仉琪，曹學芬，李耀華

1.國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，北京 100081；2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250011

體外診斷試劑是指在疾病的預(yù)測、預(yù)防、診斷、治療監(jiān)測、預(yù)后觀察和健康狀態(tài)評價的過程中，用于人體樣本體外檢測的試劑、試劑盒、校準品、質(zhì)控品等產(chǎn)品，可單獨使用，也可與儀器、器具、設(shè)備或系統(tǒng)組合使用［1］。其中，用于血源篩查的體外診斷試劑和采用放射性核素標記的體外診斷試劑按照藥品進行管理，其他體外診斷試劑按照醫(yī)療器械進行管理。體外診斷試劑穩(wěn)定性是指產(chǎn)品在生產(chǎn)企業(yè)規(guī)定的條件下儲存，在規(guī)定的時間內(nèi)保持其性能特性的能力［2］，主要包括實時穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、機載穩(wěn)定性、復溶穩(wěn)定性（凍干產(chǎn)品）等［3］。穩(wěn)定性作為評價體外診斷試劑保持產(chǎn)品性能的重要指標，對產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)、運輸、保存和使用等環(huán)節(jié)具有重要意義，通過穩(wěn)定性研究可以評價和調(diào)整產(chǎn)品組方、工藝、包裝材料等，確定產(chǎn)品的保存期限和開封后保存期限，明確產(chǎn)品的運輸、儲存和開封后的保存條件，并可在產(chǎn)品保存期限和儲存條件等發(fā)生變更時，驗證變更后的產(chǎn)品穩(wěn)定性［4］。本文主要對按照醫(yī)療器械管理的體外診斷試劑穩(wěn)定性的研究方法和評價要求進行概述。

1 適用法規(guī)

1.1 我國的法規(guī)要求 根據(jù)國家市場監(jiān)督管理總局在2021 年發(fā)布的《體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式》，體外診斷試劑的穩(wěn)定性研究應(yīng)提交至少3 批申報產(chǎn)品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的實時穩(wěn)定性研究資料，明確儲存環(huán)境條件（如溫度、濕度和光照）及有效期［5］。上述規(guī)定是體外診斷試劑產(chǎn)品注冊資料中穩(wěn)定性研究的審評依據(jù)，規(guī)定了實時穩(wěn)定性研究的要求、批次和條件等，但對具體的研究方法及內(nèi)容并未進行詳細規(guī)定。2018 年，國家藥品監(jiān)督管理局公布了YY／T 1579-2018《體外診斷醫(yī)療器械體外診斷試劑穩(wěn)定性評價》［6］，規(guī)定產(chǎn)品穩(wěn)定性評價的通用要求，包括對實時穩(wěn)定性和加速穩(wěn)定性的具體要求，于2019 年3月1 日起實施。

同時在申報和上市階段，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品研制、生產(chǎn)階段對產(chǎn)品穩(wěn)定性的研究結(jié)果，將產(chǎn)品穩(wěn)定性信息載明于產(chǎn)品說明書和產(chǎn)品標簽上。根據(jù)《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》要求，產(chǎn)品說明書中儲存條件及有效期項應(yīng)載明產(chǎn)品儲存條件及有效期，同時還應(yīng)明確產(chǎn)品的開瓶穩(wěn)定性、機載穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、復溶穩(wěn)定性等內(nèi)容。產(chǎn)品標簽中至少應(yīng)載明產(chǎn)品儲存條件及有效期。針對有特殊儲存條件要求的產(chǎn)品，應(yīng)在產(chǎn)品說明書及標簽中明確，如陰涼、避光、直立等［7］。

