趙倩文，唐鋮鋮，雷靜靜，張欣然，李豆豆，曾文先，路宏朝

陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，具有較高的侵襲性和轉移性，嚴重威脅患者生命和健康。其中非小細胞型肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌總數(shù)的80%，包括腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌等亞型［1］。研究發(fā)現(xiàn)，不同亞型的患者肺癌組織的基因表達差異較大，顯著影響化學治療藥物的敏感性，提示了NSCLC 機制的多樣性和復雜性［2］。因此，深入研究NSCLC 的分子機制對于改善其診斷及治療至關重要。

人成纖維細胞生長因子13（fibroblast growth factor 13，F(xiàn)GF13）是FGF 亞家族中的新成員，編碼的蛋白質由216 個氨基酸組成，相對分子質量為22000。由于其N-末端不具有自身的信號分泌序列，因此不能分泌至細胞外，僅作為胞內(nèi)蛋白發(fā)揮作用［3］?，F(xiàn)已證明，F(xiàn)GF13 可作為一種微管穩(wěn)定蛋白參與調控神經(jīng)元的極化和遷移［4］，也能夠維持正常心肌傳導功能，并改善血管韌性［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF13 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要調節(jié)作用。其在人類膠質瘤細胞、膠質瘤干細胞、膠質瘤組織［7］和前列腺癌組織中表達水平均異常升高，且與前列腺癌術后患者復發(fā)風險顯著相關［8］。BUBLIK 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF131a 屬于核仁蛋白，可抑制核糖體RNA 轉錄并減弱蛋白質合成，有利于維持肺癌細胞穩(wěn)態(tài)。p53 是一種十分重要的腫瘤抑制因子，在許多類型的腫瘤細胞中均有突變［10］。作為一種轉錄因子，在DNA 發(fā)生損傷時，野生型p53 通過激活或抑制特異基因的轉錄，起到阻斷細胞周期和誘導細胞凋亡的作用。但也有研究報道，p53 通過介導細胞鐵死亡［11-13］、核糖體和核仁應激途徑發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用［14］。然而，在NSCLC 發(fā)生發(fā)展過程中，p53 是否會通過FGF13 途徑抑制細胞增殖仍較少報道。本實驗以NSCLC A549 細胞系為研究對象，探討p53 與FGF13 間的調控關系，以及對A549 細胞增殖的影響和潛在的作用機制，為NSCLC 的治療尋找有效診斷靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、質粒及序列 人正常肺上皮細胞（BEAS-2B）和NSCLC 細胞系（A549）購自賽百慷（上海）公司；靶向FGF13 的siRNA 序列（si-FGF13）：5′-GCCUCAGCUUAAGGGUAUATT-3′，靶向p53 的siRNA 序列（si-p53）：5′-GCUGUGGGUUGAUUCCACATT-3′，對照序列siRNA-NC（si-NC）：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，均由北京奧科鼎盛生物有限公司合成并提供；超表達FGF13 的質粒（pcDNA3.1-FGF13）為陜西理工大學分子遺傳學實驗室前期保存。

1.2 主要試劑及儀器 高糖DMEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基、Opti-MEM 和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Corning 公司；青霉素、鏈霉素、0.25%胰酶、Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen公司；RIPA 裂解液和Trizol 購自上海碧云天生物技術有限公司；CCK-8 試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；反轉錄試劑盒、ECL 曝光液和SYBR Premix E × TaqTMⅡ購自日本TaKaRa 公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG 購自北京康為世紀生物技術有限公司；β-actin、CyclinE、p21Waf1／Cip1、p53 單克隆抗體購自美國CST 公司；FGF13 單克隆抗體購自英國Abcam 公司；Infinite200pro 酶標儀購自瑞士Tecan公司；FACSVerse 流式細胞儀購自美國BD 公司。

1.3 細胞培養(yǎng) 將液氮中保存的BEAS-2B 和A549細胞于37 ℃溫水中快速溶解，2000 × g 離心5 min，棄上清，分別用1 mL 含10% FBS 的DMEM 和1 mL含10% FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基重懸后，轉移至培養(yǎng)皿中，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.4 細胞轉染 用4 組100 μL 的opti-MEM 分別稀釋si-NC、si-FGF13、si-p53 以及同時干擾FGF13 和p53 的siRNA 混合物，混勻，再用4 組100 μL 的opti-MEM 各稀釋2 μL 的Lipofectamine 2000，混勻，室溫作用5 min；將4 組的2 種溶液分別混合，室溫作用20 min，形成DNA-Lipofectamine 復合物；將200 μL復合物加至細胞培養(yǎng)板中，混勻，37 ℃培養(yǎng)12 h；更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；收樣檢測。pcDNA3.1-FGF13 質粒的轉染步驟同上。

