陳星宇，盧創(chuàng)宏，吳曉丹，曾志羽△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，南寧 530021；2.廣西心腦血管疾病防治精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；3.廣西心腦血管疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，南寧 530021）

風(fēng)濕性心臟?。╮heumatic heart disease，RHD）是指由于風(fēng)濕熱活動(dòng)，累及心臟瓣膜而造成的心臟病變，在低、中等收入國家及高收入國家貧困地區(qū)人群中高度流行[1]。目前我國仍有250 萬RHD 患者[2]。風(fēng)濕熱患者咽喉部被A 組鏈球菌反復(fù)感染，或者某些易感人群因皮膚鏈球菌感染從而導(dǎo)致機(jī)體異常免疫反應(yīng)[3]，50%～75%的患者會(huì)進(jìn)展為RHD[4-5]，出現(xiàn)心律失常、心力衰竭等并發(fā)癥及永久性心臟瓣膜損傷[6-7]。自身免疫性和炎癥在瓣膜損傷中起著重要作用，但其分子機(jī)制尚未完全清楚[8]。對(duì)于晚期RHD患者，經(jīng)皮或手術(shù)換瓣后可明顯改善預(yù)后，然而在疾病流行率最高的欠發(fā)達(dá)地區(qū)，換瓣手術(shù)受到了技術(shù)水平和社會(huì)經(jīng)濟(jì)條件的雙重限制。

隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，高通量測(cè)序（nextgeneration sequencing，NGS）技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于各種疾病中，有助于深入了解疾病發(fā)生的分子機(jī)制及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。非RHD瓣膜病瓣膜標(biāo)本較難收集，且目前沒有關(guān)于RHD瓣膜轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序研究，僅有對(duì)RHD血清進(jìn)行測(cè)序的基因組研究[9]。因此，本課題組通過NGS 對(duì)8 例RHD 患者的瓣膜組織和非RHD 患者的瓣膜組織進(jìn)行mRNA 測(cè)序，探索RHD瓣膜損傷的分子機(jī)制，為RHD患者瓣膜病變的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至2021年12月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行二尖瓣置換術(shù)（mitral valve replacement，MVR）患者的瓣膜組織，其中RHD 患者（RHD 組）23 例，非RHD 患者（Con 組）10例。兩組性別、年齡、體重指數(shù)、血糖及心功能指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），具有可比性。RHD 組納入標(biāo)準(zhǔn)：病例資料完整，通過心臟彩色多普勒超聲檢查確定是二尖瓣狹窄為主，結(jié)合臨床表現(xiàn)和術(shù)后病理檢查，確診為RHD。Con組納入標(biāo)準(zhǔn)：因其他原因?qū)е滦柽M(jìn)行MVR 手術(shù)的患者。兩組均排除年齡＜18歲，或合并感染性心內(nèi)膜炎、自身免疫性疾病、腫瘤、心肌病、高血壓、糖尿病等患者。本研究已取得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者及其家屬均已簽署知情同意書。

1.2 基因測(cè)序 用Illumina HiSeq 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)。使用StringTie軟件計(jì)算并檢測(cè)兩組樣本的差異mRNA 表達(dá)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。再用DEseq2 軟件分析兩組間差異基因表達(dá)，對(duì)差異基因進(jìn)行基因功能（GO）分析和京都基因與基因百科全書（KEGG）富集分析，并通過蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）篩選出關(guān)鍵基因。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）驗(yàn)證關(guān)鍵基因表達(dá) 取兩組瓣膜組織，提取組織RNA，使用Nanodrop 2000 檢測(cè)RNA 濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR 擴(kuò)增。RT-qPCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火、延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列（5’～3’）

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，偏態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25～P75）]表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異基因表達(dá) 兩組間共有4 498個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)2 315 個(gè)，下調(diào)2 183 個(gè)。顯著差異表達(dá)530個(gè)（表2），設(shè)置P＜0.05且｜log2Fold Change|＞1.5，繪制火山圖（圖1）。

圖1 差異基因火山圖

表2 兩組瓣膜組織的差異mRNA表達(dá)

2.2 聚類分析 通過繪制熱圖（圖2）顯示兩組間差異mRNA的相關(guān)性，顏色深淺表示基因表達(dá)量的高低。兩組間顯著差異的mRNA在本組基本聚集，表明差異mRNA 表達(dá)趨勢(shì)在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 兩組瓣膜組織中顯著差異基因的分層聚類熱圖

2.3 GO功能富集分析結(jié)果 主要富集的生物學(xué)過程（BP）為細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和結(jié)構(gòu)的組裝和分解，主要的細(xì)胞成分（CC）為細(xì)胞外基質(zhì)，顯著的分子功能（MF）為鈣黏著蛋白結(jié)合和肌動(dòng)蛋白結(jié)合，見圖3。

