＊沙鳳 孫科 譚芳美 熊美惠

（蘇州科寧多元醇有限公司 江蘇 215000）

丁二酸可以作為關(guān)鍵的模塊化合物，用于生產(chǎn)各種商品化學(xué)品，包括1,4-丁二醇、己二酸和四氫呋喃，以及生物可降解聚合物，如聚丁二酸酯。它目前主要是通過化學(xué)合成工藝從化石燃料中生產(chǎn)出來的，這帶來了很高的環(huán)境成本，尤其是更高的二氧化碳排放。隨著化石燃料價(jià)格的飛漲和環(huán)境意識(shí)的提高，丁二酸的生產(chǎn)工藝可能需要變得更加經(jīng)濟(jì)和環(huán)保。

丁二酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，在一些厭氧和兼性厭氧生物的厭氧發(fā)酵過程中作為最終產(chǎn)物排出體外。目前利用發(fā)酵法合成丁二酸的主要菌種包括：產(chǎn)丁二酸厭氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens）、產(chǎn)丁二酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes）、大腸桿菌（E.coli）、產(chǎn)丁二酸曼氏桿菌（Mannheimia succiniciproducens）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）等[1]。盡管已報(bào)道多種微生物可以發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，但大多數(shù)生產(chǎn)菌在簡(jiǎn)單培養(yǎng)基中無法生長(zhǎng)，用于培養(yǎng)的有機(jī)氮源以及產(chǎn)物純化的費(fèi)用昂貴。為了使丁二酸的生物生產(chǎn)可行且經(jīng)濟(jì)，必須開發(fā)更高效的菌株和發(fā)酵方法。一方面能以較高的速率產(chǎn)生丁二酸，耐受較高濃度的物質(zhì)；另一方面能利用簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基，因?yàn)槲⑸锷L(zhǎng)所需的氨基酸或復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)阻礙了丁二酸的生產(chǎn)回收。為了實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)，選擇高效丁二酸生產(chǎn)微生物或?qū)Υx途徑的加強(qiáng)，是不可避免的。谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）是常用的氨基酸、有機(jī)酸生產(chǎn)菌,其生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)酸效率高，且具有良好的食品安全性[2-3]。

C.glutamicum主要通過葡萄糖形成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和丙酮酸，在羧化酶作用下合成草酰乙酸進(jìn)入TCA循環(huán)，經(jīng)蘋果酸及富馬酸，最終生成丁二酸[4]。在此過程中最主要限制因素為NADH的供給。C.glutamicum在厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸過程中，輔酶Ⅰ（NAD+，NADH）參與了多步反應(yīng)。根據(jù)代謝流理論，分析從葡萄糖到丁二酸的代謝途徑，1mol的葡萄糖在EMP途徑中共產(chǎn)生2mol NADH，通過TCA還原臂生成2mol的丁二酸，但是這個(gè)過程需要4mol NADH參與。為了達(dá)到葡萄糖到丁二酸的最高理論產(chǎn)率，就需要額外的2mol NADH。針對(duì)上述問題，我們以C.glutamicum SA001為生產(chǎn)丁二酸的出發(fā)菌株，它是一株乳酸脫氫酶缺陷的工程菌。通過提高代謝過程中輔酶NADH含量，增加由乙醛酸循環(huán)途徑到丁二酸的代謝流，考察丁二酸產(chǎn)量及產(chǎn)率的變化。

1.實(shí)驗(yàn)材料與方法

(1)菌株和質(zhì)粒

Escherichia coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保藏；C.glutamicum SA001由本實(shí)驗(yàn)室保藏；質(zhì)粒pMD18-T、pXMJ19由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

(2)方法

①培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，121℃滅菌15min。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂粉，121℃滅菌15min。

厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基：Glucose 20g/L，(NH4)2SO420g/L，urea 5g/L，KH2PO41g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，CaCl20.01g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，ZnSO4·7H2O 1mg/L，CuSO40.2mg/L，NiCl2·6H2O 0.02mg/L，biotin 0.2mg/L，110℃滅菌5min。

電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，3%甘氨酸，0.1% Tween 80，121℃滅菌15min。

②培養(yǎng)條件

種子液培養(yǎng)：將-20℃甘油保存的菌種于固體培養(yǎng)基平板劃線活化，30℃培養(yǎng)24h。用接種環(huán)刮取平板上的菌3環(huán)，轉(zhuǎn)至30mL含有10μg/mL氯霉素的培養(yǎng)基中。30℃，220rpm振蕩培養(yǎng)12h。

好氧誘導(dǎo)培養(yǎng)階段：將種子液以4%接種量接入30mL含有10μg/mL氯霉素和0.6mmol/L IPTG的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，200rpm下誘導(dǎo)培養(yǎng)10h。

厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸階段：將好氧誘導(dǎo)培養(yǎng)好的菌液在6000rpm，4℃低溫離心5min，去上清，用30mL發(fā)酵培養(yǎng)基洗菌后，轉(zhuǎn)入100mL血清瓶中，補(bǔ)加0.84g/L的Na2CO3，并通入氮?dú)馀懦w系內(nèi)的空氣后，擰緊瓶塞，30℃，220rpm下厭氧發(fā)酵8h。

③目的基因cysQ的克隆

引物設(shè)計(jì)：在NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫(kù)中，來源于E.coli DH5α編碼NADP(H)磷酸酶的基因cysQ（Genbank：NC_000913.2），設(shè)計(jì)其PCR擴(kuò)增引物cysQ-F（CCCAAGCTTATGTTAGATCAAGTA TGCCAGCTTG）和cysQ-R（GCTCTAGATTAGTAAATAGACACTCTG AACCCC），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：94℃變性5min，按如下參數(shù)循環(huán)30次：94℃變性1min，60℃退火60s，72℃延伸1.5min；最后72℃延伸10min。對(duì)所得到DH5α基因組DNA上的cysQ基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)所得到的產(chǎn)物分別用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

④重組質(zhì)粒pXMJ19-cysQ的構(gòu)建

純化后的cysQ基因片段以及質(zhì)粒pXMJ19用SmaⅠ和HindⅢ雙酶切，把雙酶切后得到的產(chǎn)物在16℃下經(jīng)T4 DNA連接酶作用連接12h以上，在E.coli DH5α中轉(zhuǎn)化構(gòu)建重組質(zhì)粒pXMJ19-cysQ。經(jīng)含氯霉素平板涂布后挑選抗性克隆，然后提取質(zhì)粒并進(jìn)行Hind Ⅲ單酶切及SmaⅠ/Hind Ⅲ的雙酶切鑒定。

⑤NADP(H)ase的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pXMJ19-cysQ和空質(zhì)粒pXMJ19分別電轉(zhuǎn)入C.glutamicum SA001中。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子按如下方法誘導(dǎo)表達(dá)：挑取單菌落至含20μg/mL氯霉素抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜；然后按3%的接種量接種到新鮮的培養(yǎng)液（含20μg/mL氯霉素）中，37℃培養(yǎng)至OD600約為0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度0.6mmol/L，30℃，200rpm下誘導(dǎo)表達(dá)6h。

⑥重組菌酶活測(cè)定

蛋白質(zhì)定量采用常規(guī)的Bradford法[5]。將新鮮菌體用100mmol/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液充分懸浮菌體進(jìn)行超聲破碎。破碎結(jié)束后，將菌液10000rpm，4℃離心15min。重組菌酶活力在0.5mM NADPH，5mM MgCl2，5mM丙酮酸，乳酸脫氫酶2U，100mMTris-HCl緩沖液（pH8.0）中進(jìn)行測(cè)定。在30℃，波長(zhǎng)340nm處檢測(cè)吸光值變化。1U酶量定義為NADP(H)磷酸酶每分鐘消耗1μmol NADPH的量。

⑦發(fā)酵代謝產(chǎn)物分析

菌體密度是用紫外可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600nm處測(cè)吸光度值，細(xì)胞干重（DCW）是由DCW與OD600測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到，換算公式為：DCW(g/L)=0.4×OD600。使用DNS法測(cè)定發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛?。輔酶含量測(cè)定，色譜柱為美國(guó)SEPAX公司Sepax HP-C18 Column色譜柱；流動(dòng)相A為含有5%乙腈的20mmol/L KH2PO4，pH5；流動(dòng)相B為純水；采用梯度洗脫方式，流速1ml/min；柱溫為37℃；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為260nm。

2.結(jié)果與分析

(1)NADP(H)磷酸酶基因在SA001中的克隆和表達(dá)

圖1 來源于Escherichia coli DH5α的NADP(H)磷酸酶基因的克隆Fig.1 Cloning of the NADP(H)ase gene from Escherichia coli DH5α

PCR擴(kuò)增后的NADP(H)磷酸酶基因cysQ和載體pXMJ19分別進(jìn)行SmaⅠ/Hind Ⅲ雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建表達(dá)載體pXMJ19-cysQ。重組質(zhì)粒經(jīng)單酶雙切鑒定，結(jié)果與預(yù)期一致。將PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳結(jié)果見圖1。由圖可知，在第2泳道（近750bp）有特異性擴(kuò)增條帶，其大小與預(yù)期符合（目的產(chǎn)物約為741bp）。第5泳道，約在4974bp和2368bp處各有單一條帶，表明目的片段NADP(H)磷酸酶基因已成功連接至表達(dá)載體pXMJ19中。

