劉春梅，林春蘭，劉昌樹，鄭繡蒨

(佳格食品(中國)有限公司，江蘇 太倉 215400)

芝麻油不僅具有食用價(jià)值，也具有藥用價(jià)值，是我國食用歷史悠久的一種植物油。芝麻油因香味濃郁、營養(yǎng)豐富而受廣大消費(fèi)者的喜愛。人們很早就發(fā)現(xiàn)芝麻油能長期存放不易發(fā)生氧化酸敗，具有較高的氧化穩(wěn)定性[1]。這是因?yàn)橹ヂ橛椭胁粌H含有生育酚、甾醇等活性物質(zhì)，還含有木脂素類化合物，這些木脂素類化合物的存在使芝麻油的氧化穩(wěn)定性比其他食用油高[2]。芝麻木脂素除了具有抗氧化作用外，還具有保護(hù)肝臟、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、降低膽固醇和抗癌等生理活性[3]。而在芝麻油加工過程中形成的細(xì)辛素還具有抗真菌、抗藥物過敏等功能[4-6]。因此，很多學(xué)者對芝麻木脂素類化合物進(jìn)行了一系列的研究。

芝麻木脂素的分析檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)[7-12]、薄層色譜法(TLC)[13]、氣相色譜法(GC)[14]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[15]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)[16]等，其中HPLC應(yīng)用最為廣泛。樣品前處理方法有溶劑提取法[7-10,17]、固相萃取法[18-21]、皂化法[22]等，其中溶劑提取法操作簡單、應(yīng)用范圍廣。目前現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 31579—2015)《糧油檢驗(yàn) 芝麻油中芝麻素和芝麻林素的測定 高效液相色譜法》中用氨基固相萃取柱和硅膠固相萃取柱串聯(lián)的固相萃取法對樣品進(jìn)行前處理，此方法操作煩瑣，存在回收率或重復(fù)性不佳等問題，且試驗(yàn)成本較高、耗時(shí)長，只檢測芝麻素和芝麻林素兩種組分。這兩種組分是芝麻油中含量較高的兩種木脂素組分，此外芝麻酚和細(xì)辛素也是比較常見的木脂素組分。細(xì)辛素是芝麻油在精煉過程由芝麻素異構(gòu)化而成[5]，因此細(xì)辛素可以作為精煉芝麻油的一種特征指標(biāo)。芝麻酚在精煉和未精芝麻油中均有可能存在，但實(shí)際檢測中發(fā)現(xiàn)其含量較低[7]。因此，本文主要研究芝麻油中芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素3種組分的分析檢測方法。參照文獻(xiàn)[7,9]，采用有機(jī)溶劑提取、HPLC同時(shí)分析芝麻油中3種木脂素組分，優(yōu)化溶劑提取條件以提高檢測的精密度，建立一種操作簡單、快速、檢測成本低、精密度高的方法，準(zhǔn)確定性和定量芝麻油中芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素含量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

芝麻油樣品，購自當(dāng)?shù)爻?；芝麻素?biāo)準(zhǔn)品(CAS號為607-80-7，純度≥98.8%)、芝麻林素標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號為526-07-8，純度≥99.5%)、甲醇(色譜純)，上海安譜科技有限公司；細(xì)辛素標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號為133-04-0，純度≥98%)，麥克林生化科技有限公司；超純水。

Agilent 1260高效液相色譜儀(配G7114A紫外檢測器)，美國安捷倫公司；分析天平，Sartorius公司；渦旋混勻器，美國精騏有限公司；超聲振蕩儀，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制：分別精確稱取芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素標(biāo)準(zhǔn)品各20 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，得質(zhì)量濃度為2 mg/mL的芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：各取1 mL芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別用甲醇定容至10 mL，得質(zhì)量濃度為200 mg/L的芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素標(biāo)準(zhǔn)中間液。標(biāo)準(zhǔn)中間液用甲醇進(jìn)一步稀釋，得到芝麻素、芝麻林素質(zhì)量濃度分別為4、8、20、40、100 mg/L和細(xì)辛素質(zhì)量濃度分別為1、4、8、20、40 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機(jī)前配制。

1.2.2 液相色譜條件

ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇-水(體積比75∶25)；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30℃；紫外檢測器波長287 nm。

1.2.3 樣品前處理

稱取0.1 g芝麻油樣品于離心管中，加入5 mL甲醇，渦旋2 min以混合均勻；超聲2 min(超聲頻率為40 kHz)，以4 500 r/min離心2 min，取上層清液于10 mL棕色容量瓶中。再分別用3 mL和2 mL甲醇進(jìn)行上述提取步驟，合并上層清液，并用甲醇定容到10 mL。

