腦損傷治療開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大鼠PC12細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；EBSS無糖培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；circSAMD4A的小干擾RNA(si-circSAMD4A)、miR-410-3p模擬物(mimics)、miR-410-3p抑制物(anti-miR-410-3p)以及各自陰性對照(si-NC、miR-NC、anti-miR-NC)、熒光素酶報告質粒購自上海生工生物工程公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購自北京Takara生物公司；SYBR green master mix試劑盒購自南京諾唯贊生物科技公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒購自武漢金開瑞生物公司；兔源Cleaved-caspase3抗體、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自美國CST公司；TRIzol試劑、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒以及丙二醛(MDA)檢測試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液購自北京索萊寶生物公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于北京全式金生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、模型構建和實驗分組:PC12細胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁達到80%時進行傳代培養(yǎng)。將對數(shù)期PC12細胞接種到6孔板，每孔2×105個細胞，當細胞貼壁40%時Lipofectamine 2000分別轉染si-NC、si-circSAMD4A、miR-NC、miR-410-3p mimics、si-circSAMD4A+anti-miR-410-3p至PC12細胞，收集轉染48 h的PC12細胞進行后續(xù)實驗。參照文獻[7]方法構建缺氧缺糖模型，即將PC12細胞接種培養(yǎng)板，HANKs液去除懸浮細胞，用EBSS無糖培養(yǎng)基替代DMEM培養(yǎng)基，放入含5% CO2與95% N2的密閉小室中缺糖缺氧損傷4 h，然后取出培養(yǎng)板置于常規(guī)培養(yǎng)箱中復氧繼續(xù)培養(yǎng)2 h，記為模型(Model)組。用普通高糖DMEM培養(yǎng)基于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)PC12細胞記為對照(Con)組。轉染si-NC、轉染si-circSAMD4A、轉染miR-NC、轉染miR-410-3p mimics、轉染si-circSAMD4A+anti-miR-410-3p的PC12細胞進行缺糖缺氧損傷4 h，再復氧繼續(xù)培養(yǎng)2 h，分別記為Model+si-NC組、Model+si-circSAMD4A組、Model+miR-NC組、Model+miR-410-3p組、Model+si-circSAMD4A+anti-miR-410-3p組。

1.2.2 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測circSAMD4A、miR-410-3p表達:用TRIzol試劑從各組PC12細胞中提取總RNA，然后利用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成互補DNA。利用SYBR green master mix試劑盒進行RT-qPCR檢測circSAMD4A、miR-410-3p表達水平。實驗所用引物序列(5’-3’)：circSAMD4A上游ACTGGCAGGACAAAAGCATG，下游CAGGATTTTGGGCAGCAGTT；GAPDH上游CAGGAGGCATTGCTGATGAT，下游GAAGGCTGGGGCTCATTT；miR-410-3p上游AAUAUAACACAGAUGG，下游CCTGGCAGTGATGTTGCGGTCTGCCAGGACAGG；U6上游TGGAGCTGCAGAGGATGATT5，下游CAGGGCCTTGAGCACCAGTT。采用2-ΔΔCt法分析circSAMD4A、miR-410-3p的相對水平。circSAMD4A水平檢測以GAPDH為內參，miR-410-3p水平檢測以U6為內參。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力:每組取5×103個PC12細胞接種6孔板，用20 μl的MTT工作液孵育細胞4 h，向各孔內加入二甲基亞砜150 μl。低速搖床震蕩10 min，當藍紫色甲贊結晶溶解后。使用酶標儀檢測各組PC12細胞在490 nm處光密度(OD)值。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率:收集各組PC12細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌2次，然后重懸于1×結合緩沖液中，調整細胞中濃度為1×10個/ml。按照Annexin V-FITC/PI雙染法凋亡檢測試劑盒說明書，將5 μl的Annexin V-FITC、5 μl的PI依次加到100 μl細胞懸液中，避光孵育20 min。補加400 μl的1×結合緩沖液混勻，流式細胞術檢測各組PC12細胞凋亡率。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測Cleaved-caspase3蛋白表達:BCA試劑盒檢測RIPA裂解法提取的各組PC12細胞總蛋白濃度。將適量蛋白樣品與上樣緩沖液等體積混勻，100℃水浴鍋孵育3～5使蛋白變性。30 μg蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(電壓100 V，時間90 min)分離，經(jīng)濕法轉膜儀(20 mA，過夜)轉移蛋白至PVDF膜。膜阻斷后，將膜上的蛋白與1∶1 000的Cleaved-caspase3抗體、GAPDH抗體在4 ℃孵育過夜。第2天與二抗室溫孵育2 h。化學發(fā)光試劑盒進行顯色反應，以Image J軟件測得的Cleaved-caspase3和GAPDH條帶灰度值比值表示目的蛋白水平。

