韓勝強，謝元，李甫，胡燁燁，周靜，胡衛(wèi)成，張跡*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052）（2.淮陰師范學院江蘇省高校區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇淮安 223300）（3.中國科學院成都生物研究所，四川成都 610041）

Ⅱ型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是世界上最常見的慢性疾病之一，主要表現(xiàn)為外周組織的高血糖和胰島素抵抗（Insulin resistance，IR），在世界范圍內(nèi)引起很高的患病率和死亡率[1,2]。當胰島素敏感性組織（例如肝臟、脂肪和骨骼肌）由于胰島素信號傳導途徑受損而對胰島素的敏感性降低時，就會發(fā)生IR。最終會導致β細胞的損傷和凋亡，血糖水平持續(xù)升高[3,4]。肥胖是與胰島素抵抗相關的糖尿病的觸發(fā)因素，通過刺激IR加劇T2DM的發(fā)展[5]。肥胖是脂肪組織中脂肪細胞分化積聚大量脂肪的狀態(tài)[6]，會加速脂肪組織的老化，而脂肪細胞在維持全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)中占據(jù)重要地位，同時在IR和T2DM中也起重要作用[7,8]。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白將血液中葡萄糖轉(zhuǎn)運到脂肪細胞中，促進脂肪的合成，同時抑制脂肪分解，使游離脂肪酸進入血液，通過血液循環(huán)供其他器官直接利用。當脂肪組織發(fā)生IR時，游離脂肪酸被大量釋放到血液中，引起血脂異常，加劇IR和T2DM。其中，胰島素信號通路受損是脂肪細胞產(chǎn)生IR的主要原因之一[9,10]。因此，建立體外胰島素抵抗模型有助于篩選改善胰島素抵抗的藥物或天然產(chǎn)物。

人參（Panax ginsengC.A. Meyer）是一種多年生的草本植物，具有抗疲勞、延緩衰老以及保護心血管等功效[11]。在現(xiàn)代臨床試驗中證實了人參及提取物能夠降低糖尿病患者的血糖，并改善葡萄糖耐受量[12]。人參的主要活性成分為人參皂苷，研究表明原人參二醇類的Rb1、Rg3、Rc、Rb2和原人參三醇類的Re、Rg1具有增加胰島素敏感性和降糖作用[13]，而且Rb1、Rg3、Rh1對脂肪細胞的影響均有相關研究[14,15]。

人參皂苷F2（Ginsenoside F2，GF2）在人參中含量較少，主要是通過Rb1、Rg3、Rc、Rb2等原人參二醇類皂苷經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化[16]后得到的產(chǎn)物[17]，被證明具有抗氧化[18]、抗炎[19]、抗癌[20]、降脂[21]等生物活性，但其對脂肪細胞葡萄糖攝取和降血糖的作用機制尚不明確。本研究通過3T3-L1脂肪細胞建立胰島素抵抗模型，研究了GF2對糖吸收的影響，并進一步探討GF2通過PI3K/Akt通路改善胰島素抵抗的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

小鼠3T3-L1前脂肪細胞，武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心；GF2（純度>98%），四川成都至純本草生物科技有限公司。

磷酸鹽緩沖液片劑（PBS，pH=7.4），美國Amersco公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青-鏈霉素雙抗混合液，加拿大Gibco公司；羅格列酮（RGZ）、二甲亞砜（DMSO）、Trizol Reagent，美國Sigma-Aldrich公司；3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基-2-四氮唑溴鹽（MTT），德國Biofroxx公司；BCA蛋白定量試劑盒，中國上海愛必信生物科技有限公司；2-(N-(7-硝基苯-2-氧-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脫氧葡萄糖(2-NBDG)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，美國Thermo Fisher Scientific公司；Phospho-Akt抗體（#4060S）、Akt抗體（#9272S）、Phospho-PI3K抗體（#4228S），美國Cell Signaling Technology公司；anti-rabbit IgG抗體（#ab6721）、anti-mouse IgG抗體（#ab6789），美國abcam公司。