1.5 各基因mRNA 轉錄水平的檢測 采用qPCR 法。利用Trizol 法提取細胞總RNA，測定RNA 濃度，反轉錄為cDNA，以其為模板進行PCR 擴增。引物序列見表1，引物由北京奧科鼎盛生物有限公司合成。20 μL 反應體系：SYBR Premix E × TaqTMⅡ（2 ×）10 μL，上下游引物各1.6 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 4.8 μL。兩步法PCR 反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環(huán)。每個基因重復檢測3 次，采用2-ΔΔCT法分析。

表1 qPCR 擴增引物序列Tab.1 Primer sequences for qPCR

1.6 各蛋白表達水平的檢測 采用Western blot 法。用RIPA 裂解液裂解細胞提取蛋白，經(jīng)12% SDSPAGE 分離后，轉至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶4 ℃封閉2 h；加入一抗（FGF13、P53、CyclinE 均1 ∶1000稀釋，β-actin 1 ∶2000 稀釋），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1 ∶2000 稀釋），25 ℃孵育1 h；TBST 洗滌3 次，ECL 試劑盒顯影，以β-actin 作為內(nèi)參，使用Quantity one 軟件進行灰度分析定量。

1.7 p53 和FGF13 基因沉默對A549 細胞增殖的影響采用CCK8 法。將轉染siRNA（si-FGF13 和si-p53）的A549 細胞作為干擾組，設轉染si-NC 的細胞對照組（NC 組）。分別接種96 孔板，3 × 103個細胞／ 孔，每組設5 個復孔，同時設調零孔（僅加培養(yǎng)液），分別培養(yǎng)24、48 和72 h 后，檢測細胞增殖能力。檢測前換液，加入新鮮培養(yǎng)基和CCK8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，用Infinite200pro 酶標儀檢測450 nm 波長處各孔吸光度值。以各孔吸光度值為縱坐標，時間為橫坐標，繪制細胞增殖曲線。試驗重復3 次。

1.8 FGF13 對A549 細胞周期影響的檢測 采用流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）。取對數(shù)生長期的各組細胞，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h；用0.25%胰蛋白酶消化后，分別加至PE 管中，2000 × g 離心；收集各組細胞，加入預冷的70%乙醇，4 ℃固定過夜；PI 染色30 min；上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.9 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)± 標準差表示，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗，用Origin 2017 進行繪圖，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種細胞中p53 基因mRNA 及蛋白表達水平qPCR 檢測結果顯示，A549 細胞中內(nèi)源性p53 基因mRNA 轉錄水平為BEAS-2B 細胞的6 倍以上（t =2.156，P < 0.01）；Western blot 分析顯示，A549 細胞中p53 蛋白的表達水平也高于BEAS-2B 細胞，與qPCR 結果相似，見圖1。

圖1 兩種細胞中p53 蛋白表達水平的Western blot 分析Fig.1 Determination of expression levels of p53 protein in two kinds of cells by Western blot

2.2 干擾p53 基因對A549 細胞增殖的影響 CCK8法檢測結果顯示，與NC 組相比，si-p53 干擾組活細胞數(shù)量明顯增多，尤其是培養(yǎng)72 h 后，細胞的促增殖能力更加明顯（t = 1.899，P < 0.01），見圖2。qPCR檢測結果顯示，與NC 組相比，p53 基因干擾后，細胞周期抑制因子p21 的表達水平也降低80%（t =1.830，P < 0.01），表明細胞增殖進程加快。以上結果提示，干擾p53 基因能促進A549 細胞增殖。

圖2 干擾p53 基因表達對A549 細胞增殖的影響Fig.2 Effect of interfering with p53 gene expression on proliferation of A549 cells

2.3 干擾p53 基因對FGF13 mRNA 轉錄及蛋白表達水平的影響 A549 細胞中干擾p53 基因表達后，qPCR 檢測結果顯示，與NC 組相比FGF13 基因mRNA轉錄水平上調約8 倍（t = 3.256，P < 0.01）；為明確FGF13 在A549 細胞中的功能，首先檢測FGF13 基因的內(nèi)源性表達水平，結果顯示，A549 細胞中FGF13基因mRNA 轉錄水平顯著高于BEAS-2B 細胞，達120 倍（t = 3.597，P < 0.001）。Western blot 分析顯示，F(xiàn)GF13 蛋白在A549 細胞中呈高水平表達，與BEAS-2B 細胞相比差異有統(tǒng)計學意義（t = 2.965，P < 0.01），見圖3。圖4 和圖5。推測在A549 細胞中p53 抑制FGF13基因的表達。

圖3 兩種細胞中FGF13 表達水平的Western blot 分析Fig.3 Determination of FGF13 expression level in two kinds of cells by Western blot

圖4 A549 細胞中FGF13 和p53 蛋白表達水平的Western blot 分析Fig.4 Determination of expression levels of FGF13 and p53 proteins in A549 cells by Western blot