產(chǎn)品穩(wěn)定性作為產(chǎn)品重要的性能指標，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)在產(chǎn)品研發(fā)和設(shè)計階段進行充分驗證，具體也可以參考國家藥品監(jiān)督管理局于2015 年發(fā)布的《生物制品穩(wěn)定性研究技術(shù)指導原則（試行）》［8］。由于穩(wěn)定性研究持續(xù)時間較長，生產(chǎn)企業(yè)也可在產(chǎn)品上市后繼續(xù)進行穩(wěn)定研究，通過變更注冊提供充分的研究資料來延長產(chǎn)品有效期。

1.2 可參考的國際要求 國際上關(guān)于體外診斷試劑穩(wěn)定性的基本要求與我國一致，要求注冊申請人提供隨著時間的推移及產(chǎn)品所處環(huán)境的變化，產(chǎn)品性能退化對產(chǎn)品安全有效的影響等研究資料。

美國FDA 于1991 年發(fā)布了指導原則《醫(yī)療器械貨架壽命》［9］，提供了穩(wěn)定性研究的考慮因素和驗證原則，但未涉及具體的驗證方法和測試項目。美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）于2009 年發(fā)布了《體外診斷試劑穩(wěn)定性評估指南》（EP25-A Evaluation of Stability of In Vitro Diagnostic Reagents），為定量和定性體外診斷試劑提供了穩(wěn)定性研究的指導［10］。該指南包括制定特定產(chǎn)品的穩(wěn)定性測試計劃時要考慮的背景信息和典型內(nèi)容、操作方法、數(shù)據(jù)分析及研究資料的歸檔，還包括產(chǎn)品運輸條件的評估，穩(wěn)定性監(jiān)測（驗證）及加速穩(wěn)定性試驗的使用［11］。歐洲標準化委員會（Commission for European Normalization，EN）于2002 年發(fā)布醫(yī)療器械指南性文件《體外診斷試劑的穩(wěn)定性試驗》（EN 13640：2002）［12］，該文件執(zhí)行十幾年后，國際標準化委員會于2011 和2015 年對該文件進行了修訂［13］，對產(chǎn)品穩(wěn)定性研究過程中的試驗設(shè)計、評價過程、研究報告、注意事項等內(nèi)容進行了指導。該文件適用于試劑、校準品、質(zhì)控品、稀釋液、緩沖液、試劑盒的穩(wěn)定性評價。

2 影響因素

體外診斷試劑組成成分中包含化學及生物活性物質(zhì)，保持這些成分物理、化學、生物特性是實現(xiàn)產(chǎn)品穩(wěn)定性的關(guān)鍵，任何影響產(chǎn)品組成成分特性的因素均有可能對產(chǎn)品穩(wěn)定性造成影響［14］。

2.1 原材料性能 體外診斷試劑反應(yīng)過程的實現(xiàn)依賴于各組成成分物理、化學、生物特性的穩(wěn)定，因此原材料性能的穩(wěn)定，對產(chǎn)品整體穩(wěn)定性具有關(guān)鍵作用。體外診斷試劑的原材料成分可能涉及化學物質(zhì)、抗原、抗體、酶等，而部分原材料的制備可能來源于血液、細胞、細菌、病毒等［15］。生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品研發(fā)階段應(yīng)在滿足產(chǎn)品檢測需求的條件下，篩選性能穩(wěn)定的原材料，同時，對于特性穩(wěn)定性不明確的原材料，在研發(fā)階段應(yīng)對其穩(wěn)定性進行充分研究。如有些產(chǎn)品其反應(yīng)體系中含有生物酶，包括膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶等。能夠滿足反應(yīng)體系中所需酶活性的酶可能有多種，包括天然的、重組的，天然的還包括動物來源的、微生物來源的等，生產(chǎn)企業(yè)在酶的選擇中應(yīng)考慮不同酶的穩(wěn)定性對產(chǎn)品整體影響；產(chǎn)品反應(yīng)體系中包含核酸的，應(yīng)考慮不同核酸分子在儲存條件下隨時間延長的穩(wěn)定性，一般而言，相同儲存條件下，雙鏈DNA 分子比單鏈DNA 分子穩(wěn)定，環(huán)狀DNA 分子比線性DNA 分子穩(wěn)定，DNA 分子比RNA分子穩(wěn)定［16］；反應(yīng)體系中包含氧化、還原物質(zhì)的，應(yīng)考慮隨著儲存時間的延長，其氧化、還原特性的改變［17］；產(chǎn)品反應(yīng)體系中包含熒光物質(zhì)的，應(yīng)考慮不同類別熒光物質(zhì)在儲存條件下的衰減等。另外，某些原材料在生產(chǎn)前的儲存時間對產(chǎn)品穩(wěn)定性也會造成一定影響，如原材料在生產(chǎn)前儲存時間過長，用此原材料生產(chǎn)的產(chǎn)品其穩(wěn)定性可能受到影響。

