馬路凱，崔 蕓，劉芯如，柳建良，肖更生，陳海光，劉袆帆，利新紅

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東省嶺南特色食品科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，廣州 510225； 2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院，廣州 510225； 3.集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021； 4.梅州市梅縣區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東 梅州 514000)

柚子是柑橘的主要栽培類型之一，富含多酚、黃酮等活性物質(zhì)，營養(yǎng)價值高，風(fēng)味獨特，且有較好的抗氧化能力[1]，其中尤以梅州柚品質(zhì)較佳，有“中華名果”“嶺南十大佳果”的稱號[2]。隨著柚子種植面積的增大，產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物，如次果、壞果、落果等非鮮食果，以及柚核、柚子皮等。關(guān)于柚子副產(chǎn)物的提質(zhì)利用目前已引起國內(nèi)較多科研工作者的關(guān)注。有研究者發(fā)現(xiàn)柑橘類籽粒油脂含量高(40%以上)[3]，可以作為新型油脂資源，且其油脂富含亞油酸、油酸，具有很高的藥用價值[4]。柚子籽油中還含有一定量的生育酚、角鯊烯等脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)，諸多研究表明這些脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)具有抗氧化、抗癌、提高免疫、降血脂及改善炎癥反應(yīng)[5-7]等重要功能。因此，提高這些脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)的含量能提高柚子籽油的利用價值。

目前，有學(xué)者通過基因工程調(diào)控[8-9]、快中子輻照誘發(fā)突變[10]方式來提高油料種子(如大豆)的生育酚含量。這些方式程序煩瑣，最重要的是品種品質(zhì)差異性受到爭議。近年來，通過超聲誘導(dǎo)發(fā)芽提高油料種子中營養(yǎng)物質(zhì)含量成為國內(nèi)外的研究熱點之一。有研究表明超聲處理提高了大豆的發(fā)芽率，改善了豆芽可食性和營養(yǎng)品質(zhì)[11]。在種子發(fā)芽過程中，會引發(fā)一系列代謝變化，減少抗營養(yǎng)因子，提高功能因子[12]。已有研究表明發(fā)芽能提高大豆中生育酚的含量[13]；李淑瑩[14]研究發(fā)現(xiàn)花生在避光發(fā)芽過程中，不僅保持了花生的質(zhì)量，而且花生油中脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)白藜蘆醇(苷)、生育酚、植物甾醇和多酚等的含量均顯著升高。但是目前鮮見國內(nèi)外關(guān)于發(fā)芽過程中柚子籽油脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)變化的研究。

本研究以梅州金柚柚子籽為原料進行超聲誘導(dǎo)發(fā)芽實驗，研究發(fā)芽后柚子籽油中主要脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)生育酚、角鯊烯含量的變化規(guī)律，結(jié)合柚子籽得油率及柚子籽油脂肪酸組成、酸值、過氧化值評價發(fā)芽過程中柚子籽油的營養(yǎng)變化，探討其利用價值，以期為開發(fā)高品質(zhì)安全油脂提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

市售金柚(沙田柚)的柚子籽，產(chǎn)自廣東梅州；α-、β-、γ-、δ-生育酚標準品，Sigma公司；角鯊烯標準品，阿拉丁公司；石油醚、正己烷、異辛烷、無水乙醇、酚酞、氫氧化鈉、冰乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉等均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FA3204B電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；YB-700A高速多功能粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；RV10 KA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，美國Agilent公司；MesoMR23-040H-1核磁共振成像分析儀，上海紐邁電子科技有限公司；HX-650E智能型超聲波細胞破碎儀，上海滬析實業(yè)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲誘導(dǎo)柚子籽發(fā)芽

篩選外觀飽滿、大小一致、無霉變的新鮮柚子籽，用蒸餾水清洗去除表面雜質(zhì)，剝?nèi)ネ鈿?，并裝入燒杯中，加入蒸餾水沒過柚子籽1 cm，置于裝有蒸餾水的玻璃容器中。將超聲波細胞破碎儀的變幅桿伸入玻璃容器中部，調(diào)節(jié)以使功率分別為0、90、180、360 W，于25℃下避光超聲，超聲時間分別為0、10、20、30 min。超聲結(jié)束后將柚子籽于25℃避光浸泡6 h，取出，于25℃、95%濕度下避光發(fā)芽，每隔2 d噴淋蒸餾水，時間持續(xù)2 min。整個發(fā)芽周期為9 d，每隔1 d取樣，冷凍干燥，粉碎后過0.42 mm(40目)篩，置于-80℃冰箱保存待用。發(fā)芽率(F)按下式計算。