1.2.4 試樣中芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素的測定及含量計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)工作液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品提取液過0.22 μm有機(jī)濾膜后進(jìn)行HPLC分析。

試樣中芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素含量的計(jì)算按公式(1)進(jìn)行。

X=C×V/m

(1)

式中：X為芝麻素/芝麻林素/細(xì)辛素含量，mg/g；C為根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的芝麻素/芝麻林素/細(xì)辛素的質(zhì)量濃度，mg/L；V為定容體積，L；m為取樣質(zhì)量，g。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Excel和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 甲醇用量的優(yōu)化

本文參考文獻(xiàn)[7,9]選擇甲醇作為提取溶劑。按1.2.3方法，取樣品0.1 g，分別用5、10、15 mL甲醇進(jìn)行提取，提取次數(shù)為3次，渦旋時(shí)間2 min，超聲時(shí)間10 min，然后按1.2.4方法檢測芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素含量，結(jié)果如表1所示。

表1 甲醇用量對芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素檢測結(jié)果的影響

由表1可以看出：甲醇用量由5 mL增加至10 mL時(shí)，芝麻素的檢測結(jié)果顯著增加(p<0.05)；甲醇用量由10 mL增加至15 mL時(shí)，芝麻素檢測結(jié)果并沒有顯著差異(p>0.05)；不同甲醇用量的芝麻林素和細(xì)辛素的檢測結(jié)果差異不顯著(p>0.05)。因此，選擇甲醇用量為10 mL。

2.1.2 超聲時(shí)間的優(yōu)化

超聲輔助提取法是利用超聲過程產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動、高加速度和空化作用，促使目標(biāo)物進(jìn)入提取溶劑中，以縮短提取時(shí)間、節(jié)省提取溶劑的一種提取方法，因此本文利用超聲輔助提取芝麻油中的芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素。

按1.2.3方法，取樣品0.1 g，用10 mL甲醇提取3次，渦旋時(shí)間2 min，固定超聲時(shí)間分別為2、6、10、14 min，然后按1.2.4方法檢測芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素含量，結(jié)果見表2。

由表2可知，超聲時(shí)間延長，芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素檢測結(jié)果并沒有顯著差異(p>0.05)，說明超聲時(shí)間對芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素檢測結(jié)果影響不大，故選擇最短超聲時(shí)間2 min。

表2 超聲時(shí)間對芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素檢測結(jié)果的影響

2.2 檢測方法的考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限

將芝麻素、細(xì)辛素和芝麻林素單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果表明，芝麻素、細(xì)辛素和芝麻林素的出峰時(shí)間分別為8.56、9.70、11.00 min。再將配制好的標(biāo)準(zhǔn)工作液空白以及處理好的樣品進(jìn)行HPLC分析，得到色譜圖如圖1所示。

圖1 HPLC譜圖

由圖1可以看出，芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素樣品與標(biāo)準(zhǔn)品有相同的滯留時(shí)間，且色譜峰雜峰少、峰型良好、分離度良好，因此可確認(rèn)樣品具有芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素。

以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對應(yīng)質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)信噪比確定檢出限(LOD)(S/N=3)以及定量限(LOQ)(S/N=10)，結(jié)果如表3所示。

表3 芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

由表3可以看出，芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.999 5、0.999 6和0.999 2，表明芝麻素、芝麻林素、細(xì)辛素分別在4～100 mg/L、4～100 mg/L和1～40 mg/L的范圍內(nèi)線性良好。芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素的檢出限和定量限分別為0.03、0.02、0.02 mg/g和0.06、0.06、0.04 mg/g。檢測結(jié)果若小于檢出限則記錄“未檢出(ND)”；若大于檢出限但小于定量限則記錄“檢出”；若大于定量限則記錄具體數(shù)值。

2.2.2 加標(biāo)回收率

向已知木脂素含量的芝麻油中分別加入低、中、高3個(gè)濃度的木脂素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.2.3方法進(jìn)行處理，按1.2.4方法進(jìn)行測定。每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)3次，并重復(fù)進(jìn)行3 d，計(jì)算相應(yīng)的加標(biāo)回收率，結(jié)果如表4所示。

表4 芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素的加標(biāo)回收率(n=3)

由表4可知：連續(xù)3 d芝麻素的回收率為87.17%～92.59%，芝麻林素的回收率為92.71%～102.24%，細(xì)辛素的回收率為95.66%～108.93%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于5%，符合加標(biāo)水平大于1 mg/kg加標(biāo)回收率為80%～110%的規(guī)范，說明本方法具有良好的準(zhǔn)確性。

2.2.3 精密度

取同一樣品，按1.2.3方法進(jìn)行處理，按1.2.4方法進(jìn)行測定，重復(fù)分析6次，并重復(fù)進(jìn)行3 d，重復(fù)分析6次，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果如表5、表6所示。

