劉慶靜，趙平，郭瑩瑩，鄒積宏*，竇清泉

（1.黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江哈爾濱 150500）（2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江省普通高校微生物重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150080）（3.黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督研究院，黑龍江哈爾濱 150050）

白菜是我國產(chǎn)量大且營養(yǎng)價值豐富的農(nóng)產(chǎn)品之一[1]。隨著人們不斷追求營養(yǎng)價值高而且美味食品的同時，酸菜逐漸受到廣大群眾的歡迎與熱愛。這樣既能延長白菜的貯藏時間，還能使食品更多元。酸菜口感豐富，酸甜脆嫩，能夠激發(fā)食欲、加快消化，促進人體對鐵元素的吸收[2,3]。此外，酸菜不僅保留了蔬菜原有的營養(yǎng)成分如維生素C、氨基酸以及膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)，而且還含有乳酸菌等功能性微生物，酸菜作為營養(yǎng)成分豐富、滋味鮮美的蔬菜，長期食用可抗癌、治療高血壓和便秘、清理腸胃等[4,5]。但傳統(tǒng)自然發(fā)酵的酸菜產(chǎn)品存在不穩(wěn)定、發(fā)酵時間長、亞硝酸鹽含量高等諸多問題，嚴重的制約著酸菜的工業(yè)化發(fā)展[6,7]。

紅茶菌起源于我國秦朝時期，是由醋酸菌、酵母菌、乳酸菌在茶基液培養(yǎng)液中混合發(fā)酵而成，稱為“海寶”、“胃寶”，現(xiàn)多稱“紅茶菌”，西方國家稱其為“康普茶”[8]。因其發(fā)酵后母液中產(chǎn)生如茶多酚、小分子抑菌蛋白、D-葡萄糖二酸-1,4-內(nèi)酯、氨基酸等諸多代謝產(chǎn)物，長期適量食用可起到降血壓、抑菌、預(yù)防肥胖、調(diào)節(jié)腸道菌群等功效[9-12]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)與市場多元化的持續(xù)發(fā)展，目前市場上有關(guān)紅茶菌的產(chǎn)品越來越多，如紅茶菌醋、紅茶菌面包、酒等。因此研究紅茶菌，一方面不僅能增加紅茶菌產(chǎn)品的風(fēng)味和種類，另一方面也增加了茶葉的用途，促進茶產(chǎn)業(yè)與農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展。

基于諸多文獻對紅茶菌及其產(chǎn)品的研究，本實驗在傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜的基礎(chǔ)上采用紅茶菌菌種發(fā)酵，以期在短時間內(nèi)獲得品質(zhì)優(yōu)安全性高且具有紅茶菌風(fēng)味的一款新型酸菜。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 實驗材料

菌種：紅茶菌菌種（俄羅斯純正紅茶菌菌種），購自黑龍江紅茶菌網(wǎng)，后保藏于實驗室；白菜、白砂糖（市售）、茶葉（正山小種）。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

WFZ800-D3B紫外分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；DH-101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市中環(huán)試驗電爐有限公司；2019-B2322型手提式滅菌鍋，上海東亞壓力容器有限公司；HH-B11-360電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市實驗儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅茶菌酸菜發(fā)酵工藝流程

1.2.2 紅茶菌酸菜發(fā)酵單因素試驗

分別固定紅茶菌接種量15%，發(fā)酵時間7 d，將發(fā)酵溫度設(shè)定為15、20、25、30、35 ℃五個梯度、固定紅茶菌接種量15%，發(fā)酵溫度30 ℃，將發(fā)酵時間設(shè)置為為3、5、7、9、11 d五個梯度、固定發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間7 d，將接種量別設(shè)定為5%、10%、15%、20%、25%五個梯度，發(fā)酵結(jié)束后以感官評價為主要指標，總酸含量和亞硝酸鹽含量為輔助指標進行測定，以獲得較優(yōu)的發(fā)酵因素。

1.2.3 紅茶菌酸菜發(fā)酵工藝響應(yīng)面設(shè)計

以單因素試驗中心點設(shè)置L9(34)試驗，根據(jù)Design Expert 11中的BBD程序分析實驗結(jié)果，詳見表1。

表1 紅茶菌酸菜工藝優(yōu)化試驗因素與水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of response surface experiment for fermentation technology optimization of sauerkraut with Konbucha

1.2.4 感官評價定

結(jié)束發(fā)酵后，選10名專業(yè)人士從4個方面進行打分，評分標準見表2。

表2 紅茶菌酸菜感官評價指標Table 2 Sensory evaluation standard for Kombucha sauerkraut

1.2.5 理化指標的測定

亞硝酸鹽含量：參照GB 5009.33-2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[13]。亞硝酸鹽標準曲線見圖1。

如圖1所得到的亞硝酸鹽標準曲線方程為y=0.0507x+0.0017，R2=0.9992，擬合度較高。

總酸含量：參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》[14]。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

單因素試驗數(shù)據(jù)采用直觀分析，以確定各因素對紅茶菌酸菜發(fā)酵影響的參數(shù)區(qū)間。在單因素的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design Expert軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時間對酸菜品質(zhì)的影響

