楊紅濤，袁敏學(xué) 綜述，張曉姝，李津，2 審校

1.武漢博沃生物科技有限公司，湖北 武漢 430075；2.華蘭生物疫苗股份有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453003

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pn）感染可引起較常見(jiàn)的鼻竇炎和中耳炎等輕癥，也可導(dǎo)致嚴(yán)重的侵襲性疾病，如腦膜炎、敗血癥和肺炎［1］，同時(shí)也是感染性疾病發(fā)病率和致死率居高不下及全球嚴(yán)重疾病負(fù)擔(dān)的主要原因［2］。2007 年，據(jù)WHO估算，此后全球每年將有160 萬(wàn)人死于S.pn 引發(fā)的疾病，其中70 萬(wàn)～ 100 萬(wàn)為5 歲以下兒童［3］。2000年，美國(guó)批準(zhǔn)7 價(jià)S.pn 多糖結(jié)合疫苗（seven-valent pneumococcal conjugate vaccine，PCV7）上市［4］；2009年，PCV10 及PCV13 也相繼上市，并于2009 — 2011年取代PCV7［5］。但這些疫苗存在血清型替代及年齡組覆蓋不全等局限性。2015 年，全球5 歲以下兒童死亡人數(shù)估計(jì)為583 萬(wàn)，其中由S.pn 感染所致死亡人數(shù)為29.4 萬(wàn)［1］；2016 年，全球下呼吸道感染導(dǎo)致5 歲以下兒童死亡約65.3 萬(wàn)人，S.pn 仍是引起全球各年齡組下呼吸道感染高發(fā)病率和死亡率的首要病原菌［6］。因此，研發(fā)能預(yù)防更多血清型S.pn 感染所致疾病及中低收入國(guó)家可負(fù)擔(dān)的廣譜S.pn 疫苗具有重要意義。

基于改造S.pn 毒力因子的新一代廣譜S.pn疫苗已處于研發(fā)中，其中4 項(xiàng)全細(xì)胞疫苗、15 種候選蛋白疫苗已展開(kāi)臨床試驗(yàn)。本文就新一代廣譜S.pn疫苗的最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 現(xiàn)有肺炎疫苗面臨的挑戰(zhàn)

1.1 全球普及接種PCV 的困境 澳大利亞、英國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家多項(xiàng)研究證實(shí)，接種肺炎疫苗在減少兒童因感染S.pn 住院中起到重要作用［7-8］。據(jù)2019 年VIEWhub 報(bào)告統(tǒng)計(jì)，全球已有144 個(gè)國(guó)家將接種PCV 納入國(guó)家免疫規(guī)劃（National Immunization Program，NIP），但仍有35 個(gè)中低收入國(guó)家未決定是否納入NIP。2017 年，全球仍有4230 萬(wàn)名嬰幼兒（占52%）未接種肺炎疫苗［9］。WHO 建議所有國(guó)家將PCV 納入NIP，但由于PCV 制備工藝復(fù)雜及價(jià)格昂貴，使該目標(biāo)至今未能實(shí)現(xiàn)。PCV13 通過(guò)全球疫苗免疫聯(lián)盟（The Global Alliance for Vaccines and Immunisation，GAVI）和泛美衛(wèi)生組織（Pan American Health Organization，PAHO）采購(gòu)的價(jià)格分別為2.90～2.95 和14.5 美元／劑［10-11］，私營(yíng)企業(yè)的售價(jià)是202 美元／ 劑［12］，而全球每年接種PCV 的費(fèi)用預(yù)計(jì)約160 億美元［13］。目前，中高收入國(guó)家PCV 覆蓋率僅為48%，中低收入國(guó)家覆蓋率為71%，雖然通過(guò)GAVI 采購(gòu)價(jià)格相對(duì)低廉，但當(dāng)一些中低收入國(guó)家成為中高收入國(guó)家時(shí)，GAVI 將結(jié)束資助，這些國(guó)家也可能無(wú)法繼續(xù)將PCV 疫苗納入NIP［14］，如肯尼亞2027 年將因經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)成為中收入國(guó)家，GAVI 將結(jié)束資助，國(guó)家會(huì)由于資金問(wèn)題而削減疫苗全民接種計(jì)劃以減少財(cái)政開(kāi)支［15］。人口總計(jì)占全球36.4%的中低收入國(guó)家的中國(guó)和印度（人口均超13 億）也未將PCV 納入NIP［16-17］。