2.2 生產(chǎn)工藝 企業(yè)在生產(chǎn)過程中，不可避免地要進行主要原材料處理。原材料的處理及生產(chǎn)過程即為生產(chǎn)工藝，包括混合、標記、包被、加熱、干燥、凍干等［18］。原材料的處理可能會對其特性造成一定影響，進而影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性，如主要原材料包含蛋白質(zhì)的，一些加熱處理可能會對該原材料的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響；主要原材料包含核酸分子的，反復凍融及超聲波處理可能會影響該原材料的穩(wěn)定性；對于生產(chǎn)過程中需進行熒光素標記的工藝，應(yīng)注意避光操作，過多的光照可能影響熒光素的穩(wěn)定性等。另外，生產(chǎn)過程中環(huán)境的溫濕度條件、細菌狀況、原料儲存及包裝過程均有可能對試劑的性能產(chǎn)生影響，生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)工藝設(shè)計時應(yīng)考慮穩(wěn)定性相互影響的不同組分應(yīng)分開保存，同時對于穩(wěn)定性差的組分可采用特殊緩沖液保存或以凍干狀態(tài)保存［19］。

2.3 產(chǎn)品儲存條件 一般而言，已上市的體外診斷試劑在用戶使用前，應(yīng)為密閉保存，密閉保存條件對于產(chǎn)品穩(wěn)定性具有重要作用。一是體外診斷試劑多為液體狀態(tài)保存，未進行密閉保存的產(chǎn)品隨著保存時間的延長可能導致液體蒸發(fā)，進而影響產(chǎn)品的反應(yīng)體系，對產(chǎn)品穩(wěn)定性產(chǎn)生影響；二是產(chǎn)品未進行密閉保存時，隨著保存時間的延長，產(chǎn)品組成成分中某些物質(zhì)長期接觸空氣中的一些氣體（如氧氣、二氧化碳等），會對其性能產(chǎn)生影響，氧氣可能會氧化組分中處于還原態(tài)的物質(zhì)，二氧化碳可能影響組分中的氫氧根離子，與之反應(yīng)生成碳酸根離子等，這些反應(yīng)均會影響產(chǎn)品穩(wěn)定性；三是未進行密閉保存的產(chǎn)品，空氣中的微生物可能進入產(chǎn)品中，干擾反應(yīng)體系，如消耗反應(yīng)體系中的蛋白質(zhì)、改變反應(yīng)體系pH 等，進而影響產(chǎn)品的性能［20］。

產(chǎn)品的儲存條件是影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的重要因素［21］，包括溫度、濕度、光照等。溫度會影響產(chǎn)品組成成分中酶的活性，進而影響穩(wěn)定性。低溫可降低酶的活性，包括組成成分中固有的酶類及在產(chǎn)品生產(chǎn)過程中引入的其他與反應(yīng)體系無關(guān)的酶類，從而對蛋白質(zhì)等主要原材料進行保護［22］。對于保存狀態(tài)為干片類的產(chǎn)品，如血糖試紙、膠體金試紙及生化反應(yīng)干片等，濕度也是影響其穩(wěn)定性的因素，此類產(chǎn)品長期在濕度過高的環(huán)境中，過多水分進入反應(yīng)體系，可能會破壞產(chǎn)品自身儲存狀態(tài)，影響其穩(wěn)定性。對于反應(yīng)體系中有熒光物質(zhì)的產(chǎn)品，光照可能激發(fā)組分發(fā)射熒光，進而影響熒光物質(zhì)的穩(wěn)定性。生產(chǎn)企業(yè)在考慮產(chǎn)品穩(wěn)定性時，還應(yīng)綜合產(chǎn)品預(yù)期儲存條件。