對不同發(fā)酵時間的酸菜品質(zhì)分析見圖2、圖3。

由圖2可知，發(fā)酵時間為7 d時酸菜感官評分33。酸菜整體感官評分隨著發(fā)酵時間延長而增加。但超過7 d后，酸菜的各項感官除香氣外都呈現(xiàn)下降趨勢，這是因為發(fā)酵時間過長，各菌體與白菜相互作用使得白菜逐漸開始變質(zhì)，甚至發(fā)酵時間更久之后，酸菜會出現(xiàn)軟爛的現(xiàn)象。

由圖3可知，從發(fā)酵時間3 d到7 d，總酸含量從0.46 g/100 g升到1.79 g/100 g，上升趨勢較為顯著；但當(dāng)發(fā)酵時間超過7 d后，從圖中可看出總酸處于上升趨勢，過多或過少的酸都會影響酸菜的口感與品質(zhì)；亞硝酸鹽含量第7天時為0.96 mg/kg，在第7天后下降緩慢并趨于平緩，由于發(fā)酵時間區(qū)間內(nèi)亞硝酸含量均低于國標中所規(guī)定，這與李杰等[15]在利用面湯水發(fā)酵酸菜時的研究一致，故綜合圖2、3選擇發(fā)酵時間7 d為響應(yīng)面試驗點。

2.1.2 不同發(fā)酵溫度對酸菜品質(zhì)的影響

對不同發(fā)酵溫度的酸菜品質(zhì)分析見圖4、5。

由圖4可知當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時，紅茶菌酸菜感官評價為33分，發(fā)酵溫度過高或者過低都會降低酸菜的感官品質(zhì)。這是因為在發(fā)酵過程中若溫度過低，其中菌種未達到最佳生長溫度，從而影響酸菜的感官品質(zhì)；當(dāng)溫度高于30 ℃時，除了紅茶菌酸菜的香氣略高，其余幾項指標均呈現(xiàn)下降的趨勢，這是因為較高的溫度致使菌種在短時間內(nèi)相互作用快速產(chǎn)生代謝產(chǎn)物加快酸菜的發(fā)酵，如若代謝產(chǎn)物過多則導(dǎo)致其滋味發(fā)生刺鼻味，色澤呈暗黃色，質(zhì)地過軟等情況。

由圖5可知總酸含量從15 ℃的0.40 g/100 g上升到了30 ℃的1.85 g/100 g，但在30 ℃后有下降趨勢但不明顯；亞硝酸鹽含量從15 ℃的1.67 mg/kg降到了35 ℃的0.79 mg/kg，但30 ℃后下降不顯著，雖35 ℃時最低，但30 ℃時已遠遠低于國標規(guī)定，說明在較高的溫度下，紅茶菌中有益菌繁殖加快，抑制硝酸還原菌的生長繁殖，從而減少硼酸鹽的還原，且已生成的亞硝酸鹽在酸性環(huán)境下部分分解。這與丁健等[16]在響應(yīng)面法優(yōu)化水芹菜自然發(fā)酵酸菜結(jié)果分析一致。以圖4為主要考察指標綜合考慮選擇發(fā)酵溫度為30 ℃作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗點。

2.1.3 不同菌種量對酸菜品質(zhì)的影響

對不同接種量的酸菜品質(zhì)分析見圖6、7。

從圖6可知，接種量在5%～15%時感官評分逐漸升高，15%時到高達35分，但當(dāng)接種量超過15%后，除香氣外其余幾項指標呈現(xiàn)逐漸下降，這是由于隨著接種量的增加酸菜的香氣也會越發(fā)濃郁，并可保留較長時間，但當(dāng)菌種量增多時，其生長繁殖需要更多的營養(yǎng)成分，而發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分有限，不能供給過多菌種的生長，從而影響菌種間的生長繁殖，而接種量過少時發(fā)酵速率緩慢，更易于受到有害菌的污染，影響產(chǎn)品的品質(zhì)，使得感官評分總體降低。

由圖7可知酸菜總酸含量從接種量5%的0.42 mg/kg升到15%的1.93 mg/kg，但在15%后持續(xù)上升使酸菜產(chǎn)生刺鼻的酸味從而影響口感和對人的第一感受，而此時亞硝酸含量為0.95 mg/kg，也符合規(guī)定，雖15%后逐漸緩慢降低，這與奉毅等[17]在紅茶菌菌液對亞硝酸鹽降解及NO的生成的影響一文中發(fā)現(xiàn)紅茶菌可一定量的降解亞硝酸鹽一致。綜合兩圖選擇以15%接種量為響應(yīng)面優(yōu)化試驗點。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

表3為試驗結(jié)果，使用軟件Design Expert 11.0得到的回歸模型方程如下：

表3 Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design arrangement and results

2.2.2 模型方差分析

表4、5分別為總酸含量回歸模型方差分析、感官評分回歸模型方差分析。

表4 總酸含量回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the fifi tted quadratic polynomial model with the total acid content

