闕 婷，藍(lán) 利,2，張瀟劍，袁江浪，孔星星，樊曉暉，張增峰，唐 深,2△，羅小玲△

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2.廣西高?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)研究重點實驗室，南寧 530021）

甲型流感病毒（IAV）屬正黏病毒科，是一種能在呼吸道黏膜上皮細(xì)胞中增殖，并引起呼吸道感染的單股負(fù)鏈RNA病毒[1]。由于病毒基因組具有較高的變異率，導(dǎo)致遺傳抗原漂移和基因重組，使病毒復(fù)制能力和宿主致病性及范圍均發(fā)生改變，從而實現(xiàn)跨種屬感染和傳播[2-3]。有報道稱，在人類和動物模型中，流感病毒感染宿主導(dǎo)致不良臨床結(jié)局通常與促炎細(xì)胞因子和趨化因子升高有關(guān)，輕者僅表現(xiàn)亞臨床的上呼吸道感染，重者可為致命的下呼吸道感染，并進(jìn)展為呼吸道窘迫綜合征（ARDS）等多器官衰竭，甚至死亡[4]。

巨噬細(xì)胞是感染免疫機制研究中重要的細(xì)胞類型[5]。體外人源誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞主要包括2 個來源，即外周血單個核細(xì)胞（PBMC）和人髓系急性白血病單核細(xì)胞（THP-1）。選用人PBMC原代巨噬細(xì)胞作為體外模型構(gòu)建，更能接近人生理狀態(tài)，但是其數(shù)量難以滿足實驗需求。目前，病原學(xué)檢測是IAV 的篩查、確認(rèn)的重要檢測手段。由于病原分離培養(yǎng)的條件和技術(shù)水平高、周期長，病毒量的收獲易受環(huán)境和樣本質(zhì)量的影響，不利于在常規(guī)實驗室開展[6]。因此，本研究擬建立實時熒光PCR（RT-qPCR）絕對定量法準(zhǔn)確、快速檢測IAV 拷貝數(shù)，以THP-1 體外誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞（Mφ），初步研究IAV 感染Mφ 后的細(xì)胞活性和病毒復(fù)制水平，為后續(xù)研究IAV與宿主固有免疫的相互作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和病毒株

急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫）。禽源H9N2 流感病毒Qa/GX/3139/2012（H9N2）（簡稱GX3139）為低致病禽流感病毒株，由廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室張增峰教授課題組饋贈。本研究的病毒感染細(xì)胞實驗均在廣西醫(yī)科大學(xué)微生物二級生物安全實驗室內(nèi)完成。

1.2 主要試劑

病毒基因組RNA 提取試劑盒、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑（日本TaKaRa）、TRIzol（北京天根）；PUC57 質(zhì)粒（武漢金開瑞）；SYBR?Green Master（美國Roche 公司）；引物由Invitrogen 公司合成；佛波酯（PMA，美國Sigma）；RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Gibco）；青霉素、鏈霉素（索萊寶生物技術(shù)公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞處理與分組 將對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞經(jīng)100 nmol/L PMA 刺激48 h 活化為Mφ，設(shè)Mφ組和加入不同感染復(fù)數(shù)（MOI）病毒液的Mφ 感染組。IAV的MOI分別為0.1、0.5、1、1.5、2、5、10、15和20，共9個感染劑量組。