雖然23 價(jià)S.pn 多糖疫苗（23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine，PPSV23）比PCV13 可預(yù)防更多血清型的S.pn 感染，但由于無(wú)載體蛋白，疫苗無(wú)法有效激發(fā)T 細(xì)胞依賴的抗體免疫反應(yīng)及潛在免疫記憶［18］，目前僅用于65 歲以上人群和高風(fēng)險(xiǎn)感染S.pn 的2 歲以上兒童［19］，同時(shí)美國(guó)免疫實(shí)踐咨詢委員會(huì)（Advisory Committee on Immunization Practices，ACIP）建議65 歲以上人群接種PCV13 后間隔1 年再接種PPSV23［20］。由于PPSV23 本身的缺陷，不適于在全球范圍內(nèi)進(jìn)行全年齡段推廣接種。

1.2 血清型替代風(fēng)險(xiǎn) 目前，依據(jù)莢膜特異性多糖成分可將S.pn 分為96 多種血清型［21］，PCV7 可覆蓋其中4、6B、9V、14、18C、19F、23F 7 種血清型，PCV10在此基礎(chǔ)上增加1、5、7F 3 種型別，PCV13 再增加3、6A、19A 3 種型別［22］。MORENO 等［23］在哥倫比亞首都波哥大對(duì)嬰幼兒接種PCV10 后展開(kāi)的一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，疫苗未覆蓋的19A 血清型S.pn 導(dǎo)致侵襲性肺炎病例的比例由2008 — 2011 年的4.4%上升至2014—2017 年的32.4%。在普遍接種PCV7或PCV13 的發(fā)達(dá)國(guó)家也存在類似現(xiàn)象，如在美國(guó)非PCV 覆蓋的6C、15A／B／C、23A、35B 血清型［24-25］，挪威和德國(guó)的15A、23B 血清型［26-27］，法國(guó)的12F、15A、24F、35B 血清型［28］，流行性均有所增強(qiáng)。因此，疫苗制造廠商紛紛研發(fā)覆蓋更多血清型的PCV，如德國(guó)Merck 公司的PCV15（新增22F、33F 血清型）［29］已成功完成2 項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)（NCT0-3480763，NCT03480802），并計(jì)劃遞交上市申請(qǐng)；美國(guó)輝瑞公司于2020 年3 月公布了20vPnC（新增8、10A、11A、12F、15B、22F、33F 血清型）Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果（NCT-037-60146，NCT03828617，NCT03835975），并準(zhǔn)備遞交上市申請(qǐng)；美國(guó)加州生物公司SutroVax 于2020 年3 月宣布完成1.1 億美元融資開(kāi)發(fā)24 價(jià)PCV。

2 新一代廣譜S.pn 疫苗的候選蛋白抗原成分

為克服現(xiàn)有PPSV23 無(wú)法保護(hù)主要風(fēng)險(xiǎn)群體（2歲以下兒童）及PCV 保護(hù)血清型有限且價(jià)格昂貴的局限性［30］，迫切需要開(kāi)發(fā)具有廣譜保護(hù)性的S.pn疫苗。S.pn 毒力因子及表面表達(dá)的高度保守蛋白抗原能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜和血清抗體反應(yīng)，可作為潛在的蛋白疫苗成分［31］。近年，研究者對(duì)眾多S.pn蛋白抗原的功能及免疫原性進(jìn)行了研究，RICHARD等［32］利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)多達(dá)52 種S.pn 保守蛋白抗原進(jìn)行了動(dòng)物免疫原性研究，主要的S.pn 蛋白抗原及功能見(jiàn)表1［33-39］。有研究通過(guò)對(duì)感染S.pn的人群進(jìn)行抗體篩查，進(jìn)一步分析感染S.pn 兒童樣本檢測(cè)到的特異性抗體，獲得了Ply、PspA、PspC 等蛋白抗原［34，39］。

表1 影響S.pn 毒力的主要蛋白及其功能Tab.1 Functions of main proteins influencing virulence of S.pn