F=n1/n×100%

(1)

式中：n1為柚子籽發(fā)芽個數(shù)；n為柚子籽總個數(shù)。

1.2.2 柚子籽油的提取

取經(jīng)過1.2.1處理后的柚子籽粉于提取瓶中，按料液比1∶5加入石油醚，在45℃下浸提2 h，冷卻后過濾，將濾液在60℃旋蒸除去溶劑，即得柚子籽油，避光儲存于4℃冰箱中待用。柚子籽得油率(W)按下式計算。

W=m1/m×100%

(2)

式中：m1為柚子籽油的質(zhì)量，g；m為柚子籽粉的質(zhì)量，g。

1.2.3 核磁共振成像技術(shù)

參考文獻[15]的方法進行核磁共振成像。實驗條件為：共振頻率23.312 7 MHz，磁體強度0.5 T，線圈直徑60 mm，磁體溫度(32.00±0.01)℃。利用標準樣進行預(yù)掃描，尋找磁場中心頻率及磁場脈沖寬度，利用SE脈沖序列獲得樣本質(zhì)子密度加權(quán)像。成像的主要參數(shù)為：FOV Read 100 mm，F(xiàn)OV Phase 100 mm，TR 1 500 ms，TE 20 ms，Slices 7，Slice Width 3 mm。實驗樣本垂直于玻璃試管放置，采集樣本冠狀面(coronal)圖像，獲取柚子籽縱向信息。

1.2.4 脂肪酸組成的測定

油脂甲酯化[16]：稱取0.50 g柚子籽油，加入1 mL 2.0 mol/L的KOH甲醇溶液，振蕩反應(yīng)5 min后加入1 mL飽和氯化鈉溶液和1 mL正己烷，振蕩萃取后，以5 000 r/min離心2 min，取正己烷層，加入無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液過0.22 μm微孔濾膜，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

氣相色譜條件[17]：DB-1毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；升溫程序為柱溫100℃保持5 min，以10℃/min的速度升至200℃，保持5 min，以5℃/min的速度升至220℃保持10 min；進樣口溫度220℃；載氣(He)流速1.0 mL/min；進樣量0.5 mL。質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度350℃。

經(jīng)NIST質(zhì)譜譜庫檢索匹配，以不低于90%的匹配度確定各脂肪酸組分，采用峰面積歸一化法進行定量。

1.2.5 基本理化指標的測定

酸值的測定參考GB 5009.229—2016中的冷溶劑指示劑滴定法，過氧化值的測定參考GB 5009.227—2016中的滴定法，水分含量的測定參考GB 5009.3—2016。

1.2.6 生育酚、角鯊烯含量測定

生育酚含量的測定參考GB 5009.82—2016《食品安全國家標準 食品中維生素A、D、E的測定》第一法，角鯊烯含量的測定參考LS/T 6120—2017《糧油檢驗 植物油中角鯊烯的測定 氣相色譜法》。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

所有實驗測定均進行3次重復(fù)，結(jié)果用“平均值±標準偏差”表示。采用Excel 2010軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，運用Origin 2017軟件作圖，顯著性分析采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲功率及超聲時間對柚子籽發(fā)芽率的影響

超聲波技術(shù)是一種快速、無損有效打破種子休眠狀態(tài)的方法[18]，超聲處理能使種子表面軟化，改變細胞壁的結(jié)構(gòu)和細胞膜的通透性，增強細胞活力，對于種子的發(fā)芽率和生長發(fā)育具有積極影響[19]。在不同超聲功率及超聲時間下，發(fā)芽9 d時的柚子籽發(fā)芽率如圖1所示。

注：不同大寫字母表示同一功率不同超聲時間下柚子籽發(fā)芽率差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一時間不同超聲功率下柚子籽發(fā)芽率差異顯著(P<0.05)。