圖5 A549 細胞中FGF13 和p53 蛋白的表達水平Fig.5 Expression levels of FGF13 and p53 proteins in A549 cells

2.4 FGF13 對調控G1／S 期轉變的p21 蛋白表達的影響 CCK8 檢測結果顯示，與NC 組相比，si-FGF13干擾組在72 h 時，細胞活力顯著降低（t = 1.829，P < 0.01），見圖6。表明干擾FGF13 基因抑制A549細胞增殖的速度。

圖6 CCK8 法檢測FGF3 基因干擾后A549 細胞的活力Fig.6 Determination of A549 cell viability after FGF13 gene interference by CCK8 method

進一步在A549 細胞中轉染FGF13 基因的特異性siRNA 干擾序列后，與NC 組比較，F(xiàn)GF13 蛋白表達水平降低50%（t = 1.827，P < 0.01）；轉染p53基因的特異性siRNA 干擾序列后，p53 基因的干擾效率達到70%（t = 2.306，P < 0.01），F(xiàn)GF13 蛋白的表達水平升高約2 倍（t = 2.376，P < 0.01）。見流式細胞術檢測結果顯示，當FGF13 蛋白表達降低后，G1 期細胞數(shù)量明顯升高14%，而S 期細胞數(shù)量降低10%，見圖7 和圖8。表明干擾FGF13 的表達導致A549 細胞周期中G1／S 期的轉換減慢，從而使細胞增殖速度減慢。

圖7 細胞周期進程的流式細胞圖Fig.7 Flow cytometry of cell cycle

圖8 各時期細胞的量化分析Fig.8 Quantitative analysis of cells in various phases

G1／S 期轉換主要受CDK2-CyclinE、p21 和p27等細胞周期相關因子的調控。因此，在干擾FGF13表達后，采用qPCR 法檢測CDK2、p21 和p27 基因mRNA 轉錄水平，結果顯示，F(xiàn)GF13 表達降低后，p21基因mRNA 轉錄水平顯著升高（t=3.514，P<0.01），CDK2 基因mRNA 轉錄水平顯著降低（t = 2.292，P <0.05），而p27 基因mRNA 轉錄水平有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（t = 1.932，P ＞0.05），見圖9。進一步通過Western blot 分析細胞周期蛋白CyclinE表達量，結果顯示，CyclinE 蛋白表達水平明顯降低，見圖10。表明干擾FGF13 基因可促進p21 表達，抑制CyclinE 表達，從而誘導細胞周期中G1／S 期的阻滯。

圖9 A549 細胞中干擾FGF13 表達對p21、p27 和CDK2基因mRNA 轉錄水平的影響Fig.9 Effect of interfering FGF13 expression in A549 cells on transcription levels of p21，p27 and CDK2 mRNAs

圖10 A549 細胞中干擾FGF13 表達對CyclinE 蛋白表達水平影響的Western blot 分析Fig.10 Western blotting of effect of interfering FGF13 expression in A549 cells on expression level of CyclinE protein

當A549 細胞中超表達FGF13 后，與NC 組相比，超表達組中CDK2 基因mRNA 轉錄水平顯著升高，p21 基因mRNA 轉錄水平顯著降低（t = 1.945，P <0.01），而p27 基因mRNA 轉錄水平無明顯變化（t =3.952，P ＞0.05），見圖11；Western blot 分析表明，F(xiàn)GF13 蛋白表達升高后，CyclinE 蛋白表達水平也上調3 倍（t = 3.154，P < 0.01），見圖12。以上結果證明，F(xiàn)GF13 是通過抑制p21 的表達促進CyclinE 的表達，有利于細胞周期中G1 期向S 期的轉變，從而促進A549 細胞增殖速度加快。

圖11 A549 細胞中超表達FGF13 對p21、p27 和CDK2基因mRNA 轉錄水平的影響Fig.11 Effect of overexpression of FGF13 in A549 cells on transcription levels of p21，p27 and CDK2 mRNAs

圖12 A549 細胞中超表達FGF13 對CyclinE 蛋白表達水平影響的Western blot 檢測Fig.12 Western blotting of effect of FGF13 overexpression in A549 cells on expression level of CyclinE protein