1.1.2 主要儀器設備

5414R低溫高速離心機，德國Eppendorf公司；HERACELL 150i CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher公司；IX71倒置顯微鏡，日本Olympus公司；DM6B熒光顯微鏡，瑞士Leica公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市億通電子有限公司；Infinite M200 Pro酶標儀，瑞士Tecan公司；T100 Thermal Cycle PCR儀，美國Bio-Rad公司；CPX connect實時熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分化

3T3-L1前脂肪細胞在37 ℃、5% CO2條件下用DMEM培養(yǎng)基（含有10% FBS和1%青-鏈霉素）培養(yǎng)，細胞融合90%后，用含0.5 μmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、1 μmol/L地塞米松（DEX）和10 μg/mL胰島素的DMEM培養(yǎng)基誘導分化。2 d后，將分化培養(yǎng)基更換為含有10 μg/mL胰島素的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)維持培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)基，持續(xù)4～6 d。

1.2.2 油紅O染色

3T3-L1前脂肪細胞以2×104cells/mL的密度接種于24孔板（500 μL/孔），按照1.2.1方法誘導分化后，3T3-L1細胞用PBS洗滌，并用4%多聚甲醛室溫固定30 min。去除固定液后，加入油紅O染液，置于60 ℃烘箱避光染色15 min，最后水洗2次晾干，于IX71倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 細胞活力的測定

3T3-L1前脂肪細胞以1×104cells/mL的密度接種在96孔板中，過夜培養(yǎng)后吸棄培養(yǎng)基。以添加12.5、25、50、100 μmol/L GF2的DMEM培養(yǎng)基處理細胞，同時設不含GF2為正常組；在37 ℃，5% CO2條件下處理24 h，棄去上清液，每孔加入100 μL用無血清DMEM配制的0.5 mg/mL MTT溶液，孵育4 h后，結(jié)束后每孔加入100 μL MTT終止液，繼續(xù)培養(yǎng)16～20 h，酶標儀在550 nm處測定各孔的吸光值。

1.2.4 胰島素抵抗模型的建立

參照Meng[22]和PARK等[23]的方法，略有改進：將分化成熟的3T3-L1脂肪細胞以1×104cells/mL的密度接種于96孔透明底黑板中（100 μL/孔），在37 ℃，5% CO2條件下孵育，待細胞融合80%左右，將細胞分為對照組和模型組，對照組用DMEM處理，模型組用含有1 μmol/L DEX的DMEM處理，48 h后然后將培養(yǎng)基換成含有100 μmol/L 2-(N-(7-硝基苯-2-氧-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脫氧葡萄糖（2-NBDG）的PBS在37 ℃下處理30 min，結(jié)束后棄上清液，用預冷的PBS漂洗2次，酶標儀在485/535 nm下測定各組細胞的熒光強度。

1.2.5 胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞的糖攝取

按照1.2.4方法處建立胰島素抵抗模型后，實驗分組及給藥：正常組和模型組：DMEM培養(yǎng)基；陽性藥物組：含10 μmol/L羅格列酮（RGZ）的DMEM培養(yǎng)基；藥物組：含25 μmol/L GF2的DMEM培養(yǎng)基、含50 μmol/L GF2的DMEM培養(yǎng)基、含100 μmol/L GF2的DMEM培養(yǎng)基；置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱共同孵育12 h后，棄掉培養(yǎng)基，加入含有100 μmol/L 2-NBDG的PBS在37 ℃下處理30 min，結(jié)束后棄上清液，用預冷的PBS漂洗2次，用酶標儀在485/535 nm下測定各組細胞的熒光強度。

1.2.6 RT-qPCR檢測IRS-1和GLUT-4 mRNA相對表達量

3T3-L1脂肪細胞以5×104cells/mL的密度接種于6孔板中，按照1.2.5方法分組處理后，去除培養(yǎng)液，用預冷的PBS輕輕漂洗一遍后，每孔加入1 mL Trizol裂解液吹打細胞至溶液清亮，收集于1.5 mL離心管中。利用Trizol法提取細胞總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫上的基因序列設計IRS-1和GLUT-4基因上下游引物序列，GAPDH作為內(nèi)參，引物序列見表1。按照FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）試劑盒說明進行RT-qPCR，每組實驗重復3次，最后采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表1 RT-qPCR所用引物序列Table 1 Primers used in RT-qPCR