由表4和表5可知，兩個模型具有極高的顯著性（p<0.01），變量對于響應(yīng)值的影響都表現(xiàn)為顯著或失擬項結(jié)果為不顯著（p>0.05），說明兩種模型為差異極顯著，設(shè)計模型有良好擬合性。兩個模型的相關(guān)系數(shù)分別為 R2=0.9868，Radj2=0.9698，R2=0.9789，Radj2=0.9518，說明兩個模型的回歸擬合度較好，更接近實際試驗，所以可使用該模型對于紅茶菌酸菜的發(fā)酵工藝參數(shù)進行分析預(yù)測。

表5 感官評分回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the fifi tted quadratic polynomial model with the sensory score

2.2.3 響應(yīng)面圖形分析（總酸）

圖8～圖10表明都有一定的交互作用，圖8中沿A軸等高線相對密集一些，這說明對紅茶菌酸菜總酸含量的影響紅茶菌接種量比發(fā)酵溫度大一些。圖9可知對酸菜總酸含量的影響接種量比發(fā)酵時間更大。圖10中沿A軸的等高線相對較密集，說明發(fā)酵溫度影響比發(fā)酵時間大一些。綜合三組圖分析可知影響紅茶菌酸菜總酸含量的因素強弱順序依次為A>B>C。

2.2.4 響應(yīng)面圖形分析（感官評價）

圖11表明接種量和發(fā)酵溫度對其感官品質(zhì)的影響交互作用不顯著。圖12表明接種量和發(fā)酵溫度對紅茶菌酸菜感官品質(zhì)交互作用顯著，A軸的等高線較C軸密集，表明菌種接種量對感官品質(zhì)的影響大于發(fā)酵時間。圖13中的等高線圖可知發(fā)酵溫度對感官品質(zhì)的影響大于發(fā)酵時間。綜合三組圖分析可知影響紅茶菌酸菜感官品質(zhì)的因素強弱順序依次為A>B>C。

2.3 確定最優(yōu)條件及驗證試驗

根據(jù)模型可得出最優(yōu)生產(chǎn)工藝為：接種量16.036%，發(fā)酵溫度為29.791 ℃，發(fā)酵時間為7.143 d。便于實際生產(chǎn)，將工藝條件調(diào)整為：紅茶菌接種量16%，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時間為7 d。以此工藝為條件進行三次平行實驗得到的紅茶菌酸菜感官評分為35分，總酸含量為1.87 g/100 g，產(chǎn)品中檢出亞硝酸鹽含量為0.84 mg/kg，遠低于食品安全國家標準中對腌漬蔬菜中亞硝酸鹽含量的限定。因此，利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的紅茶菌酸菜生產(chǎn)工藝參數(shù)準確可靠，具有使用價值。

2.4 討論

近年來利用紅茶菌發(fā)酵的食品除了酸菜泡菜外，還有不同口味與功效的飲料、酸奶、面包、奶茶等[18-22]。本文研究的紅茶菌酸菜是目前新開發(fā)的一種新型酸菜，可有效的利用紅茶菌，并開拓了其多元化利用的新局面，增加市場占有率，還可增加酸菜的保健功能，豐富了酸菜市場[22]。本研究以低亞硝酸鹽含量為出發(fā)點，通過響應(yīng)面法優(yōu)化并確定了紅茶菌酸菜發(fā)酵的工藝參數(shù)。試驗結(jié)果表明，采用合適的菌種添加量和發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時間，對發(fā)酵過程中產(chǎn)生亞硝酸鹽有一定的抑制作用，并且可獲得質(zhì)量優(yōu)、周期短、安全性能高的產(chǎn)品。這與陸春霞等[23]、崔松林[24]的研究結(jié)果相似。趙國忠等[25]對不同地區(qū)的24個酸菜樣品進行感官分析與亞硝酸含量測定，發(fā)現(xiàn)感官得分較高的酸菜發(fā)酵過程中有益菌含量高，產(chǎn)酸量大，進而腐敗菌生長較少，亞硝酸鹽含量低。在響應(yīng)面優(yōu)化工藝條件下摸索出最優(yōu)的工藝參數(shù)，為實際生產(chǎn)提供了可供參考的依據(jù)。

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗和響應(yīng)面分析法確立了一種紅茶菌酸菜的發(fā)酵工藝，結(jié)果表明：

（1）經(jīng)響應(yīng)面分析，紅茶菌酸菜的最佳發(fā)酵工藝為：接種量16.036%，發(fā)酵溫度為29.791 ℃，發(fā)酵時間為7.143 d。便于實際生產(chǎn)，將工藝條件調(diào)整為：紅茶菌接種量16%，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時間為7 d。此工藝條件得到的紅茶菌酸菜感官評分為35分，總酸含量為1.87 g/100 g，產(chǎn)品中檢出亞硝酸鹽含量為0.84 mg/kg，遠低于食品安全國家標準中對腌漬蔬菜中亞硝酸鹽含量的限定。

（2）通過對紅茶菌酸菜加工工藝優(yōu)化，結(jié)合紅茶菌與白菜功效形成一款安全性高的特色風(fēng)味酸菜，在提高白菜利用率與其農(nóng)業(yè)附加值的同時也提升了紅茶菌酸菜的品質(zhì)，為酸菜市場多元化增添姿色。