王興瑞，韓玉澤，李應(yīng)霞，王淑珍，陳昀昀，王進(jìn)英,2

(1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，西寧810016； 2.青海大學(xué) 三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810016)

亞麻，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，主要分布在我國(guó)西北和華北北部干旱、半干旱地區(qū)[1]。其中，青海省亞麻種植歷史悠久，其特有的高原地理和氣候特征使得亞麻成為青海省一種具有栽培價(jià)值的油料作物。亞麻籽油是以油用亞麻為原料制備的一種干性油[2]，油中α-亞麻酸含量可達(dá)50%～60%[3]。α-亞麻酸是維持機(jī)體正常生理功能和生長(zhǎng)發(fā)育的必需脂肪酸[4]，具有提高免疫力、降血壓、降血脂、預(yù)防心腦血管疾病等功能[5]。因此，亞麻籽油具有很好的市場(chǎng)前景。

由于亞麻籽油優(yōu)越的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其摻偽現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。目前，對(duì)植物油摻偽識(shí)別主要是通過(guò)測(cè)定植物油中的脂肪酸、甾醇、揮發(fā)性組分等成分來(lái)完成。但是，對(duì)于植物油中脂肪酸和甾醇等成分的測(cè)定并不能完全區(qū)分植物油的類(lèi)別[6]。甘三酯(TAG)是植物油中的主要成分，且每種類(lèi)型的植物油都有其特有的TAG特征[7]，所以對(duì)植物油TAG的測(cè)定可為植物油質(zhì)量控制和摻偽識(shí)別提供參考[8]。

目前對(duì)于植物油TAG的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法和液相色譜法[9]，但氣相色譜法需要在高溫(>350℃)條件下進(jìn)行，高溫環(huán)境可能導(dǎo)致色譜柱劣化和TAG降解[10]，還不容易確定TAG的異構(gòu)體結(jié)構(gòu)和雙鍵數(shù)目[11]，影響檢測(cè)效果。液相色譜法則適用于大多數(shù)非揮發(fā)性成分的測(cè)定，根據(jù)各脂肪酸鏈長(zhǎng)和不飽和度的不同，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)TAG分子的分離[9]。對(duì)于液相色譜法檢測(cè)TAG，折光率檢測(cè)器常用于常規(guī)和等度分析[12]；紫外檢測(cè)器在極低波長(zhǎng)(205～210 nm)下顯示出良好的線性響應(yīng)[13]，但對(duì)飽和TAG的檢測(cè)靈敏度較低；與高效液相色譜-紫外檢測(cè)器相比，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)靈敏度更高，適用性更好[14]。近年來(lái)，HPLC-ELSD法被廣泛應(yīng)用于植物油TAG組分的測(cè)定。Marwa等[15]利用HPLC-ELSD法建立了特級(jí)初榨橄欖油TAG指紋圖譜，可實(shí)現(xiàn)對(duì)橄欖油品種和成熟度的鑒別；Zhang等[14]用HPLC-ELSD法測(cè)定了杜仲籽油的TAG含量；皇甫志鵬等[16]利用HPLC-ELSD法建立了純芝麻油的TAG指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，可對(duì)摻偽大豆油和葵花籽油比例達(dá)到3%的芝麻油做出準(zhǔn)確的判定。

本研究以青海省亞麻籽油為研究對(duì)象，利用HPLC-ELSD法測(cè)定分析了青海亞麻籽油中TAG組成分布情況，構(gòu)建了亞麻籽油TAG指紋圖譜，利用指紋圖譜對(duì)亞麻籽油進(jìn)行摻偽識(shí)別，旨在開(kāi)發(fā)一種快速、簡(jiǎn)便的亞麻籽油摻偽檢測(cè)方法，為青海省亞麻籽油的質(zhì)量監(jiān)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

40種青海亞麻籽樣品信息見(jiàn)表1；大豆油、玉米油、菜籽油、花生油、葵花籽油、芝麻油，購(gòu)于京東廣生林食品專(zhuān)營(yíng)店。色譜純異丙醇、色譜純乙腈，美國(guó)天地試劑公司。

表1 40種青海亞麻籽樣品信息

1.1.2 儀器與設(shè)備

Shimadzu LC-20AD高效液相色譜儀(配備有CMB-20A控制器、LC-20AD二元泵、SIL-20A 自動(dòng)進(jìn)樣器和CTO-10AS柱溫箱)，日本Shimadzu公司；2000ES-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，美國(guó)奧泰科技(中國(guó))有限公司；ZORBAX SB-C18分析型色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美國(guó)Agilent公司；XW-80A渦旋混合器；FA2004B電子天平。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 亞麻籽油的制備