3 注冊資料要求

3.1 基本要求 體外診斷試劑的主要原材料、生產(chǎn)工藝等對產(chǎn)品穩(wěn)定性均可能產(chǎn)生影響，因此生產(chǎn)企業(yè)進行最終穩(wěn)定性研究所用樣品應(yīng)為在符合產(chǎn)品生產(chǎn)質(zhì)量管理體系條件下生產(chǎn)的樣品，不應(yīng)為產(chǎn)品實驗室研發(fā)階段生產(chǎn)的樣品，同時，已進行穩(wěn)定性研究的產(chǎn)品其原材料、生產(chǎn)工藝等如發(fā)生影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的變更，應(yīng)考慮補充穩(wěn)定性研究。

生產(chǎn)企業(yè)在穩(wěn)定性研究過程中，應(yīng)保證除研究對象外其他物品性能能夠滿足要求，如包含在試劑盒中的樣本處理試劑、質(zhì)控品、校準品、參考品、標準品、臨床樣本等應(yīng)在有效期內(nèi)，且性能滿足要求。整體穩(wěn)定性研究過程中應(yīng)設(shè)置質(zhì)量控制方法，以保證研究結(jié)果的質(zhì)量。研究者在產(chǎn)品穩(wěn)定性研究過程中，應(yīng)明確穩(wěn)定性研究指標。穩(wěn)定性指標為最有可能體現(xiàn)儲存期間產(chǎn)品的質(zhì)量、安全性、有效性潛在重要變化的指標。這樣的指標可以反映產(chǎn)品本身的物理、生物、化學、微生物特性或使用中產(chǎn)品的分析性能。產(chǎn)品本身的穩(wěn)定性指標包括顏色、pH、粒徑、沉淀物、生物負荷、均一性和純度；使用中產(chǎn)品分析性能有關(guān)的穩(wěn)定性測試指標包括準確性、精密度、特異性、靈敏度、線性等，對于校準品與質(zhì)控品，測試指標可為靶值穩(wěn)定性、均勻性等［23-24］。生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)根據(jù)自身產(chǎn)品特性選擇合適的評價指標，指標的數(shù)量和項目取決于具體產(chǎn)品、產(chǎn)品的設(shè)計輸入要求及類似產(chǎn)品的穩(wěn)定性經(jīng)驗［25］。

研究者應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品穩(wěn)定性研究時間，設(shè)定不同時間點對產(chǎn)品穩(wěn)定性評價項目進行評價，所選擇時間點中應(yīng)至少包含開始點、中間點及結(jié)束點。對于持續(xù)時間較長的研究，應(yīng)明確規(guī)則在試驗周期內(nèi)選擇多個時間點對產(chǎn)品性能進行評估。對于穩(wěn)定性研究，研究者應(yīng)在研究方案中明確產(chǎn)品穩(wěn)定的可接受標準，此標準可為不同時間點產(chǎn)品性能指標變化的最大許可限度，也可通過評估不同時間點產(chǎn)品性能指標與時間的函數(shù)關(guān)系，明確回歸分析的可接受標準等。研究者應(yīng)根據(jù)研究實際及產(chǎn)品具體情況制定接受標準。