2.5 p53 對調控細胞增殖的FGF13 蛋白表達的影響分別單獨干擾FGF13 和p53 或聯(lián)合干擾處理A549細胞72 h 后，Western blot 分析結果顯示，與NC 組相比，F(xiàn)GF13 干擾后p53 蛋白表達無明顯變化，而p53單獨干擾及FGF13 與p53 聯(lián)合干擾后，p53 蛋白表達分別下降76.4%和74.8%（t 分別為1.589 和1.406，P 均< 0.01），與2.3 項干擾效率結果相似。另一方面，與NC 組相比，F(xiàn)GF13 干擾后CyclinE 蛋白的表達降低約70%（t = 2.121，P < 0.01），p53 干擾后CyclinE 蛋白的表達升高4.16 倍（t = 2.892，P < 0.01），表明干擾p53 表達，促進了A549 細胞的增殖；而FGF13 與p53 聯(lián)合干擾后，CyclinE 蛋白的表達也升高了4.85 倍（t = 3.237，P < 0.01）。見圖13 和圖14。結合p53 抑制FGF13 表達和FGF13促進CyclinE 表達的結果，可推測p53 基因干擾后，通過促進FGF13 的表達而增加CyclinE 蛋白的表達，從而誘導細胞增殖速度加快。

圖13 單獨FGF13 和p53 或聯(lián)合干擾處理A549 細胞的Western blot 分析Fig.13 Western blotting of A549 cells with FGF13 and p53 interference alone and in combination

圖14 單獨FGF13 和p53 或聯(lián)合干擾處理A549 細胞后p53 和CyclinE 蛋白的表達水平Fig.14 Expression levels of p53 and CyclinE proteins in A549 cells with FGF13 and p53 interference alone and in combination

3 討論

肺癌的特征是肺組織中細胞生長不受控制，因其早期癥狀不明顯，且診斷技術有限，很難引起人們重視［15］。因此，在過去幾十年中，研究人員一直致力于尋找新型分子標記物，用于肺癌的早期診斷。然而，至目前為止，臨床上仍未獲得可靠的治療靶標［16］。

細胞增殖是通過細胞周期來實現(xiàn)的，細胞周期的進程受細胞周期檢控點的嚴密調控，從而影響細胞數(shù)量的動態(tài)平衡［17］，檢控點基因突變是腫瘤發(fā)生的重要原因。因此，正常細胞和腫瘤細胞檢控點差異也是腫瘤治療的關鍵依據(jù)。腫瘤抑制蛋白p53 是一種廣泛研究的轉錄因子，可誘導腫瘤細胞生長停滯或凋亡［18］。研究發(fā)現(xiàn)，p53 能激活細胞周期抑制因子p21 的轉錄，而p21 又是細胞周期依耐性激酶CDK4、CDK2、CDK1 等的抑制因子［19］。通過這種抑制作用，p53 和p21 參與了細胞周期中G1／S 和G2 ／M 檢控點的調控［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，在A549 細胞中p53 低表達情況下，p21 基因轉錄水平也顯著降低，且細胞增殖效應明顯增強，表明p53 激活p21 的轉錄，抑制A549 細胞增殖，同時，發(fā)現(xiàn)p53 抑制FGF13 的表達。目前研究發(fā)現(xiàn)，結直腸癌（colorectal cancer）中miR-10b 靶向FGF13 抑制體內(nèi)CRC 細胞增殖和遷移［21］。JOHNSTONE 等［22］采用RNA-Seq 對原發(fā)腫瘤的基因表達譜分析表明，F(xiàn)GF13 基因在侵襲性轉移MDA-MB-231 HM 腫瘤中高度上調。FGF13 的過度表達使細胞能夠更有效地應對致癌Ras 蛋白引起的應激［23］。此外，在耐順鉑的宮頸癌細胞中，F(xiàn)GF13表達水平也顯著上調，推測FGF13 在鉑和銅協(xié)同作用下，介導了宮頸癌細胞對鉑類藥物的耐藥性［24］。這些研究結果表明，F(xiàn)GF13 參與腫瘤細胞的增殖、遷移、應激以及耐藥性等方面。但FGF13 對惡性腫瘤細胞周期檢控點的調控研究仍未見報道，僅在對小鼠C2C12 成肌細胞中的研究中發(fā)現(xiàn)，超表達FGF13基因，細胞周期中G1／S 期發(fā)生阻滯，導致C2C12成肌細胞增殖速度減慢［25］。因此，本實驗研究了A549 細胞中FGF13 對細胞周期檢控點的影響，發(fā)現(xiàn)FGF13 通過抑制p21 基因的表達，促進CyclinE的表達，從而促進細胞周期中G1 期向S 期的轉變，導致A549 細胞增殖速度加快，表明FGF13 在A549 細胞中發(fā)揮促癌的作用。

結合前期研究發(fā)現(xiàn)，p53 抑制FGF13 的表達，且FGF13 促進細胞周期G1 期向S 期轉變，本實驗進一步推測FGF13 作為一個促癌因子，是受到腫瘤抑制蛋白p53 的直接調控，通過細胞周期抑制因子p21通路，共同影響A549 細胞周期中G1／S 檢控點。但本實驗的結果僅來自于A549 細胞系，在NSCLC 其他細胞系和臨床組織樣品中，p53 和FGF13 是否仍存在這種調控關系尚需進一步研究驗證。