亞麻籽清理、分揀、粉碎后得到亞麻籽粉，利用索氏抽提法(提取溶劑為石油醚，料液比0.06∶1，提取溫度70℃，提取時(shí)間8 h)提取亞麻籽油，低溫旋蒸除去石油醚后備用。40種亞麻籽QH-1～QH-40制備的亞麻籽油對(duì)應(yīng)編號(hào)為S1～S40。

1.2.2 HPLC-ELSD法分析亞麻籽油中TAG組成

1.2.2.1 樣品制備

精確稱(chēng)取(50.0±0.1)mg亞麻籽油，用異丙醇充分渦旋混勻溶解后，定容于10 mL容量瓶中。樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，進(jìn)樣分析。

1.2.2.2 HPLC-ELSD法測(cè)定條件

參照王進(jìn)英等[17]測(cè)定油茶籽油甘三酯組成的方法，并對(duì)梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，最終色譜條件為：ZORBAX SB-C18分析型色譜柱(4.6 mm ×250 mm, 5 μm)；柱溫25℃；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為異丙醇，流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表2；流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10 μL；漂移管溫度80℃；空氣流速2.8 L/min；增益1。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 精密度試驗(yàn)

取同一種亞麻籽油(S1)，按照1.2.2.1的方法進(jìn)行處理，連續(xù)進(jìn)樣分析6次，計(jì)算亞麻籽油中各TAG組分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和保留時(shí)間的RSD。

1.2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一種亞麻籽油(S1)，按照1.2.2.1的方法制備6份樣品進(jìn)樣分析，計(jì)算亞麻籽油中各TAG組分峰面積的RSD。

1.2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一種亞麻籽油(S1)，按照1.2.2.1的方法進(jìn)行處理后，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣分析，計(jì)算亞麻籽油中各TAG組分峰面積的RSD。

1.2.4 青海亞麻籽油TAG指紋圖譜的構(gòu)建

將40種亞麻籽油樣品按1.2.2方法進(jìn)行分析，得到S1～S40共40個(gè)原始圖譜。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004 A)，設(shè)立參照?qǐng)D譜，經(jīng)多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配，得到亞麻籽油TAG標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

1.2.5 摻偽模型建立

按大豆油、玉米油、菜籽油、花生油、葵花籽油和芝麻油，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、20%、30%、40%、50%，將其與亞麻籽油混合，按照1.2.2.1的方法制備樣品，建立摻偽模型。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值，采用Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

亞麻籽油TAG在不同梯度洗脫條件下的液相色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，優(yōu)化前亞麻籽油中TAG組分出峰時(shí)間主要集中在5～20 min，優(yōu)化后的洗脫程序可以對(duì)色譜峰實(shí)現(xiàn)更好的分離，分析時(shí)間縮短至50 min，同時(shí)大大節(jié)省了試劑用量。

圖1 亞麻籽油TAG在不同梯度洗脫條件下的液相色譜圖

2.2 7種植物油TAG的定性、定量分析

2.2.1 定性分析

在相同色譜條件下，分析大豆油、玉米油、菜籽油、花生油、葵花籽油、芝麻油6種植物油的TAG組成。基于TAG按照ECN數(shù)(ECN=CN(碳原子數(shù))-2DN(雙鍵數(shù)目))由小到大分離的規(guī)律[17]，7種植物油TAG的液相色譜圖如圖2所示。由圖2可知：菜籽油中峰7峰面積最大，根據(jù)安廣杰[18]、Yasushi[19]等對(duì)菜籽油中TAG組分的研究，OOO(ECN=48,O為油酸)是菜籽油中含量最高的TAG組分(分別占比34.99%和28.7%)，故將保留時(shí)間為19.45 min的峰7定性為ECN48分區(qū)；大豆油、玉米油和葵花籽油中峰5a峰面積最大，根據(jù)Salghi等[20]對(duì)大豆油、Zhang等[21]對(duì)玉米油和Sara等[22]對(duì)葵花籽油中TAG組分的研究，LLO(ECN=44，L為亞油酸)是其最主要的TAG組分，故將14.61 min出現(xiàn)的峰5a定性為ECN44分區(qū)；芝麻油在16.83 min出現(xiàn)的峰6a峰面積最大，根據(jù)皇甫志鵬[16]、Sara[22]等的研究，OOL(ECN=46)是其最主要的TAG組分(分別占比31.43%、17.43%)，故將此峰定性為ECN46分區(qū);結(jié)合文獻(xiàn)[23-25,7]的研究，將12.76 min出現(xiàn)的峰4a定性為L(zhǎng)LL(ECN42分區(qū))；再結(jié)合文獻(xiàn)[26，27-30]對(duì)亞麻籽油中TAG含量分布的研究，可以推斷亞麻籽油中峰1為L(zhǎng)nLnLn(ECN36，Ln為亞麻酸)，峰2為L(zhǎng)LnLn(ECN38)，峰3為OLnLn(ECN40)，峰4b為OLLn(ECN42)，峰5b為OLnO(ECN44)，峰6b為SOLn(ECN46，S為硬脂酸)，峰7為OOO(ECN48)，峰8為POO(ECN48，P為棕櫚酸)。