3.2 穩(wěn)定性研究試驗 實時穩(wěn)定性，也稱為貨架穩(wěn)定性，即將體外診斷試劑產(chǎn)品置于生產(chǎn)企業(yè)規(guī)定條件下進行試劑保存期限的建立或驗證。實時穩(wěn)定性研究可作為設(shè)定產(chǎn)品保存條件和有效期的主要依據(jù)。試驗過程中，研究對象的儲存條件應(yīng)滿足生產(chǎn)企業(yè)對產(chǎn)品儲存要求，如生產(chǎn)企業(yè)明確申報產(chǎn)品儲存溫度為2 ～8 ℃，則研究對象的儲存溫度應(yīng)不低于2 ℃或高于8 ℃。實時穩(wěn)定性應(yīng)采用多批產(chǎn)品（至少3 批）進行研究，如申報產(chǎn)品適用不同機型，可采用其中代表機型進行研究，研究時間應(yīng)持續(xù)至產(chǎn)品有效期之后。

3.2.1 運輸穩(wěn)定性 運輸穩(wěn)定性是將體外診斷試劑置于運輸過程中的極端環(huán)境條件下，從而考察產(chǎn)品穩(wěn)定性的研究，該運輸過程應(yīng)為從生產(chǎn)企業(yè)至用戶的運輸過程。運輸穩(wěn)定性應(yīng)采用多批產(chǎn)品進行研究，研究過程中，應(yīng)對產(chǎn)品在運輸過程中的儲存條件，如溫度、濕度等進行實時監(jiān)測，對運輸時間進行規(guī)定，產(chǎn)品運輸完成后，應(yīng)對運輸后樣品進行實時穩(wěn)定性研究，研究應(yīng)持續(xù)至效期后。

3.2.2 開瓶穩(wěn)定性及復溶穩(wěn)定性 一般而言，體外診斷試劑開瓶后應(yīng)立即使用，對于可多次使用的產(chǎn)品，應(yīng)對其開瓶穩(wěn)定性進行研究［26］；凍干產(chǎn)品應(yīng)對其復溶穩(wěn)定性進行研究。研究過程中應(yīng)明確開瓶／復溶后的儲存條件，儲存條件涉及凍融的，應(yīng)明確凍融次數(shù)要求。

3.2.3 機載穩(wěn)定性 對使用過程中需裝載至適用機型的產(chǎn)品，由于其機載儲存條件可能與產(chǎn)品儲存條件存在差異，因此應(yīng)對其機載穩(wěn)定性進行研究。機載穩(wěn)定性研究過程中，應(yīng)明確產(chǎn)品機載穩(wěn)定性時間，如產(chǎn)品適用不同機型，且不同適用機型試劑倉儲存條件不一致時，此項研究應(yīng)針對不同適用機型進行分別研究。

3.2.4 加速穩(wěn)定性 加速穩(wěn)定性是通過設(shè)計劇烈環(huán)境條件提高化學和（或）物理降解、變化的速度，從而預(yù)測體外診斷試劑有效期的研究。常見的加速穩(wěn)定性研究模型包括基于阿倫尼烏斯方程構(gòu)建的加速穩(wěn)定性模型等［27］。加速穩(wěn)定性研究可用于了解產(chǎn)品在短期偏離保存條件和極端情況下產(chǎn)品的穩(wěn)定性情況，為有效期和保存條件的確定提供支持性數(shù)據(jù)［8］。不同體外診斷試劑所含主要組成成分不同，特別是生物活性物質(zhì)存在差異，因此加速穩(wěn)定性僅可在產(chǎn)品穩(wěn)定性研究過程中，預(yù)計產(chǎn)品有效期，不能替代產(chǎn)品實時穩(wěn)定性研究。