表5 芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素日內(nèi)精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

由表5、表6可以看出，芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素的日內(nèi)精密度(RSD)分別為0.72%、1.50%和1.35%，日間精密度(RSD)分別為0.53%、1.69%和1.16%，RSD均小于2%。檢測范圍落在品質(zhì)范圍內(nèi)，可信度佳，說明本方法對芝麻油中芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素含量的分析具有良好的精密度和重復(fù)性。

表6 芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素日間精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.4 不同人員間對比

為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法的穩(wěn)定性，對同一芝麻油的木脂素含量進(jìn)行了人員對比分析。重復(fù)分析6次，并連續(xù)進(jìn)行3 d，結(jié)果如表7所示。由表7可知，不同人員對同一樣品的芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小，芝麻素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.10%～1.35%，芝麻林素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.51%～1.68%，細(xì)辛素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.05%～3.50%，均不超過4%。進(jìn)一步驗(yàn)證了方法的精確性。

表7 不同人員對比試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 與有資質(zhì)的質(zhì)檢部門檢測結(jié)果比對

有CNAS資質(zhì)的質(zhì)檢部門檢測芝麻木脂素所用方法為GB/T 31579—2015 《糧油檢驗(yàn) 芝麻油中芝麻素和芝麻林素的測定 高效液相色譜法》，而國標(biāo)方法僅檢測芝麻素和芝麻林素兩個(gè)組分。因此，將本方法檢測芝麻素和芝麻林素的結(jié)果與有資質(zhì)的質(zhì)檢部門檢測結(jié)果進(jìn)行比對，樣品由本實(shí)驗(yàn)室提供，共提供5個(gè)芝麻油樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如表8所示。

表8 實(shí)驗(yàn)室自檢與有資質(zhì)的質(zhì)檢部門結(jié)果對比

由表8可知，兩方法對芝麻素檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.00%～7.41%，對芝麻林素檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.43%～7.04%，均小于10%。因此，該檢測結(jié)果再現(xiàn)性良好。

2.3 芝麻油樣品測定

采用本方法檢測購自本地超市的各芝麻油樣品中木脂素的含量，結(jié)果如表9所示。

表9 不同芝麻油樣品中芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素的含量(n=3) mg/g

由表9可知，各芝麻油樣品中均檢測到芝麻素和芝麻林素，且芝麻素含量均大于芝麻林素含量。樣品中芝麻素含量范圍為2.70～6.28 mg/g；芝麻林素含量范圍為0.97～3.15 mg/g；細(xì)辛素含量范圍為ND～0.46 mg/g。芝麻素和芝麻林素是芝麻籽粒本身就存在的兩種木脂素，其含量與芝麻品種、產(chǎn)地以及芝麻油的加工工藝有關(guān)[23-25]。細(xì)辛素為芝麻油加工過程中轉(zhuǎn)化而成，芝麻油加工過程中經(jīng)過高溫炒籽、磷酸水化脫膠和活性白土吸附脫色等工序可能使芝麻素異構(gòu)化形成細(xì)辛素[4]。因此，樣品中各木脂素含量不同，與芝麻的來源和芝麻油的加工工藝有關(guān)。

2.4 本方法與國標(biāo)方法的差異

本研究方法與國標(biāo)方法(GB/T 31579—2015)的差異見表10。

表10 本研究方法與國標(biāo)方法的比較

由表10可見：本研究方法檢測組分比國標(biāo)方法多；且樣品前處理方法的原理與國標(biāo)方法不同，國標(biāo)方法是利用氨基固相萃取柱和硅膠固相萃取柱串聯(lián)對目標(biāo)物進(jìn)行萃取、凈化和富集，樣液流過固相萃取柱時(shí)木脂素被吸附，甘油三酯等干擾物質(zhì)流出，再將木脂素洗脫下來從而達(dá)到分離凈化的目的，而本研究方法以甲醇為提取溶劑，利用木脂素在甲醇與油脂中溶解度的不同進(jìn)行提?。槐狙芯糠椒ㄋ迷噭?、耗材的種類和數(shù)量比國標(biāo)方法少，大大降低了檢測成本，且本研究方法前處理耗時(shí)短。

3 結(jié) 論

本文優(yōu)化了甲醇提取芝麻油中芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素的條件，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 5、0.999 6和0.999 2。本方法重復(fù)性好、精密度高，加標(biāo)回收率在87.17%～108.93%之間。本方法可分析芝麻油中芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素，且操作簡單、耗時(shí)短、檢測成本低，可應(yīng)用在快速、準(zhǔn)確定性和定量芝麻油中芝麻素、芝麻林素和細(xì)辛素含量的檢測分析。