目前研究最廣泛的為Ply 蛋白，其為一種膽固醇結(jié)合蛋白，在菌體自溶時(shí)釋放并在真核細(xì)胞膜上形成孔隙［40］，Ply 可通過(guò)TLR4、NLRP3 通路激活固有免疫［41-42］。天然的Ply 蛋白具有毒性，其無(wú)毒突變體已用于臨床試驗(yàn)［34］。另外，PspA 也是一種高度保守的膽固醇結(jié)合蛋白，廣泛存在于各S.pn 菌株中，并可產(chǎn)生交叉保護(hù)反應(yīng)，該蛋白可抑制C3 補(bǔ)體活性并使后者在菌體表面聚集，同時(shí)保護(hù)菌體免受乳鐵蛋白毒效應(yīng)［34］。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，PspA 作為候選疫苗成分可激發(fā)抗體免疫保護(hù)，具有預(yù)防侵襲性S.pn感染的潛在作用［43］。

3 新一代廣譜S.pn 疫苗

3.1 S.pn 蛋白疫苗 2017 年，ODUTOLA 等［44］用Ply類毒素（dPly）、PhtD 與10 個(gè)S.pn 血清型多糖抗原混合后作為候選疫苗，對(duì)岡比亞兒童進(jìn)行了Ⅱ期臨床試驗(yàn)，初步結(jié)果顯示，其耐受性良好，但在鼻咽部S.pn 載量研究中未發(fā)現(xiàn)對(duì)非10 個(gè)多糖抗原血清型S.pn 的廣譜保護(hù)效應(yīng)。2019 年，英國(guó)GSK 公司開(kāi)發(fā)的GSK2189242A 候選疫苗（含dPly、PhtD 突變體）已完成其用于預(yù)防急性中耳炎（acute otitis media，AOM）的Ⅱ期臨床試驗(yàn)［45］。另外，BROOKS 等［46］用重組表達(dá)PhtD、PlyD1、PcpA 三價(jià)候選疫苗進(jìn)行的Ⅰ期臨床結(jié)果顯示，該候選疫苗能增強(qiáng)成年人、老年人、兒童對(duì)所有S.pn 血清型的抗體水平。目前正在進(jìn)行的S.pn 蛋白候選疫苗臨床試驗(yàn)見(jiàn)表2［47-61］。

表2 S.pn 蛋白候選疫苗臨床研究相關(guān)信息Tab.2 Data on clinical trials of candidate S.pn vaccines

目前，國(guó)內(nèi)開(kāi)展S.pn 蛋白疫苗研究的高校團(tuán)隊(duì)均處于基礎(chǔ)理論研究階段，天津康希諾公司自主研發(fā)的重組S.pn 蛋白疫苗已進(jìn)入Ⅰ期臨床，預(yù)計(jì)將在2020 年完成Ⅰa 期臨床試驗(yàn)。另外，2019年3 月，蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司與英國(guó)疫苗研發(fā)公司ImmunoBiology 簽署許可協(xié)議，將獲得該公司通用型S.pn 疫苗PnuBioVax 在中國(guó)的開(kāi)發(fā)和商業(yè)化權(quán)利。

3.2 S.pn 全細(xì)胞疫苗 由于S.pn 全細(xì)胞疫苗（pneumococcal whole cell vaccine，PWCV）不需要純化蛋白抗原的工藝步驟、不涉及多糖-蛋白結(jié)合制備工藝、生產(chǎn)成本遠(yuǎn)低于PCV，適合發(fā)展中國(guó)家及低收入國(guó)家生產(chǎn)及大范圍覆蓋使用。目前已有動(dòng)物試驗(yàn)研究證明，無(wú)莢膜PWCV 可有效激發(fā)體液免疫及細(xì)胞免疫，從而預(yù)防多種S.pn 感染［62］。

KIM 等［63］將D39 型S.pn 的pep27 基因（△pep27）敲除，獲得的減毒菌株無(wú)法在肺部、血液及大腦定植。為進(jìn)一步降低△pep27 減毒株回復(fù)突變?yōu)橐吧投局甑娘L(fēng)險(xiǎn)，以增加其安全性，研究者進(jìn)一步敲除其comD基因，獲得的雙突變減毒株△pep27△comD 可有效誘導(dǎo)PspA 特異性IgG。在對(duì)小鼠進(jìn)行的D39、6B S.pn血清型攻毒試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，該雙突變株可有效提高小鼠存活率（＞80%）；同時(shí)，該候選疫苗還可有效抑制其他已分型、未分型S.pn 定植。JANG 等［64］通過(guò)敲除莢膜脯氨酸二酰甘油轉(zhuǎn)移酶基因（lgt）獲得的TIGR4（TIGR4△lgt）減毒株毒力、炎癥活性均降低，該減毒株可在鼻咽部有效誘導(dǎo)黏膜特異性IgA 和IgG2b 抗體反應(yīng)，小鼠鼻腔給藥的2 型S.pn（D39）、3 型（wu2）及6B、9V、19F 和23F 型攻毒挑戰(zhàn)試驗(yàn)顯示，該減毒株可產(chǎn)生廣譜預(yù)防效果。TERRA 等［65］將1 型（519／43）S.pn 菌株P(guān)ly 基因突變（519／43△Ply）獲得喪失溶血能力的減毒株，但隨后的動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然血液中S.pn 定植有所減少，卻未能對(duì)S.pn 侵襲產(chǎn)生理想的保護(hù)效果。