另外，針對某些并非每次檢測均需校準的體外診斷試劑，生產(chǎn)企業(yè)還應(yīng)考慮校準穩(wěn)定性及校準頻率的研究。

4 相關(guān)思考

4.1 合理選擇穩(wěn)定性研究 在開展穩(wěn)定性研究之前，研究人員有必要結(jié)合有關(guān)法規(guī)要求和技術(shù)標準形成合理、清晰的穩(wěn)定性研究方案。研究方案中需明確此研究的目的、樣品批次、測試的項目、測試的間隔時間、具體測試方法及對最終測試結(jié)果的分析方法。需強調(diào)的是，按照我國體外診斷試劑的法規(guī)要求［28］，注冊時需提交儲存、運輸和使用穩(wěn)定性研究資料，對于加速穩(wěn)定性研究并不是法規(guī)的強制要求，其作用在于預(yù)測體外診斷試劑的有效期，而無法作為確定試劑有效期的確定依據(jù)，試劑有效期的確定仍需要實時穩(wěn)定性研究的結(jié)果。

4.2 研究與注冊的先后時間 穩(wěn)定性研究試驗一般耗時較長，尤其對于實時穩(wěn)定性研究和使用穩(wěn)定性研究。生產(chǎn)企業(yè)為了節(jié)約注冊整體時間，將穩(wěn)定性研究與注冊申報并行，希望在注冊過程中通過補充資料的形式來提供延長有效期的驗證資料，但此過程也意味著生產(chǎn)企業(yè)在注冊申報時提交的有效期及其驗證資料是不充分的。按照醫(yī)療器械注冊法規(guī)要求，注冊技術(shù)審評過程是基于申請人提出注冊申請時的產(chǎn)品作出是否予以注冊的技術(shù)評價意見，注冊過程中提交補充資料的途徑并不是改變注冊申請內(nèi)容的過程，應(yīng)是基于技術(shù)審評補正意見的答復，針對的是注冊申報時提交的信息范圍。因此生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)做好充分的注冊前研究，筆者不建議通過補充資料的方式變更申請有效期或儲存條件。

4.3 穩(wěn)定性指標的驗證方式 國家藥品監(jiān)督管理局重視體外診斷試劑的標準體系建設(shè)，目前已發(fā)布130 余項體外診斷試劑相關(guān)的推薦性行業(yè)標準，指導不同試劑產(chǎn)品的生產(chǎn)企業(yè)開展研究和注冊工作。其中，大多數(shù)標準中均有穩(wěn)定性研究指標，涉及效期穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性的研究要求。研發(fā)企業(yè)除了在注冊申報時提交穩(wěn)定性驗證資料，還會在編制產(chǎn)品技術(shù)要求和進行檢驗時對穩(wěn)定性研究指標進行驗證。需要注意的是，試劑（盒）產(chǎn)品適用的推薦性標準所涉及的穩(wěn)定性研究指標有限，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立自己的穩(wěn)定性研究體系，根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案，明確研究方法的確定依據(jù)、具體方法及過程。

5 小結(jié)

穩(wěn)定性研究貫穿于整個產(chǎn)品的研發(fā)階段，其結(jié)果是支持產(chǎn)品上市后儲存條件及有效期的關(guān)鍵證據(jù)。作為產(chǎn)品性能評價的一個重要方面，穩(wěn)定性研究與產(chǎn)品其他分析性能（如準確性、特異性、靈敏度）不同，不能采用直接測量的研究方法，需將試驗樣品按規(guī)定的儲存條件儲存，評價產(chǎn)品特性隨儲存時間的變化情況。產(chǎn)品穩(wěn)定性研究是生產(chǎn)企業(yè)的職責，穩(wěn)定性研究持續(xù)時間長，因此生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)在研究開始前，設(shè)定合理的研究方案，以期能夠為產(chǎn)品儲存條件及有效期提供科學合理的證據(jù)。在進行穩(wěn)定性研究之前應(yīng)按照我國的法規(guī)要求并參考國際的相關(guān)標準或注冊申報指南進行研究設(shè)計，以提高研究效率，縮短產(chǎn)品的注冊申報周期。