由圖1可知，柚子籽發(fā)芽率隨著超聲功率的增加和超聲時間的延長顯著提高。超聲波的機械作用及空穴作用產(chǎn)生的微流效應(yīng)可以提升生物體系的傳質(zhì)及液體混合，從而提高了生物反應(yīng)的速度。在超聲功率為90～180 W范圍內(nèi)，柚子籽發(fā)芽率隨著超聲時間的延長而顯著提高。但在超聲功率為360 W時，超聲20 min和30 min時的發(fā)芽率沒有顯著變化，發(fā)芽率分別為95.42%、95.34%，可能原因是達到一定的臨界范圍后，超聲波對柚子籽發(fā)芽不再具有促進作用。Yaldagard等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在超聲功率460 W、超聲時間5～10 min條件下，大麥種子發(fā)芽率由93.3%顯著提高到了99.4%。因此，本研究選用超聲功率360 W、超聲時間20 min條件下處理的柚子籽樣品進行后續(xù)實驗。

2.2 發(fā)芽對柚子籽得油率的影響

發(fā)芽對柚子籽得油率及水分含量的影響如圖2所示，柚子籽發(fā)芽核磁成像如圖3所示。

由圖2可知：未發(fā)芽柚子籽得油率為(55.74±0.15)%；發(fā)芽前3 d柚子籽得油率無顯著差異(P>0.05)，4～6 d時柚子籽得油率有所下降，7 d時得油率顯著下降，9 d時得油率為(52.18±0.01)%，與未發(fā)芽柚子籽相比，下降了3.56百分點。此結(jié)果與楊選等[21]研究花生籽粒在發(fā)芽過程中粗脂肪含量顯著降低的結(jié)果相似。另外，柚子籽發(fā)芽過程中，水分含量顯著上升。

注：同一指標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由圖3可知，在柚子籽邊緣呈現(xiàn)明顯的水分信號時，芽胚的基部也呈現(xiàn)較為明顯的水分信號，隨著發(fā)芽時間的延長，籽粒邊緣和芽胚的水分信號逐漸增強。有研究發(fā)現(xiàn)物料的游離水和外層結(jié)合水會影響油脂的提取率，水分含量較高時，物料表面會形成一層水膜，影響油脂溶出[22]，因此柚子籽得油率的下降可能與發(fā)芽過程中水分含量升高有關(guān)。也有研究指出種子胚中蛋白質(zhì)和脂肪含量較高，發(fā)芽過程種子內(nèi)部代謝加強，營養(yǎng)物質(zhì)被分解的同時種胚吸收這些被分解的物質(zhì)，從休眠狀態(tài)恢復(fù)活性，細胞恢復(fù)生長[23]，所以柚子籽得油率下降可能是柚子籽進行呼吸作用時，脂肪發(fā)生了分解代謝,為其發(fā)芽提供了能量。

圖3 柚子籽發(fā)芽核磁成像

由表1可知，柚子籽油主要含棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸5種脂肪酸。發(fā)芽過程中柚子籽油飽和脂肪酸含量由30.94%增加到31.21%，其中：棕櫚酸含量在發(fā)芽前3 d內(nèi)無顯著變化，此后幾天顯著升高；而硬脂酸含量在柚子籽發(fā)芽過程中由3.52%降至3.31%。在柚子籽發(fā)芽過程中柚子籽油不飽和脂肪酸含量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，由69.03%降低到68.78%，其中油酸含量在發(fā)芽過程中有所升高，亞油酸和亞麻酸含量均呈現(xiàn)下降趨勢。在整個柚子籽發(fā)芽過程中柚子籽油脂肪酸組成沒有變化。

表1 發(fā)芽對柚子籽油脂肪酸組成的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，芝麻在萌發(fā)至72 h過程中亞油酸含量減少，芝麻萌發(fā)前后主要脂肪酸組成類別無變化[24]，此結(jié)果與本研究相似。這可能是因為脂類主要以三?；视偷男问絻Υ?，在發(fā)芽過程中有少部分水解為游離脂肪酸和甘油，擴散到線粒體基質(zhì)，氧化為乙酰輔酶A，進入三羧酸循環(huán)提供能量，而碳水化合物是萌發(fā)過程中主要的能量來源[25]。在柚子籽9 d的發(fā)芽過程中，柚子籽油不飽和脂肪酸中的油酸含量升高了0.36百分點，亞油酸含量下降了0.50百分點，亞麻酸含量下降了0.14百分點，說明發(fā)芽使柚子籽油氧化穩(wěn)定性有所提高。

