楊建遠，周 凱，楊義文，楊云仙，張炳火，查代明，鄧澤元

(1.九江學院 藥學與生命科學學院，江西 九江 332000； 2.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室， 南昌330047； 3.九江學院 旅游與地理學院，江西 九江 332005)

水劑法是一種“安全、營養(yǎng)、經(jīng)濟”的提油方法，具有工藝簡單、條件溫和、營養(yǎng)伴隨物基本得以保留及可有效利用餅粕等優(yōu)點[1]。然而，乳化問題是制約水劑法提取油茶籽油工業(yè)化應用的“瓶頸”[2]，并且水劑法提取油茶籽油時產(chǎn)生的乳化液難以在提油工藝中有效破乳[3]。

蛋白是一種雙親性大分子，易吸附于油水界面，通常具有一定的界面活性和膠體穩(wěn)定性，被廣泛用作乳化劑和穩(wěn)定劑。研究表明，大多數(shù)油料種子蛋白具有乳化特性，如從大豆[4]、葵花籽[5]、油莎豆[6]等提取的蛋白都具有較好的乳化活性。然而，蛋白乳化性的強弱很大程度上取決于其氨基酸組成、疏水性和二級結(jié)構(gòu)等結(jié)構(gòu)特性[7]。豆類蛋白二級結(jié)構(gòu)中β-折疊含量高于谷類蛋白，而α-螺旋含量低于谷類蛋白，豆類蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性強于谷類蛋白[8]。大豆-乳清混合蛋白(SPI-WPI)經(jīng)超聲處理可使其二級結(jié)構(gòu)及構(gòu)象發(fā)生一定的改變，導致其α-螺旋含量降低，β-轉(zhuǎn)角含量增加，分子結(jié)構(gòu)更加舒展，疏水基團暴露，乳化活性提高[9]。紫蘇籽球蛋白、清蛋白和分離蛋白中氨基酸含量以谷氨酸最高，蛋白溶解性以球蛋白最好[10]。因此，不同蛋白乳化能力的差異取決于蛋白自身結(jié)構(gòu)[11]。

蛋白、茶皂素和多糖等可能是水劑法提取油茶籽油過程中產(chǎn)生的乳化液中的主要乳化劑成分，其中蛋白含量占脫脂凍干乳化物的13.75%[12]。從油茶籽餅粕中提取的蛋白具有較好的起泡性和乳化性，而且經(jīng)不同的蛋白酶水解處理，其起泡性和乳化性可得以改善[13]。本文對水劑法提取油茶籽油過程中形成的乳化液的主要蛋白組分進行分離純化，探討與乳化相關的結(jié)構(gòu)特征，旨在闡明水劑法提取油茶籽油時乳化液形成機制及為其破乳提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

油茶籽，江西綠源油脂公司。DEAE-Sepharose Fast Flow柱，GE Healthcare Bioscience；考馬斯亮藍R250，上海化學試劑公司；SDS-PAGE試劑盒，碧云天生物公司；8-苯胺-1-萘磺酸鈉(ANS)，阿拉丁試劑公司。

F97Pro熒光光度計，上海棱光公司；S-433d氨基酸分析儀，Sykam公司；Nicolet 5700傅里葉變換-紅外光譜儀，美國熱電公司；K1100全自動定氮儀，海能科技公司；Ultra Turrax T18高速分散機, 美國IKA公司；JMS-50膠體磨，廊坊通用機械公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳化液中粗蛋白的提取[14]

油茶籽經(jīng)干燥、剝殼、粉碎及過篩處理，加4倍量的蒸餾水混勻，經(jīng)膠體磨勻漿，靜置待上層泡沫消失后，以4 200 r/min離心20 min，收集乳化液層。反復凍融離心去除乳化液中油脂，將殘渣凍干，經(jīng)乙醚浸泡后過濾脫脂2～3次，獲得脫脂乳化物。

