李 楊，劉麗美，唐志國，馬麗媛，劉東琦，張雨迪

(綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152061)

二氫槲皮素又稱花旗松素、黃杉素，存在于多種植物中，尤其在落葉松中含量很高[1-2]，是一類擁有活潑的羥基氫的黃酮類化合物[3]，具有抗氧化、抗癌、抗病毒、抗炎等功能特性[4-5]。近年來，二氫槲皮素在葡萄、橘子和西柚中也有發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已被廣泛關(guān)注和研究，然而二氫槲皮素不溶于油脂，限制了其在含油脂類食品中的應(yīng)用。

甘油解豬油是由豬油通過甘油解反應(yīng)制得，主要成分為甘油二酯(diacylglycerol, DAG)，其具有親水親油性，而且食用后在人和動物體內(nèi)不蓄積，可以起到抑制體重增加、降血脂、減少內(nèi)臟脂肪積累等功效[6-7]，是很好的脂肪替代物，然而由于甘油解豬油在常溫下呈固態(tài)，不利于生產(chǎn)加工，且在貯藏過程中易被氧化，因此其應(yīng)用受到限制。

微乳液是一種由油、水、表面活性劑及助表面活性劑組成的熱力學(xué)上穩(wěn)定的溶液體系[8]，其能有效地運載功能營養(yǎng)成分。Aditya等[9]用雙重乳液運載姜黃素和兒茶素，提高了其在胃腸消化過程中的生物利用率;李朝陽等[10]研究發(fā)現(xiàn)以中鏈甘油三酯為油相載體包埋槲皮素的納米乳液能有效提高槲皮素的生物保留率。甘油解豬油脂肪酸組成與豬油相似[11]，以其作為微乳液運載二氫槲皮素的研究鮮有報道。

本試驗以甘油解豬油為油相，將二氫槲皮素包埋于微乳液中，制備負載二氫槲皮素的甘油解豬油微乳液，通過體外抗氧化及消化模型測定負載二氫槲皮素微乳液的還原力以及對DPPH、ABTS和羥自由基的清除能力，系統(tǒng)探討負載二氫槲皮素微乳液的體外抗氧化性和消化性。該研究不僅可以加強二氫槲皮素在含油脂類食品中的應(yīng)用，同時還能夠解決含甘油解豬油的食品在貯藏過程中易被氧化的問題，為二氫槲皮素在具有功能特性的甘油解豬油中的應(yīng)用及開發(fā)該類功能性肉制品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘油解豬油(DAG含量47.92%)，實驗室自制；二氫槲皮素，西安拓豐生物有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)，美國Sigma 公司；2,2′-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)，湖南匯百特生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

UT-1800型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；XK96-B型旋渦振蕩器，江蘇新康醫(yī)療器械有限公司；T18 basic型高速勻漿機，德國IKA公司；SRH60-70高壓均質(zhì)機，上海申鹿均質(zhì)機有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 負載二氫槲皮素甘油解豬油微乳液的制備

稱取一定量甘油解豬油于燒杯內(nèi)，按質(zhì)量比 1∶1加入吐溫-80混勻后，再以質(zhì)量比6∶4加入丙三醇，用磁力攪拌器進行攪拌同時將溫度調(diào)至60℃，逐滴加入一定濃度的二氫槲皮素溶液，并用高速勻漿機以10 000 r/min的速度分散3 min，用高壓均質(zhì)機(100 MPa)均質(zhì)，得到負載二氫槲皮素的甘油解豬油微乳液。按上述方法制備二氫槲皮素負載量分別為20、40、60、80、100 μg/mL的微乳液。