1.3.2 引物的設(shè)計與合成 以IAV-M基因序列（GenBank No：MW103403.1）為模板，選取26～1 007 bp 保守區(qū)作為擴增目標(biāo)，根據(jù)定量PCR（SYBR Green 法）引物設(shè)計原則，采用Primer 5.0 軟件設(shè)計引物，并在NCBI作BLAST序列比對驗證引物特異性，引物序列：IAV-M基因上游：5’-CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA-3’，下游：5’-GGTGACAGGATTGGTCTTGTCTTTA-3’，擴增產(chǎn)物為155 bp。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒構(gòu)建和稀釋 參考MW103403.1序列由武漢金開瑞生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成基因合成和標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒構(gòu)建，并在本實驗室完成質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、擴增和抽提等。將標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒菌液送深圳華大基因公司做序列鑒定，鑒定結(jié)果完全符合設(shè)計的重組質(zhì)粒序列。抽提質(zhì)粒經(jīng)ND-2000 核酸檢測儀測定DNA的濃度，以拷貝數(shù)（拷貝數(shù)/μL）=阿氏常數(shù)×質(zhì)粒濃度（ng/μL）×10-9/片段大?。╞p）×660 公式計算DNA拷貝數(shù)。確定DNA的拷貝數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)品母液。將標(biāo)準(zhǔn)品母液按10倍倍比連續(xù)稀釋梯度，依次稀釋成108～102copies/μL 范圍，以此配制絕對定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴增標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.4 實時熒光定量PCR（RT-qPCR） 分別使用北京天根Trizol 法提取細(xì)胞內(nèi)病毒RNA 和離心柱方法抽提病毒上清液，分別以500 ng/反應(yīng)和200 ng/反應(yīng)模板量，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用Step One 熒光定量PCR（美國Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行qPCR擴增檢測流感病毒基因拷貝數(shù)。qPCR 反應(yīng)體系：SYBR Green PCR Master Mix（2×）10 μL、上游引物和下游引物各1 μL（10 nmol/L）、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒1 μL（1 ng），ROX 0.4 μL，加雙蒸水至20 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃1 min；95 ℃20 s，56 ℃1 min，共40 個循環(huán)。

1.3.5 CCK-8 法檢測巨噬細(xì)胞活性 將對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞以2×104個/孔密度接種于96孔板，經(jīng)100 nmol/L PMA刺激48h活化為Mφ，加入100 μL不同MOI的IAV病毒液，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，避光孵育3.5 h。用全自動酶標(biāo)儀在450 nm波長檢測各孔吸光度（OD）值，計算細(xì)胞存活率，即[（OD實驗孔-OD空白孔）/（OD對照孔-OD空白孔）]×100%，并確定以105～106TCID50 的病毒濃度作為MOI 感染劑量感染Mφ模型。

1.3.6 建立IAV感染巨噬細(xì)胞模型 THP-1細(xì)胞以1×106個/孔接種于6 孔板，PMA 誘導(dǎo)分化為Mφ，根據(jù)CCK-8 活性結(jié)果，選取105～106TCID50 范圍的5個MOI的病毒劑量，作為IAV感染Mφ的體外研究模型，倒置顯微鏡（萊卡公司）觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，感染24 h后收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液。

1.3.7 病毒血凝效價檢測 THP-1細(xì)胞以1×106個/孔接種6孔板，PMA誘導(dǎo)分化為Mφ，參考上述MOI的病毒感染量，感染細(xì)胞24 h后收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液。在96孔U型板內(nèi)做病毒血凝效價檢測，每孔加50 μL 上清或50 μL 細(xì)胞裂解液，各孔加入50 μL 0.6%雞紅細(xì)胞懸液，室溫孵育30 min后，觀察紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，以+～++++判斷25～100%血凝強度，并讀取結(jié)果。結(jié)果判定：以出現(xiàn)完全凝集的最高稀釋度為終點，其稀釋度的倒數(shù)即為病毒的紅細(xì)胞凝集滴度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，相關(guān)性分析采用雙變量Pearson 檢驗，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qPCR方法的建立及驗證

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以8 個10 倍稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒：1.33×108copies/μL、1.33×107copies/μL、1.33×106copies/μL、1.33×105copies/μL、1.33×104copies/μL、1.33×103copies/μL、1.33×102copies/μL、1.33×10 copies/μL（擴增曲線1～8）作為模板進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度為1.33×10 copies/μL，其CT 值與模板質(zhì)粒DNA 拷貝數(shù)的線性關(guān)系不明顯，而檢測下限定義為超過95%概率能夠擴增PCR產(chǎn)物的最低拷貝數(shù)。因此，該方法的靈敏度可達(dá)到1.33×102copies/μL。

熒光定量PCR 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以1.33×108copies/μL、1.33×107copies/μL、1.33×106copies/μL、1.33×105copies/μL、1.33×104copies/μL、1.33×103copies/μL 6 個不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒作為模板進(jìn)行擴增，結(jié)果顯示，擴增曲線各稀釋度線性關(guān)系R2=0.999，斜率為-3.345（-3～-3.5），擴增效率（Eff）為99%（90%～110%），說明擴增曲線各個稀釋度相關(guān)性好，擴增效率達(dá)到要求，該方法能夠準(zhǔn)確反映病毒載量。該引物溶解曲線的Tm值集中形成一個單尖峰，未發(fā)現(xiàn)雜峰或雙峰，說明無引物二聚體和非特異擴增，設(shè)計引物符合qPCR要求，見圖1。