稱取一定量的脫脂乳化物于錐形瓶中，按料液比1∶20加入90%乙醇溶液，30℃水浴120 r/min下振蕩30 min，以4 200 r/min離心20 min，取沉淀，提取2次。再以初始樣品質(zhì)量為基準，按料液比1∶30加入pH 8.0的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液，37℃搖床水浴60 min，離心，收集上清，沉淀重提1次，合并上清得蛋白粗提液。調(diào)pH至4.0，4℃冰箱靜置2 h，離心收集沉淀，取少量蒸餾水洗滌2次，超純水溶解，調(diào)pH至7.0，凍干，得粗蛋白。

1.2.2 粗蛋白乳化性的測定

1.2.2.1 乳液的制備[14]

采用pH 7.0的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液配制1%的粗蛋白溶液(含0.02%的疊氮鈉)。分別取24 mL粗蛋白溶液，用0.5 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH 分別至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0，用高速分散機于14 000 r/min下慢慢加入一定質(zhì)量的油茶籽油，使油茶籽油質(zhì)量分數(shù)為20%，當油茶籽油完全被乳化后，以11 000 r/min 的速度分散2 min，再經(jīng)簡單乳化裝置(專利號：ZL201620355811.8)均質(zhì)10次，得乳液。

1.2.2.2 乳液穩(wěn)定性及微觀結(jié)構(gòu)的觀察

分別取8.0 mL乳液分裝于比色管中，靜置觀察10 d后，取少量分散乳液用相應pH的緩沖液稀釋50倍，取50 μL稀釋乳液于凹槽載玻片上，蓋上蓋玻片，用熒光倒置顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)，并拍照。

1.2.3 粗蛋白的初步純化

用pH 8.0 的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液配制20 mg/mL的粗蛋白溶液，并上樣吸附于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，分別用含0.0、0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L NaCl的pH 8.0的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液分步洗脫，以每管8 mL自動收集洗脫液，采用Bradford法測定洗脫液中蛋白峰，收集合并蛋白峰，并用10 kDa超濾膜濃縮，凍干，獲得初步純化的蛋白組分(PEP)，采用凱氏定氮法測定PEP中蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 SDS-PAGE分析

參照文獻[15]和SDS-PAGE試劑盒進行SDS-PAGE分析。

1.2.5 氨基酸含量分析

參考Yin等[16]的方法略作修改。稱取20～30 mg PEP樣品于安瓿管，加10 mL 6 mol/L HCl溶液、1.0 g苯酚，通氮氣，110℃水解24 h，冷卻定容，取適量水解樣品水浴揮干，用1.0 mL 0.1 mol/L HCl(pH 2.2)溶解，過0.22 μm濾膜，待氨基酸分析儀分析。

1.2.6 內(nèi)源熒光強度(FI)的測定[17]

稱取PEP樣品溶于pH 7.0的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液中，使PEP質(zhì)量濃度為100 μg/mL，采用熒光光度計測定其FI。測定條件：狹縫寬度10 nm，激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長295～400 nm。

1.2.7 表面疏水性(S0)的測定[18]

用pH 7.0的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液配制PEP質(zhì)量濃度分別為0.50、0.25、0.13、0.03 mg/mL的樣品溶液，分別取3 mL樣品溶液，各加入20 μL 8.0 mmol/L ANS溶液，攪勻，暗處靜置15 min后，室溫下采用熒光光度計測定其熒光強度。測定條件：激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為390、470 nm，狹縫寬度10 nm。樣品質(zhì)量濃度與熒光強度直線方程的斜率即為S0。

1.2.8 二級結(jié)構(gòu)分析

采用傅里葉變換-紅外光譜(FTIR)預測蛋白二級結(jié)構(gòu)，PEP樣品處理參照Kang等[19]的方法。樣品蛋白凍干粉用KBr粉高壓制樣，掃描范圍4 000～400 cm-1。酰胺I帶光譜(1 600～1 700 cm-1)段內(nèi)蛋白利用Omnic和PeakFit軟件分析二級結(jié)構(gòu)。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