1.2.2 甘油解豬油微乳液體外抗氧化性測定

1.2.2.1 還原力的測定

分別將1.0 mL不同二氫槲皮素負載量的微乳液與2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)和2.5 mL 1%鐵氰化鉀混合，50℃保溫20 min，快速冷卻，然后加入2.5 mL質(zhì)量濃度為100 g/L的三氯乙酸溶液(TCA)，充分混勻，于3 000 r/min下離心10 min，取上清液5 mL，加入5 mL蒸餾水和1 mL 0.1%的氯化鐵溶液，充分混勻后放置10 min，于700 nm處測定吸光度[12]。以吸光度的高低反映樣品還原力的強弱[13]。

1.2.2.2 對DPPH自由基清除能力的測定

分別將2.0 mL不同二氫槲皮素負載量的微乳液與2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH無水乙醇溶液混合后暗處放置30 min，用無水乙醇做參比，測定反應(yīng)體系在517 nm處的吸光度(Ai)；同時測定2 mL DPPH溶液與2 mL無水乙醇的混合液的吸光度(Ac)及2 mL試樣液與2 mL無水乙醇混合液的吸光度(Ak)，按下式計算DPPH自由基清除率(x)[14]。

x=[1-(Ai-Ak)/Ac]×100%

(1)

1.2.2.3 對ABTS自由基清除能力的測定

將7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，室溫避光存放12～16 h，用pH 4.5的乙酸鈉溶液(20 mmol/L)稀釋至在波長734 nm處的吸光度為0.70±0.02，得工作液。取3 mL工作液與20 μL不同二氫槲皮素負載量的微乳液混合，放置6 min，于734 nm處測定吸光度(As)，用乙酸鈉溶液替代樣品，于734 nm處測定吸光度(Ac)，按下式計算ABTS自由基清除率(Y)[15]。

(2)

1.2.2.4 對羥自由基清除能力的測定

分別取2 mL不同二氫槲皮素負載量的微乳液，加入0.5 mL 6 mmol/L FeSO4、2 mL 1.5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，再加入0.5 mL 0.1%的H2O2溶液，于37℃下反應(yīng)15 min后在510 nm下測各反應(yīng)體系中的吸光度(AX)；以蒸餾水代替雙氧水測定吸光度(AX0)及以蒸餾水代替試樣液測定吸光度(A0)，按下式計算羥自由基清除率(Y1)[16]。

Y1=[1-(AX-AX0)/A0]×100%

(3)

1.2.3 甘油解豬油微乳液體外模擬消化

體外模擬消化參照Diao等[17]的方法，并作如下修改：

模擬胃消化：將2 g NaCl溶入7 mL 1 mol/L的鹽酸中，用去離子水定容至1 000 mL，再用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.0得模擬胃液。將20 mL二氫槲皮素負載量為100 μg/mL的微乳液樣品與等體積的模擬胃液混合后，加入胃蛋白酶，使其終質(zhì)量濃度為3.2 mg/mL，隨后置于37℃水浴中電動攪拌(150 r/min)反應(yīng)2 h，然后迅速于沸水浴中滅酶15 min，終止胃消化。

模擬腸消化：將胃消化液用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，加入等體積的模擬腸液(10 mmol/L CaCl2、10 mg/mL豬膽鹽和3.2 mg/mL胰脂酶溶于磷酸鹽緩沖液中，調(diào)節(jié)pH至7.5)，混合均勻后，置于37℃水浴中消化2 h。消化過程中，不斷滴加NaOH以維持混合液的pH為7.5。

消化結(jié)束后，取20 mL消化液，以10 000 r/min離心45 min，收集中間的膠束相。

1.2.4 游離脂肪酸釋放率的測定

利用pH-stat全自動電位滴定儀測定體外模擬腸消化過程中維持體系pH為7.5所消耗的NaOH的量，計算游離脂肪酸的釋放率(x)，計算公式如下。

(4)

式中：C0為NaOH 的濃度，0.01 mol/L；Vt為tmin 消耗0.01 mol/L NaOH溶液的總量，mL；M為甘油解豬油的平均摩爾質(zhì)量，g/mol；m為加入甘油解豬油的質(zhì)量，g。