圖1 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 重復(fù)性 將6個10 倍稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，分別用上述研究建立的熒光定量PCR 方法重復(fù)檢測3 次。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)差（SD）在0.06%～0.16%，變異系數(shù)（CV）在0.20%～0.82%，均小于1%，表明該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，見表1。

表1 熒光定量PCR重復(fù)性評價n=3

2.2 IAV感染巨噬細(xì)胞體外模型構(gòu)建

2.2.1 CCK-8法檢測24 h IAV感染對巨噬細(xì)胞細(xì)胞活性的影響 與Mφ 組比較，不同MOI 的IAV 病毒液感染Mφ后，細(xì)胞活性下降，且與MOI呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.992，P＜0.05），見圖2。據(jù)此，以MOI=2 和MOI=5組為節(jié)點，細(xì)胞活性在50%～60%，后續(xù)實驗選用5個MOI（0.5、1、2、5、10）感染Mφ模型。

圖2 IAV感染巨噬細(xì)胞24 h后的細(xì)胞活性

2.2.2 倒置顯微鏡觀察IAV感染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 THP-1 經(jīng)PMA 刺激活化為Mφ，細(xì)胞由漂浮透亮的圓形逐漸貼壁，變?yōu)榛疑煌噶令悎A形細(xì)胞，形態(tài)不規(guī)則呈煎蛋樣。當(dāng)加入不同MOI（0.5、1、2、5、10）的IAV 病毒液感染Mφ 24 h 后，Mφ 出現(xiàn)輪廓不清晰，邊緣逐漸模糊，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量顆粒，并且隨MOI 增大，折光性強的懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞病變（CPE）逐漸加重，見圖3。

圖3 IAV感染后巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（×200）

2.2.3 IAV感染巨噬細(xì)胞后病毒復(fù)制情況

RT-qPCR 檢測細(xì)胞RNA 抽提樣本，結(jié)果顯示：與Mφ 組比較，隨著MOI 增大，細(xì)胞內(nèi)病毒M 基因拷貝數(shù)增加，核酸拷貝數(shù)在1.7×105～4.2×106copies/μL范圍，與Mφ感染組呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.869，P＜0.05），Mφ感染組間進(jìn)行比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 IAV感染巨噬細(xì)胞24 h后胞內(nèi)M基因拷貝數(shù)

RT-qPCR檢測培養(yǎng)上清液RNA抽提樣本，結(jié)果顯示：與Mφ組比較，隨著MOI增大，培養(yǎng)上清M基因拷貝數(shù)增加，核酸拷貝數(shù)在7×102～5.5×103copies/μL范圍，與Mφ感染組呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.990，P＜0.05），見圖5。提示在Mφ內(nèi)復(fù)制的IAV釋放到細(xì)胞外，且隨感染病毒量增加，釋放量也增加。

圖5 IAV感染巨噬細(xì)胞24 h后上清M基因拷貝數(shù)

2.3 血凝實驗檢測IAV 感染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清液的HA效價

IAV 表面的HA 可以凝集雞紅細(xì)胞，通?？捎貌《狙龑嶒灆z測雞胚或病毒濃度較高標(biāo)本的HA效價，以評估病毒的生物復(fù)制水平。IAV 感染Mφ 24 h 后，檢測細(xì)胞裂解液和上清液的病毒HA 效價。隨著MOI升高，上清液HA效價呈上升趨勢，效價在1∶32～1∶64 范圍，而細(xì)胞裂解液的HA 效價在1∶64，并未隨MOI增加而增加。HA效價結(jié)果提示，病毒血凝實驗雖然是檢測病毒生物復(fù)制水平的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法檢測敏感度較低，無法區(qū)分0.5～10 MOI 范圍的IAV 感染Mφ 后病毒復(fù)制的變化趨勢，見表2。

表2 不同MOI 感染巨噬細(xì)胞24 h 后細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清的HA效價