2.4 發(fā)芽對柚子籽油酸值及過氧化值的影響(見圖4)

注：同一指標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

酸值、過氧化值是評價油脂質(zhì)量的重要指標。酸值反映油脂發(fā)生水解反應(yīng)后游離脂肪酸含量[26]；過氧化值在一定程度上反映了油脂氧化變質(zhì)的程度[27]。由圖4可知，柚子籽發(fā)芽過程中柚子籽油的酸值顯著升高，過氧化值前5 d也顯著升高，發(fā)芽5 d時柚子籽油的酸值(KOH)、過氧化值分別為(1.19±0.04)mg/g、(1.98±0.02)mmol/kg，滿足GB 2716—2018《食品安全國家標準 植物油》中植物原油的限量標準。

2.5 發(fā)芽對柚子籽油生育酚、角鯊烯含量的影響(見圖5)

圖5 發(fā)芽對柚子籽油生育酚、角鯊烯含量的影響

生育酚是存在于植物油脂中的天然抗氧化劑，在油脂中起著重要的作用。由圖5可知，未發(fā)芽時柚子籽油中生育酚含量不足60 μg/g，隨著發(fā)芽時間的延長，生育酚含量顯著增加，發(fā)芽5 d時達到了峰值，為(265.29±0.05)μg/g，與未發(fā)芽時相比，生育酚含量增長了3.74倍。因此，發(fā)芽可以顯著提高柚子籽油的生育酚含量。生育酚含量在柚子籽發(fā)芽5 d后顯著下降，可能是因為生育酚的分解或轉(zhuǎn)化。李淑瑩等[28]研究花生發(fā)芽過程中生育酚含量變化發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽后生育酚含量顯著提高，為原料中的3.25倍。也有研究發(fā)現(xiàn)芝麻種子萌發(fā)過程中α-生育酚含量前5 d顯著升高,第6天時下降[29]。Li等[30]研究發(fā)現(xiàn)，亞麻籽萌發(fā)前5 d，亞麻籽油總生育酚含量呈先增加后下降的變化趨勢，總生育酚含量的增加是由于生育酚的合成是幼嫩植株生長的生理代謝物質(zhì)，降低是后期用作植株生長的促進劑和增效劑。

角鯊烯具有抗衰老、抗腫瘤及提高機體免疫功能的作用[31]。由圖5可知，在柚子籽發(fā)芽過程中，角鯊烯含量的變化與生育酚一致，也是先顯著升高后顯著下降。未發(fā)芽柚子籽制備的柚子籽油中角鯊烯含量為4.20 μg/g，發(fā)芽5 d時達到峰值，為(36.10±0.01)μg/g，與未發(fā)芽時相比，增長了7.60倍。同樣地，發(fā)芽具有提高柚子籽油中角鯊烯含量的作用。Young等[32]研究發(fā)現(xiàn)普通水稻、糯米、紅色水稻萌發(fā)后角鯊烯含量均顯著增加。因此，發(fā)芽可以提高柚子籽油脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)的含量，也提高了柚子籽油的利用價值。

3 結(jié) 論

本文以金柚加工副產(chǎn)物柚子籽為研究對象，采取超聲方式誘導(dǎo)柚子籽發(fā)芽，用石油醚抽提法提取柚子籽油，考察發(fā)芽對柚子籽油品質(zhì)的影響。結(jié)果顯示：超聲功率為360 W、超聲時間為20 min時的發(fā)芽率達到95.42%； 9 d發(fā)芽過程中柚子籽得油率下降3.56百分點，但仍滿足油料的要求；發(fā)芽不改變柚子籽油脂肪酸組成且發(fā)芽5 d時柚子籽油的酸值(KOH)((1.19±0.04)mg/g)、過氧化值((1.98±0.02)mmol/kg)均符合植物油國家標準；發(fā)芽5 d時柚子籽油生育酚((265.29±0.05)μg/g)、角鯊烯((36.10±0.01)μg/g)含量均達到了峰值，與未發(fā)芽相比分別增長了3.74倍和7.60倍。綜上，發(fā)芽不僅能保持柚子籽油的質(zhì)量，更顯著強化了其脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)，提高了柚子籽油的營養(yǎng)價值，開闊了柚子籽油的開發(fā)利用領(lǐng)域。