圖2 7種植物油TAG的液相色譜圖

2.2.2 定量分析

采用峰面積歸一化法對(duì)青海不同產(chǎn)地亞麻籽油TAG組分進(jìn)行定量分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 青海不同產(chǎn)地亞麻籽油TAG含量分布情況

由表3可知，青海省四個(gè)產(chǎn)區(qū)亞麻籽油中各TAG含量差異不顯著(P>0.05)，但相同產(chǎn)區(qū)亞麻籽油中各TAG組分有顯著差異(P<0.05)。不同ECN分區(qū)中ECN40分區(qū)的相對(duì)含量最高，平均為 29.40%(P<0.05)；其次是ECN36，平均為23.71%(P<0.05)；在ECN38、ECN42、ECN44分區(qū)中，其TAG含量相近。TAG含量大小順序?yàn)镺LnLn(29.40%)>LnLnLn(23.71%)>OLnO(15.10%)>OLLn(13.43%)>LLnLn(13.32%)>SOLn(2.84%)>OOO(1.56%)>POO(0.18%)。由此可得，青海亞麻籽油TAG組分主要是以亞麻酸(Ln)、油酸(O)、亞油酸(L)為主的長(zhǎng)碳鏈型不飽和脂肪酸甘三酯，這與楊青坪[26]對(duì)亞麻籽油TAG組分研究的結(jié)論一致。另外，對(duì)比本實(shí)驗(yàn)室對(duì)青海亞麻籽油脂肪酸含量的測(cè)定結(jié)果(亞麻酸(Ln)42.14～60.39 g/100 g，油酸(O)12.45～26.14 g/100 g，亞油酸(L)10.30～15.04 g/100 g，棕櫚酸(P)4.13～5.54 g/100 g，硬脂酸(S)2.62～5.09 g/100 g)，發(fā)現(xiàn)各TAG含量與脂肪酸含量基本吻合，脂肪酸含量影響TAG含量。

亞麻籽油與6種用于構(gòu)建摻偽模型的植物油之間的TAG含量分布情況見(jiàn)表4。由表4可知，亞麻籽油的TAG組成與6種摻偽植物油的TAG組成有較大差異，6種植物油TAG主要集中在ECN42～48(LLL、LLO、OOL、OOO)分區(qū)，而亞麻籽油中TAG主要為ECN40和ECN36。亞麻籽油中LnLnLn、LLnLn、OLnLn、OLLn含量與其他6種植物油的差異顯著(P<0.05)，亞麻籽油獨(dú)特的TAG組成也為亞麻籽油摻偽識(shí)別提供了可能性。

表4 7種植物油的TAG含量分布情況

2.3.1 精密度試驗(yàn)

試驗(yàn)表明，LnLnLn、LLnLn、OLnLn、OLLn、OLnO、SOLn、OOO、POO的峰面積RSD分別為0.16%、0.23%、0.09%、0.11%、0.21%、0.30%、0.11%、0.21%，保留時(shí)間RSD分別為0.04%、0.04%、0.05%、0.07%、0.09%、0.12%、0.15%、0.21%，說(shuō)明精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

試驗(yàn)表明，LnLnLn、LLnLn、OLnLn、OLLn、OLnO、SOLn、OOO、POO的峰面積RSD分別為1.15%、1.21%、1.30%、1.67%、0.93%、1.37%、1.67%、1.41%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