3 討論

近年來，RT-qPCR 技術(shù)應(yīng)用于傳染病的疾病監(jiān)測中發(fā)揮重要作用[7]。但目前，商品化試劑盒檢測結(jié)果只有定性參考，未進(jìn)行定量檢測[8]。本課題組實驗室自建的熒光定量PCR 反應(yīng)方法是以絕對定量的病毒拷貝數(shù)為判定標(biāo)準(zhǔn)，使用流感病毒M基因的保守序列設(shè)計特異性引物，構(gòu)建含M基因重組質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示RT-qPCR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-3.345X+38.454，具有良好的線性關(guān)系，檢測下限為102copies/μL，10 倍稀釋梯度在103～108區(qū)分度良好，CV 低于1%，重復(fù)性好，同時檢測結(jié)果為定量結(jié)果，提示該方法敏感性高、重復(fù)性好，可作為一種快速敏感的定量檢測方法。Ni等[9]研究報道，利用絕對定量PCR方法檢測IAV，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)達(dá)到r2=0.991，CT 值與病毒濃度具有良好的相關(guān)性，并且檢測下限102copies/μL，這與本研究結(jié)果相似。

巨噬細(xì)胞是機體天然免疫細(xì)胞，在啟動和控制抗病毒免疫防御中起到核心作用。特別是在流感病毒入侵攻擊宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞的模式識別受體（PRRs）識別病原相關(guān)分子模式（PAMP），激活NF-?B 信號通路和干擾素系統(tǒng)信號，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素、促炎細(xì)胞因子（IL-6、MCP-1）產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗病毒作用[10-11]。另外，有研究報道巨噬細(xì)胞不僅作為流感病毒靶標(biāo)和儲庫[12]，而且在炎癥微環(huán)境條件下具有高可塑性，并極化為不同表型M1/M2[5,13]。為此，本研究通過CCK-8法和RT-qPCR法來初步構(gòu)建流感病毒感染巨噬細(xì)胞體外感染模型。以THP-1細(xì)胞為體外研究模型，通過PMA 刺激活化為Mφ，并加入不同MOI的IAV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Mφ組相比，隨著MOI 升高，Mφ 活性下降；細(xì)胞形態(tài)邊緣逐漸模糊，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量顆粒，導(dǎo)致CPE的改變，并且病變程度與MOI 呈正相關(guān)關(guān)系；以不同MOI 作為Mφ 體外感染模型的劑量，發(fā)現(xiàn)感染細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清液中病毒核酸濃度隨MOI 增大而升高，提示IAV 感染Mφ 后可復(fù)制并釋放出子代病毒，并產(chǎn)生細(xì)胞病變；IAV 感染Mφ 的復(fù)制能力與MOI 呈正相關(guān)關(guān)系，并與細(xì)胞病變程度一致，說明IAV對宿主巨噬細(xì)胞具有易感性，能夠入侵巨噬細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制增殖并釋放病毒顆粒對細(xì)胞造成損傷，并與感染MOI 劑量呈相關(guān)性增長。有研究報道，高致病H5N1 和低致病H7N9 在人類單核細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞中比較，發(fā)現(xiàn)高致病H5N1 具有極強復(fù)制和傳播能力，表明高致病H5N1 病毒具有高毒力的病毒載量，表現(xiàn)多循環(huán)感染，能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行有效復(fù)制[14]。此外，Li 等[15]從數(shù)學(xué)模型評估流感病毒在巨噬細(xì)胞的病毒復(fù)制的動力學(xué)和宿主反應(yīng)的致病性。這與本研究體外感染模型相似。本研究進(jìn)一步采用病毒血凝實驗測定HA 效價，評估IAV 感染Mφ 后細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清的病毒生物合成水平，結(jié)果顯示，隨著MOI 升高，上清液HA 效價呈上升趨勢，效價在1∶32～1∶64，而細(xì)胞裂解液的HA效價在1∶64。HA 效價的結(jié)果不能區(qū)分病毒復(fù)制趨勢，可能是該方法檢測敏感度偏低所致，無法顯示IAV 在Mφ內(nèi)復(fù)制增殖和感染能力。本研究構(gòu)建的IAV 實時熒光絕對定量PCR 檢測法的特異性和靈敏度較好，并和國外研究者報道一致，結(jié)合CPE觀察，能有效檢測和反映IAV在體外感染Mφ后病毒復(fù)制和釋放的動態(tài)變化。

綜上所述，本研究構(gòu)建的IAV 實時熒光絕對定量PCR 法特異性高，靈敏度較好，能有效檢測和評估IAV體外感染巨噬細(xì)胞后病毒復(fù)制的動態(tài)變化情況，為后續(xù)深入研究流感病毒感染巨噬細(xì)胞的分子機制奠定基礎(chǔ)。