圖3 GO功能富集分析結(jié)果

2.4 KEGG分析 通過對(duì)530個(gè)顯著差異基因進(jìn)行KEGG富集分析并繪制氣泡圖，結(jié)果顯示：差異基因主要富集于細(xì)胞基質(zhì)黏著、白細(xì)胞跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移、ECM 受體相互作用等信號(hào)通路中，見圖4。

圖4 KEGG富集氣泡圖

2.5 PPI 分析結(jié)果 將530 個(gè)顯著差異基因使用String 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得到PPI 圖（圖5），然后將PPI導(dǎo)入Cytoscape得到差異基因節(jié)點(diǎn)排序（圖6）。結(jié)合以往的研究和文獻(xiàn)，本組篩選了3 個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。

圖5 基于顯著差異基因的PPI圖

圖6 PPI圖中關(guān)鍵基因節(jié)點(diǎn)數(shù)量的排序

2.6 RT-qCR驗(yàn)證結(jié)果 與Con組比較，F(xiàn)N1、CD44、VCAM-1在RHD組瓣膜組織中的表達(dá)均上調(diào)，見表3。

表3 兩組FN1、CD44、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

本研究通過NGS 在RHD 患者與非RHD 患者中共篩選出530個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中上調(diào)326個(gè)，下調(diào)204個(gè)；通過KEGG分析得出其主要富集在細(xì)胞基質(zhì)黏著、白細(xì)胞跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移、ECM 受體相互作用等信號(hào)通路中，并且篩選出FN1、CD44、VCAM-13個(gè)關(guān)鍵基因，經(jīng)RT-qPCR驗(yàn)證為RHD瓣膜病變相關(guān)基因。

研究表明，心臟ECM 重構(gòu)與心肌纖維化有關(guān)，ECM 也是治療心肌病變的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[10]。且ECM受體相互作用在心臟重塑中起著重要的作用，ECM 蛋白的積累可導(dǎo)致心臟功能惡化[11]。本研究通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)，ECM 受體相互作用信號(hào)通路在RHD中被大量富集。纖連蛋白（FN）是存在于動(dòng)物細(xì)胞表面的細(xì)胞外大分子膜蛋白，是ECM和基底膜中的主要非膠原糖蛋白[12]。FN1 作為一種多功能ECM 蛋白分子，在細(xì)胞黏附中發(fā)揮重要的作用，也是ECM 受體相互作用和細(xì)胞基質(zhì)黏著通路的主要信號(hào)分子，參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程，并在纖維化疾病中發(fā)揮作用[13]。有研究顯示，纖維化蛋白FN1表達(dá)上調(diào)可加重腎臟纖維化，靶向調(diào)控FN1表達(dá)能減輕膀胱纖維化[14-15]。在RHD患者瓣膜中，ECM的大量沉積及FN1 的高表達(dá)與瓣膜纖維化高度相關(guān)。因此，ECM 及其相關(guān)通路在RHD 病變中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，RHD患者瓣膜組織中FN1表達(dá)上調(diào)。

此外，CD44 也是一種廣泛表達(dá)的ECM 成分主要受體，在炎癥和血管損傷中起著重要作用[16]。心肌炎癥損傷時(shí)實(shí)質(zhì)細(xì)胞和造血細(xì)胞CD44 表達(dá)上調(diào)。在哮喘和動(dòng)脈粥樣硬化中，CD44 被證明在炎癥部位調(diào)節(jié)白細(xì)胞，包括巨噬菌體、T細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞[17]。CD44受體是透明質(zhì)酸（HA），HA受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，包括炎性細(xì)胞因子[18]。研究表明，HA 分解代謝通過CD44、HYAL-1 和HYAL-2 介導(dǎo)酶。炎癥部位的LMWHA 片段介導(dǎo)炎癥效應(yīng)并刺激心臟成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞增殖，通過與CD44相互作用導(dǎo)致組織纖維化[19]。CD44與HA之間的相互作用會(huì)觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)瓣膜纖維化，也會(huì)導(dǎo)致心臟重構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)，CD44在RHD患者瓣膜組織中的表達(dá)上調(diào)。

VCAM-1是一種90 kDa的糖蛋白，主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞[20]，在白細(xì)胞跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移通路中有著重要作用。白細(xì)胞上表達(dá)的A4P1整合素黏附在內(nèi)皮細(xì)胞表面VCAM-1 上，激活內(nèi)皮細(xì)胞的信號(hào)通路，從而導(dǎo)致白細(xì)胞的跨內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移[21]。研究顯示，在RHD 患者血清中VCAM-1 水平升高[22]。本研究RHD 患者瓣膜組織VCAM-1表達(dá)上調(diào)。表明內(nèi)皮細(xì)胞被激活，進(jìn)而使其更容易被免疫系統(tǒng)攻擊，從而導(dǎo)致瓣膜持續(xù)免疫反應(yīng)，引起組織損傷。

綜上所述，F(xiàn)N1、CD44、VCAM-1基因在RHD瓣膜病變中的表達(dá)上調(diào)，可能在ECM受體相互作用和白細(xì)胞跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移等信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。