利用Origin 8.0 軟件作圖，數(shù)據(jù)以“平均值±標準偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗蛋白乳化性的初步觀察

按1.2.2.1方法制備乳液，發(fā)現(xiàn)不同pH條件均能形成包油量為20%的乳液且不同pH條件下的乳液隨著觀察時間的延長，均出現(xiàn)向上漂浮的現(xiàn)象，這可能是乳化包油量較大均質(zhì)不充分所致。靜置10 d后，pH 12.0的乳液出現(xiàn)部分乳粒破乳現(xiàn)象，其乳液上層可見少量油析出。

顯微鏡下觀察靜置10 d的乳液微觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)pH 2.0、4.0、6.0、8.0和10.0的乳液均為較穩(wěn)定的大小不均一的乳液粒子，僅有pH 12.0的乳液出現(xiàn)油粒(見圖1)。

因此，從乳化液中提取的粗蛋白在pH 2.0～10.0范圍條件下均具有較強的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。pH的變化可能改變了溶液中蛋白質(zhì)的構(gòu)象，導致其親水性基團(水結(jié)合位點)的暴露或包埋，從而改變其親水親脂平衡[20]。當pH增加至12.0時，很可能由于蛋白質(zhì)氨基酸基團的離子化，其親水性增加，從而親水親脂平衡被改變，蛋白在油水界面的親油能力減弱，導致乳粒的包油穩(wěn)定能力下降。因此，pH 12.0條件下的乳液長時間儲存后出現(xiàn)了油析現(xiàn)象。

注：目鏡10倍，物鏡40倍，標尺10 μm。

將1.2.1提取的粗蛋白按1.2.3方法采用pH 8.0的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液溶解，上DEAE-Sepharose Fast Flow 柱吸附，經(jīng)不同NaCl含量的Tris-HCl緩沖液洗脫，發(fā)現(xiàn)在含0.6 mol/L NaCl的pH 8.0的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液洗脫時獲得PEP洗脫峰，測得其蛋白質(zhì)含量為(84.78±5.57)%。

2.3 SDS-PAGE分析

PEP的SDS-PAGE分析結(jié)果見圖2。由圖2可知，PEP中的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量集中于10～35 kDa之間，主要為13、15、16、17、21、25 kDa和35 kDa 7個蛋白條帶，其中分子質(zhì)量13 kDa蛋白的含量最高。

圖2 PEP 的SDS-PAGE圖譜

2.4 氨基酸組成

PEP的氨基酸組成及含量測定結(jié)果見表1。

表1 PEP的氨基酸組成及含量

由表1可知：PEP中酸性、堿性、不帶電荷的極性氨基酸和非極性氨基酸含量分別為(48.10±0.11)%、(21.27±0.04)%、(11.62±0.05)%和(19.00±0.05)%。其中，谷氨酸含量高達(40.36±0.14)%，精氨酸含量和天冬氨酸含量分別為(14.51±0.09)%和(7.74±0.03)%。

2.5 內(nèi)源熒光強度和表面疏水性

蛋白溶液的內(nèi)源熒光強弱能體現(xiàn)蛋白分子表面疏水基團的信息，通常用于蛋白構(gòu)象特征的表征[21]。PEP內(nèi)源熒光強度分析結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，PEP的最大熒光強度(Fmax)為674.1，高于菜籽蛋白中乳化性白蛋白、球蛋白和分離蛋白在pH 4.0～9.0間的Fmax值(7.9～62.1)[22]。這是由于PEP表面的疏水基團易于引起蛋白之間更好的交互作用，能更容易在油水界面上形成分子排布的保護性層[23]。