1.2.6 試劑盒檢測SOD和CAT活性、MDA含量以及LDH釋放量:收集各組PC12細胞，離心后取上清置于新的離心管內，LDH活性檢測試劑盒分析上清中LDH水平以表示LDH釋放量。向細胞沉淀中加入提取液，200 W超聲(超聲3 s，間隔10 s，重復 30 次)于冰上破碎細胞，8 000 g 4℃離心10 min，取上清置于冰上。SOD、CAT活性檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒分析細胞內SOD和CAT活性以及MDA含量。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗:根據(jù)starbase數(shù)據(jù)庫預測的circSAMD4A和miR-410-3p的結合位點，將包含miR-410-3p結合位點的circSAMD4A野生(wt)序列以及不含結合位點的circSAMD4A突變(mut)序列分別克隆到pmirGLO基本載體，構建wt-circSAMD4A、mut-circSAMD4A熒光素酶報告質粒。將miR-410-3p mimics、miR-NC分別與wt-circSAMD4A或mut-circSAMD4A共轉染PC12細胞中，收集轉染48 h細胞，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組PC12細胞的相對熒光素酶活性。

2 結果

2.1 干擾circSAMD4A對缺糖缺氧處理的PC12凋亡的影響 與Con組比較，Model組PC12細胞活力、miR-410-3p表達水平顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達水平、circSAMD4A表達水平顯著升高(P<0.05)；與Model組、Model+si-NC組比較，Model+si-circSAMD4A組PC12細胞活力、miR-410-3p表達水平顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達水平、circSAMD4A表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

蛋白質印跡法檢測Cleaved-caspase3蛋白表達

表1 干擾circSAMD4A抑制缺糖缺氧誘導的PC12凋亡

2.2 干擾circSAMD4A對缺糖缺氧處理的PC12氧化應激的影響 與Con組比較，Model組PC12細胞中SOD和CAT活性顯著降低(P<0.05)，MDA水平、LDH釋放量顯著增加(P<0.05)；與Model組、Model+si-NC組比較，Model+si-circSAMD4A組PC12細胞中SOD和CAT活性顯著升高(P<0.05)，MDA水平、LDH釋放量顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 干擾circSAMD4A減輕缺糖缺氧誘導的PC12氧化應激

2.3 circSAMD4A靶向miR-410-3p starbase數(shù)據(jù)庫預測到circSAMD4A序列中含有miR-410-3p的結合位點。同與wt-circSAMD4A共轉染，與轉染miR-NC比較，轉染miR-410-3p mimics后PC12細胞對的相對熒光素活性顯著降低(P<0.05)；同與mut-circSAMD4A共轉染，轉染miR-410-3p mimics后PC12細胞相對熒光素活性與轉染miR-NC比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2，表3。

圖2 circSAMD4A和miR-410-3p互補序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.4 抑制miR-410-3p逆轉干擾circSAMD4A對缺糖缺氧處理的PC12凋亡、氧化應激的影響 與Model+si-circSAMD4A組比較，Model+si-circSAMD4A+anti-miR-410-3p組PC12細胞活力、miR-410-3p表達水平以及SOD、CAT活性顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達水平、MDA水平、LDH釋放量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4，圖3。

表4 抑制miR-410-3p可逆轉干擾circSAMD4A對缺糖缺氧誘導的PC12凋亡和氧化應激的抑制作用

流式細胞術檢測細胞凋亡 蛋白質印跡法檢測Cleaved-caspase3蛋白表達

2.5 miR-410-3p對缺糖缺氧處理的PC12凋亡氧化應激的影響 與Model組、Model+miR-NC組比較，Model+miR-410-3p組PC12細胞活力、miR-410-3p表達水平以及SOD、CAT活性顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達水平、MDA水平、LDH釋放量顯著降低(P<0.05)。見圖4，表5。