MELLROTH 等［66］將2 型S.pn 突變?yōu)闊o(wú)莢膜的RX1 菌株，進(jìn)一步敲除其自溶素基因（lytA）并用乙醇滅活，在以霍亂毒素（cholera toxin，CT）為候選疫苗佐劑的大鼠、小鼠鼻腔給藥挑戰(zhàn)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該候選疫苗對(duì)有莢膜的6B、3 型S.pn 在鼻腔定植及侵襲有保護(hù)效果。LU 等［67］將溶血素基因（Ply）突變?yōu)闇p毒的PdT 基因，進(jìn)而敲除全lytA 基因并換為卡那霉素抗性基因，獲高產(chǎn)RM200（RX1EPdT△lytA）菌株。該研究以β-丙內(nèi)酯滅活，并以氫氧化鋁為佐劑制備試驗(yàn)疫苗，對(duì)6B 型S.pn 的攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該候選疫苗可有效預(yù)防鼻咽部定植且可激活白介素-17A。帕斯適宜衛(wèi)生科技組織（Program for Appropriate Technology in Health，PATH）在肯尼亞展開(kāi)Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗(yàn)，用于評(píng)價(jià)此前接種過(guò)PCV，而后接種其滅活全細(xì)胞鋁佐劑候選疫苗（PATH-wSP）的安全性和耐受性［68］。目前正在進(jìn)行的S.pn 全細(xì)胞候選疫苗臨床試驗(yàn)見(jiàn)表3［68-71］。

表3 S.pn 全細(xì)胞候選疫苗臨床研究相關(guān)信息Tab.3 Data on clinical trials of candidate whole cell S.pn vaccines

4 小結(jié)與展望

目前，全球范圍內(nèi)感染S.pn 導(dǎo)致死亡率仍較高，特別是嬰幼兒、老年人、免疫功能低下者（如艾滋病患者）等人群。盡管隨著多糖型PPSV23 和蛋白結(jié)合型PCV10／13 疫苗在全球的廣泛使用，使S.pn 感染人數(shù)大幅降低，但仍有問(wèn)題亟待解決。如針對(duì)現(xiàn)有疫苗覆蓋以外S.pn 血清型及無(wú)莢膜S.pn 的預(yù)防效果不足；PPSV23 免疫原性低且無(wú)法產(chǎn)生有效的免疫記憶（低齡兒童）；面對(duì)血清型替代問(wèn)題，不斷增加PCV 抗原以覆蓋更多流行株，將面臨巨大的技術(shù)及經(jīng)濟(jì)挑戰(zhàn)。重組蛋白、全細(xì)胞廣譜肺炎疫苗生產(chǎn)成本低，能在發(fā)展中國(guó)家大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)可潛在地覆蓋各年齡組人群并誘發(fā)免疫記憶，產(chǎn)生非血清型依賴性保護(hù)。

雖然目前有眾多候選廣譜疫苗進(jìn)入臨床Ⅰ／Ⅱ期研究，但全球尚無(wú)廣譜S.pn 疫苗進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)。蛋白疫苗的組合方式、遞送系統(tǒng)、給藥途徑，如何保持全細(xì)胞疫苗生產(chǎn)批間一致性及減少副反應(yīng)還有待進(jìn)一步的臨床研究及評(píng)價(jià)。隨著技術(shù)的進(jìn)步，結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物信息學(xué)的發(fā)展，更為精準(zhǔn)、有效、安全的短肽納米顆粒疫苗將會(huì)進(jìn)一步推動(dòng)廣譜肺炎疫苗的研發(fā)，快速推動(dòng)新一代疫苗上市。