1.2.5 二氫槲皮素保留率的測定

準(zhǔn)確稱取50 mg干燥至恒重的二氫槲皮素對照品溶于乙醇中，制備成0.5 mg/mL的對照品儲備液。分別移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL儲備液于25 mL容量瓶中，加入乙醇溶液，使總體積達到3 mL，再用水定容，在288 nm處測定其吸光度。以吸光度(y)對二氫槲皮素質(zhì)量濃度(x,mg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=2.952 6x+2.134 9。

分別取胃、腸消化結(jié)束后的消化液1 mL于25 mL容量瓶中，加入乙醇使總體積為3 mL，再用水定容，于288 nm處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算二氫槲皮素的含量，以消化液中二氫槲皮素的含量占消化液中二氫槲皮素初始含量的比例計算二氫槲皮素的保留率[18]。

1.2.6 二氫槲皮素生物利用率的計算

取1.2.3中膠束相，按1.2.5方法測定二氫槲皮素含量，按式(5)計算二氫槲皮素的生物利用率(x)。

x=C1/C0×100%

(5)

式中：C1為膠束中二氫槲皮素的含量；C0為消化液中二氫槲皮素的初始含量。

1.2.7 統(tǒng)計分析

每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果用“均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。采用Statistix 8.1軟件進行數(shù)據(jù)之間的差異顯著性(P<0.05)分析，采用Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 負載二氫槲皮素的甘油解豬油微乳液的體外抗氧化性能

2.1.1 還原力

不同二氫槲皮素負載量的微乳液還原力見圖1。

圖1 不同二氫槲皮素負載量的微乳液還原力

從圖1可看出，隨著二氫槲皮素負載量的增加，微乳液還原力呈上升趨勢，說明微乳液包埋的二氫槲皮素能將Fe3+還原為Fe2+，起到抗氧化作用。

2.1.2 對DPPH自由基的清除能力

不同二氫槲皮素負載量的微乳液DPPH自由基清除能力見圖2。

圖2 不同二氫槲皮素負載量的微乳液DPPH自由基清除能力

從圖2可看出，不同二氫槲皮素負載量的微乳液對DPPH自由基均有一定的清除能力，且隨著二氫槲皮素負載量的增加而增強，說明微乳液包埋的二氫槲皮素對DPPH自由基有一定的清除效果，這可能與二氫槲皮素中的酚羥基數(shù)目有關(guān)[13]。

2.1.3 對ABTS自由基的清除能力

不同二氫槲皮素負載量的微乳液ABTS自由基清除能力見圖3。

圖3 不同二氫槲皮素負載量的微乳液ABTS自由基清除能力

從圖3可看出，微乳液對ABTS自由基的清除能力與對DPPH自由基的清除能力相似，也隨著二氫槲皮素負載量的增加而增強。二氫槲皮素屬酚類化合物，其抗氧化性除了與取代基的供電子效應(yīng)有關(guān)外，還與酚羥基周圍空間位阻有關(guān)[19]。

2.1.4 對羥自由基的清除能力

羥自由基是一種活性氧，在體內(nèi)能殺死紅細胞，破壞細胞膜，使DNA和多糖化合物發(fā)生降解，攝入羥自由基清除劑能顯著降低羥自由基在體內(nèi)的危害。不同二氫槲皮素負載量的微乳液羥自由基清除能力見圖4。

圖4 不同二氫槲皮素負載量的微乳液羥自由基清除能力

從圖4可看出，當(dāng)二氫槲皮素負載量為20 μg/mL時，羥自由基清除率為12.1%，隨著二氫槲皮素負載量增至100 μg/mL時，羥自由基清除率增至72.8%，說明微乳液中加入的二氫槲皮素具有一定的清除羥自由基的能力。