表5 miR-410-3p抑制缺糖缺氧誘導的PC12凋亡和氧化應激

流式細胞術檢測細胞凋亡 蛋白質印跡法檢測Cleaved-caspase3蛋白表達

3 討論

腦組織circRNA含量豐富，這些circRNA不僅與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化和生物學功能有關，在腦損傷后神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙和病理中發(fā)揮重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)circRNA 絲氨酸/蘇氨酸蛋白擾動樣激酶1(circTLK1)在缺血性腦卒中動物模型和患者的腦組織和血漿中水平升高，敲減circTLK1可顯著減少梗死體積，減輕神經(jīng)元損傷，改善隨后的長期神經(jīng)功能缺損[9]。circRNA HECTD1(circHECTD1)通過調節(jié)星形膠質細胞激活加重缺血損傷[10]。此外，circRNA DLGAP4(circDLGAP4)通過靶向miR-143調節(jié)與血腦屏障完整性相關的內皮-間充質轉化，改善缺血性卒中預后[3]。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧缺糖誘導的PC12細胞中circSAMD4A水平增加，提示circSAMD4A表達改變可能與缺血性腦損傷相關。功能喪失實驗顯示，轉染si-circSAMD4A干擾circSAMD4A表達顯著減輕缺氧缺糖誘導的細胞凋亡，增加細胞活力。干擾circSAMD4A表達后Cleaved-caspase3表達下調，證實其可逆轉細胞凋亡。多項研究表明，circSAMD4A在骨肉瘤中參與調節(jié)細胞增殖、細胞周期和凋亡[11,12]。氧化應激在缺氧缺糖誘導的細胞凋亡中起著重要作用[13]。本研究顯示，缺氧缺糖誘導細胞損傷標志物LDH釋放，增加脂質過氧化終產(chǎn)物MDA水平，降低抗氧化酶SOD和CAT活性，而干擾circSAMD4A表達顯著逆轉了缺氧缺糖誘導的上述改變。因此，干擾circSAMD4A表達通過抑制氧化應激和凋亡在缺氧缺糖誘導的細胞損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

circRNA可作為miRNA海綿，通過競爭性結合miRNA間接調控miRNA靶基因的表達，參與缺血性腦損傷過程，例如circHECTD1能夠負向調控miR-133b表達加劇大腦中動脈閉塞小鼠模型的腦梗死面積和神經(jīng)元凋亡[14]。本研究證實miR-410-3p受circSAMD4A調控，是circSAMD4A的直接靶標。據(jù)報道，miR-410-3p在七氟醚麻醉誘導的大鼠和細胞中下調，并在七氟醚麻醉誘導的海馬神經(jīng)元凋亡和炎癥中發(fā)揮抑制作用[15]。肝刺激因子通過上調miR-410-3p等幾種miRNA表達，抑制周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)水平，抑制肝細胞凋亡，進而減輕肝臟缺血再灌注損傷[16]。本研究表明，缺氧缺糖誘導的PC12細胞中miR-410-3p水平降低，過表達miR-410-3p可提高SOD和CAT活性，降低MDA水平，抑制LDH釋放，改善缺氧缺糖誘導的凋亡和氧化應激損傷。由于干擾circSAMD4A表達可增加缺氧缺糖PC12細胞中miR-410-3p水平，且過表達miR-410-3p和干擾circSAMD4A的神經(jīng)保護作用類似，表明可能存在circSAMD4A/miR-410-3p調控途徑。進一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-410-3p表達可減弱干擾circSAMD4A對缺氧缺糖誘導的PC12細胞損傷的保護作用，這表明circSAMD4A靶向負調控miR-410-3p表達參與調控缺氧缺糖誘導的神經(jīng)細胞損傷。

綜上所述，本研究首次證實干擾circSAMD4A通過靶向miR-410-3p可減輕缺糖缺氧誘導的神經(jīng)細胞損傷，具有神經(jīng)保護作用。靶向抑制circSAMD4A/miR-410-3p途徑可能是預防或治療缺血性腦損傷的有效途徑。