圖3 PEP內(nèi)源熒光強度(FI)光譜圖

S0體現(xiàn)蛋白分散吸附于油水界面能力[24]。經(jīng)測定，PEP的S0值為2 243.70±169.28(R2=0.982)，稍高于木通子中的白蛋白與谷蛋白[25]?？梢?，PEP較高的表面疏水性有利于蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

2.6 二級結(jié)構(gòu)的預測

PEP的傅里葉變換-紅外光譜圖如圖4所示。

圖4 PEP的傅里葉變換-紅外光譜圖

3 討 論

3.1 乳化液中蛋白的乳化性

從水劑法提取油茶籽油過程中形成的乳化液中分離得到的粗蛋白乳化活性很強，僅以高速分散機簡單均質(zhì)便可在pH 2.0～12.0條件下形成包油量達20%的水包油型乳液，室溫下儲存10 d僅見pH 12.0條件下形成的乳液出現(xiàn)油析現(xiàn)象，這可能是蛋白在強堿性條件下乳化能力減弱，形成的乳粒表面蛋白保護層難以長時間維持高達20%的包油量所致。

3.2 乳化液中蛋白的結(jié)構(gòu)特性

3.2.1 乳化液中蛋白的組成

粗蛋白經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow柱初步純化時，含0.6 mol/L NaCl的pH 8.0的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液洗脫時獲得唯一主要蛋白洗脫峰，PEP為完整的純化乳化蛋白組分，SDS-PAGE分析表明，PEP主要為含有7個分子質(zhì)量的蛋白條帶的混合蛋白，分子質(zhì)量范圍為10～35 kDa。油體蛋白具有雙親性分子結(jié)構(gòu)，在油水兩相存在的混合物中容易發(fā)生乳化，是廣泛存在于植物種子中的一種天然乳化性蛋白[28]。多數(shù)含油種子中乳化性油體蛋白多為分子質(zhì)量較小的亞型，如：大豆有1種16 kDa，3種18 kDa，3種24 kDa的油體蛋白亞型[29]；花生有14、16、18 kDa 3種油體蛋白亞型[30]；油茶籽有5種油體蛋白亞型，包括3種高分子(H)亞型(OleⅠ、OleⅣ和OleⅤ)，2種低分子(L)亞型(OleⅡ和OleⅢ)[31]。PEP中的幾個分子質(zhì)量相近的蛋白條帶是否為油茶籽中主要乳化性的油體蛋白相關亞型值得進一步鑒定。

3.2.2 乳化性蛋白的結(jié)構(gòu)特征

PEP中二級結(jié)構(gòu)含量高低順序為β-折疊、α-螺旋、無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角。蛋白二級結(jié)構(gòu)與表面疏水性具有相關性，Chen等[27]報道大豆蛋白表面疏水性與α-螺旋含量呈負相關，與β-折疊和無規(guī)卷曲呈正相關。PEP中β-折疊含量達31.55%，谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量高，其溶液最大熒光強度為674.1，S0值高達2 243.70±169.28?？梢?，PEP中二級結(jié)構(gòu)、氨基酸組成等有利于蛋白表面疏水性及其乳化特性。

4 結(jié) 論

水劑法提取油茶籽油形成的乳化液中乳化性粗蛋白組分經(jīng)高速分散與均質(zhì)，在不同pH條件下均能形成包油量達20%的乳液。經(jīng)初步純化后得到的蛋白組分PEP包括7個主要蛋白條帶的混合蛋白，分子質(zhì)量范圍為10～35 kDa，其中分子質(zhì)量13 kDa蛋白的含量最高。PEP具有較多的有利于乳化的結(jié)構(gòu)特征，如：蛋白二級結(jié)構(gòu)中β-折疊、無規(guī)卷曲含量相對較高，氨基酸組成中谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量高，同時，蛋白溶液具有較高的內(nèi)源熒光強度和表面疏水性結(jié)構(gòu)特征。推測蛋白組分PEP為水劑法提取油茶籽油過程中乳化液形成的重要因素之一。