試驗(yàn)表明，LnLnLn、LLnLn、OLnLn、OLLn、OLnO、SOLn、OOO、POO的24 h內(nèi)峰面積RSD分別為0.31%、0.61%、0.20%、0.09%、0.13%、0.79%、0.18%、0.20%，說(shuō)明樣品制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 青海亞麻籽油TAG指紋圖譜的構(gòu)建

按照1.2.4的方法，得到亞麻籽油S1～S40的原始液相色譜圖和亞麻籽油TAG的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，分別如圖3、圖4所示。

指紋圖譜的相似度表明指紋圖譜的整體相關(guān)性，計(jì)算各油樣的相似度可以對(duì)油樣進(jìn)行更系統(tǒng)的評(píng)定[31]。將亞麻籽油標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004 A)，對(duì)比40種亞麻籽油TAG液相色譜圖，其相似度均大于0.98，表明構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求[32]，可以在一定程度上代表青海亞麻籽油樣品的整體性。

注：圖中由下至上為亞麻籽油S1～S40。

注：1.LnLnLn；2.LLnLn；3.OLnLn；4.OLLn；5.OLnO；6.SOLn； 7.OOO； 8.POO。

2.5 TAG指紋圖譜在青海亞麻籽油摻偽識(shí)別中的應(yīng)用

比較1.2.5中建立的6種植物油摻偽模型液相色譜圖與亞麻籽油TAG標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，對(duì)摻偽比例和相似度進(jìn)行二項(xiàng)式擬合，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 各摻偽模型與指紋圖譜相似度的二項(xiàng)式擬合方程

由表5可知，6種植物油摻偽模型二項(xiàng)式擬合方程R2均大于0.98，呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，理論上可以應(yīng)用于5%～50%摻偽量的摻偽識(shí)別。根據(jù)各摻偽模型與指紋圖譜的相似度，利用各二項(xiàng)式擬合模型計(jì)算摻偽量，對(duì)比真實(shí)摻偽量，求得相對(duì)誤差，摻偽模型與指紋圖譜相似度及相對(duì)誤差見(jiàn)表6。

表6 摻偽模型與指紋圖譜的相似度及相對(duì)誤差 %

由表6可知：本指紋圖譜對(duì)摻入5%～50%大豆油、玉米油、菜籽油(摻偽量10%～50%)、花生油、葵花籽油和芝麻油的亞麻籽油鑒別平均相對(duì)誤差分別為0.37%、1.21%、0.29%、2.25%、1.05%、1.46%，均處于較低水平。大豆油摻偽量為5%～50%時(shí)識(shí)別度均處于較高水平(Re≤0.70%)；芝麻油和葵花籽油次之(Re≤2.75%、Re≤2.90%)；花生油摻偽量為10%時(shí)相對(duì)誤差較高(Re=9.15%)；菜籽油摻偽量為5%時(shí)超出了擬合方程的計(jì)算范圍，未能實(shí)現(xiàn)鑒別。

綜上，本試驗(yàn)構(gòu)建的亞麻籽油甘三酯指紋圖譜在摻偽量5%～50%時(shí)，最適合價(jià)格相對(duì)最低的摻偽大豆油的鑒別，能達(dá)到精準(zhǔn)鑒別；對(duì)摻偽葵花籽油和芝麻油的鑒別也處于較高水平；但本指紋圖譜不適合摻偽量5%菜籽油的鑒別；對(duì)摻偽量為10%花生油的鑒別也可能存在較大誤差。

3 結(jié) 論

本研究利用HPLC-ELSD法測(cè)定了青海亞麻籽油中TAG組成及含量，運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)構(gòu)建了TAG標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，并運(yùn)用該指紋圖譜識(shí)別了6種摻偽量為5%～50%的摻偽模型。結(jié)果表明：該指紋圖譜可對(duì)摻入5%～50%大豆油、玉米油、葵花籽油、芝麻油的亞麻籽油進(jìn)行識(shí)別，其中：對(duì)價(jià)格相對(duì)最為低廉的大豆油鑒別效果最好；對(duì)花生油摻偽量10%的摻偽模型鑒別誤差較大，相對(duì)誤差為9.15%；對(duì)于摻偽量5%的菜籽油摻偽模型未能識(shí)別，但可準(zhǔn)確識(shí)別摻偽量10%～50%摻偽模型。研究結(jié)果可為青海省亞麻籽油品質(zhì)控制和摻偽識(shí)別提供理論依據(jù)。