表1 對(duì)照菌與重組菌的比酶活及胞內(nèi)輔酶濃度Tab.1 Specific enzyme activity of NADP(H)ase，the concentration of intracellular NAD+，NADH，NADP+ and NADPH in the control strain and recombinant strain

重組菌總蛋白的SDS-PAGE分析如圖2所示。第1泳道為帶有pXMJ19-cysQ質(zhì)粒的E.coli DH5α超聲得到的可溶性蛋白，第2泳道為帶有空質(zhì)粒pXMJ19的E.coli DH5α超聲得到的可溶性蛋白，它表明所表達(dá)的重組蛋白大約為28kDa，其與預(yù)測(cè)的氨基酸序列大小較為一致，同時(shí)在對(duì)應(yīng)位置的第二泳道則幾乎沒有克隆蛋白表達(dá)，表明重組質(zhì)粒pXMJ19-cysQ構(gòu)建成功。

圖2 SDS-PAGE分析重組質(zhì)粒表達(dá)結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein

(2)NAD+、NADH、NADP+以及NADPH的測(cè)定

30℃、220r/min培養(yǎng)菌體至OD600=0.8，加入IPTG培養(yǎng)基中至終濃度為0.6mmol/L，30℃、220r/min誘導(dǎo)10h后，對(duì)出發(fā)菌株和重組菌株進(jìn)行相應(yīng)的酶活測(cè)定以及胞內(nèi)輔酶NAD+、NADH、NADP+和NADP測(cè)定，結(jié)果如表1所示。

重組菌NADP(H)磷酸酶的比酶活為0.625U/mg，相較于對(duì)照菌酶活提高了3.1倍，胞內(nèi)NAD(H)的總量提高了16.7%，同時(shí)，NAD(H)與NADP(H)總量提高了22.3%。這可能是因?yàn)榫w在過表達(dá)NADP(H)磷酸酶后，用于生物合成（如氨基酸，脂類以及核苷酸的合成）的輔酶Ⅱ減少，為維持細(xì)胞的生長(zhǎng)，菌體應(yīng)激調(diào)節(jié)機(jī)制促使輔酶Ⅱ的合成途徑增強(qiáng)，使胞內(nèi)輔酶水平整體提高。

(3)兩階段發(fā)酵產(chǎn)丁二酸

對(duì)照菌和重組菌有氧培養(yǎng)至干重達(dá)到8.9g/L、9.6g/L時(shí)，用新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基洗菌，轉(zhuǎn)入100mL血清瓶中，30℃，220rpm條件下厭氧發(fā)酵8h，并分別在0h，2h，4h，6h和8h取樣測(cè)定各種參數(shù)。兩階段發(fā)酵對(duì)照菌與重組菌厭氧發(fā)酵菌體干重、殘?zhí)橇?，產(chǎn)物丁二酸以及副產(chǎn)物乙酸濃度隨時(shí)間變化過程，如圖3所示。

以葡萄糖為碳源發(fā)酵產(chǎn)丁二酸，重組菌厭氧階段8h內(nèi)消耗了17.5g/L的葡萄糖，丁二酸的濃度達(dá)到11.9g/L。相較于對(duì)照菌，產(chǎn)物的得率增加了31.3%，同時(shí)副產(chǎn)物乙酸的量降低了6.97%，丁二酸與乙酸的摩爾比值提高了35.2%。這一結(jié)果表明，NADP(H)磷酸酶的過量表達(dá)，提高了輔酶NADH的供給，能夠使得流向乙酸合成途徑的代謝流量減少，增加丁二酸合成強(qiáng)度。

圖3 對(duì)照菌(a)與重組菌(b)厭氧發(fā)酵菌體干重、殘?zhí)且约爱a(chǎn)物隨時(shí)間變化過程Fig.3 Time-course of DCW,glucose and the products during anaerobic-phase fermentation after aerobic culture by the control strain (a)and recombinant strain (b) in sealed bottles

3.結(jié)論

通過構(gòu)建重組谷氨酸棒狀桿菌SA001/pXMJ19-cysQ，有氧條件下重組菌NADP(H)磷酸酶的酶活比，相較于對(duì)照菌酶活提高了3.1倍，并在厭氧發(fā)酵過程中仍然保持一定活性。

重組菌厭氧階段8h內(nèi)丁二酸產(chǎn)量達(dá)到11.9g/L，相較于對(duì)照菌，產(chǎn)物的得率增加了31.3%，同時(shí)副產(chǎn)物乙酸的量降低了6.97%，丁二酸與乙酸的摩爾比值提高了35.2%。