2.1.5 相關(guān)性分析

將微乳液中二氫槲皮素的負載量與微乳液抗氧化能力進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表1。從表1可看出，微乳液表現(xiàn)出的抗氧化能力與二氫槲皮素負載量呈極顯著正相關(guān)。劉慧敏[20]報道植物油中的多酚含量與氧自由基吸收能力、ABTS自由基清除能力均呈顯著正相關(guān)，向卓亞等[21]也提出在藜麥體外模擬消化過程中總黃酮含量與其抗氧化活性呈正相關(guān)，這些均說明本研究的二氫槲皮素的酚羥基能夠猝滅自由基，終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，且負載量越多其抗氧化效果越好。

表1 二氫槲皮素負載量與微乳液抗氧化能力相關(guān)性分析

2.2 負載二氫槲皮素的甘油解豬油微乳液的消化性能

2.2.1 消化過程中游離脂肪酸釋放率(見圖5)

圖5 微乳液消化過程中游離脂肪酸的釋放率

從圖5可看出，微乳液的游離脂肪酸釋放率呈先快速增加后緩慢提高的趨勢，微乳液在胃部消化時表層被酶解，當(dāng)微乳液從胃液轉(zhuǎn)移至腸液時，一方面快速分散，另一方面由于微乳液粒徑小，比表面積大，與腸液中脂肪酶接觸面增大，利于油相水解，因此消化前期表現(xiàn)出更大的游離脂肪酸釋放率增長率。消化2 h，消化基本完全，達到最大的游離脂肪酸釋率(73.85%)。

2.2.2 消化后二氫槲皮素的保留率(見圖6)

注：相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

從圖6可以看出，胃部消化2 h后二氫槲皮素的保留率為79.25%，絕大部分的二氫槲皮素仍保留在微乳液中，說明該微乳液能有效保護二氫槲皮素實現(xiàn)靶向性腸道輸送，并在模擬腸道消化過程中被釋放，這可能是因為胰脂酶水解了微乳液的油層，但二氫槲皮素并沒有發(fā)生降解，因此其腸道消化后的保留率與胃部消化后的保留率差異不顯著(P>0.05)。Flores等[22]在對乳清蛋白為壁材包埋酚類物質(zhì)的微膠囊體外消化的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。Ydjedd等[23]研究表明，在腸道消化過程中最高劑量的酚類物質(zhì)和類黃酮物質(zhì)從微膠囊中釋放出來，這一結(jié)果與本研究的一致。

2.2.3 消化后二氫槲皮素的生物利用率

模擬胃腸消化后，胃液消化過程中較低的pH降低了分子間的作用力，促進了二氫槲皮素的釋放并在腸消化2 h后基本結(jié)束[24]，并且在脂質(zhì)消化過程中產(chǎn)生的游離脂肪酸可以形成膠束，二氫槲皮素可能主要通過這些脂肪酸膠束的增溶進而被機體吸收利用，可作為營養(yǎng)物遞送系統(tǒng)。按1.2.6方法計算得到二氫槲皮素的生物利用率為33.3%。說明經(jīng)消化后二氫槲皮素具有較高的生物利用率。

3 結(jié) 論

通過還原力以及DPPH、ABTS和羥自由基清除能力的測定,分析了負載二氫槲皮素的甘油解豬油微乳液的體外抗氧化能力，結(jié)果顯示，負載二氫槲皮素微乳液的還原力及對DPPH、ABTS和羥自由基的清除能力均隨著二氫槲皮素負載量的增加而升高，且相關(guān)性顯著，說明該微乳液具有較好的抗氧化活性。在體外模擬消化過程中，胃液能有效保護二氫槲皮素，實現(xiàn)靶向性腸道輸送，且隨著消化時間的延長，該微乳液具有較高的游離脂肪酸釋放率和二氫槲皮素生物利用率，因此甘油解豬油作為載體負載二氫槲皮素可以得到具有較高抗氧化能力的微乳液體系，且具有一定的生物利用率。負載二氫槲皮素的甘油解豬油微乳液在食品工業(yè)中有較大的應(yīng)用潛力。