1.2.7 Western blot檢測PI3K/Akt信號通路相關蛋白

在不同組的脂肪細胞中加入含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，之后將樣品離心（4 ℃，12000 r/min，15 min）并收集上清液。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后用5% BSA或5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后與各種一抗在4 ℃孵育過夜。TTBS洗滌3次后加入二抗，室溫搖床2 h后，加入eECL發(fā)光液反應，曝光后拍照分析。

1.3 統(tǒng)計分析

各組數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用單因素方差分析比較組間差異，以p<0.05以為差異具有統(tǒng)計學意義。使用Sigma Plot 10.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 細胞分化和油紅O染色

脂肪細胞在T2DM中起著重要作用，它既是脂肪組織的主要成分，也是胰島素抵抗的主要部位。前脂肪細胞具有增殖和分化能力，建立的體外胰島素抵抗模型常用于篩選胰島素增敏劑藥物作用的評價和研究以及相應的糖脂代謝作用[24]。3T3-L1前脂肪細胞在形態(tài)上呈典型的紡錘體型，體積小，細胞質(zhì)中沒有脂肪滴（圖2a）。在分化的第10 d，細胞變大變圓，而且細胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪滴，分化成為成熟的脂肪細胞；細胞用油紅O染色，脂滴被染為紅色，形成環(huán)狀（圖2b）。

2.2 GF2對3T3-L1前脂肪細胞活力的影響

采用MTT法檢測了GF2對3T3-L1前脂肪細胞活力的影響。由圖3可知，GF2濃度從12.5到100 μmol/L時，對3T3-L1前脂肪細胞的活力無影響。結(jié)果表明在此濃度范圍內(nèi)GF2對3T3-L1脂肪細胞無顯著毒性。

2.3 胰島素抵抗模型的建立

胰島素抵抗是T2DM的主要因素，其主要特征是對胰島素信號的響應減弱，使目標組織中葡萄糖的攝取或利用降低[25]。多項研究表明，DEX是一種糖皮質(zhì)激素類似物[26]，能抑制IRS-1和GLUT-4的表達[27]，從而抑制脂肪組織、肌肉組織和肝組織對葡萄糖的攝取，進一步導致糖尿病癥狀加重。用DEX誘導48 h建立胰島素抵抗模型，并利用2-NBDG熒光探針檢測細胞的糖攝取，平均熒光強度反映了細胞對葡萄糖的攝取量。由圖4可知，1 μmol/L DEX處理48 h后，DEX誘導的模型組2-NBDG平均熒光強度顯著低于正常組（p<0.05），降低了34.17%，表明細胞對葡萄糖的攝取能力受到抑制，胰島素抵抗模型建立成功。謝潔等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，1 μmol/L DEX作用24 h和48 h均能誘導3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗，同時指出該模型在48 h內(nèi)穩(wěn)定。王麗靜等[29]的研究表明，100 nmol/L和1 μmol/L DEX誘導48 h后不但降低了3T3-L1脂肪細胞基礎狀態(tài)下的糖吸收，還抑制了胰島素刺激下葡萄糖的吸收，產(chǎn)生胰島素抵抗癥狀。

2.4 GF2對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞糖攝取的影響

不同濃度GF2（25、50、100 μmol/L）對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞糖攝取的影響如圖5所示，GF2和羅格列酮（10 μmol/L）處理12 h后，均顯著增加細胞對2-NBDG攝?。╬<0.05）；與模型組相比，陽性對照組的平均熒光強度增加了43.82%（p<0.01）；25、50和100 μmol/L GF2熒光強度分別增加了12.58%、29.07%和34.62%（p<0.05），且GF2濃度越高，2-NBDG熒光強度越強，GF2呈現(xiàn)出劑量依賴性促進細胞對2-NBDG的攝取。

2.5 GF2對葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白表達的影響

不同組織細胞對葡萄糖的吸收主要依賴于GLUTs。在脂肪細胞中，葡萄糖攝取可以由GLUT-4介導[30]。由圖6可知，模型組中GLUT-4 mRNA相對表達量極顯著降低（p<0.01）；50和100 μmol/L GF2可顯著增加GLUT-4 mRNA相對表達（p<0.01），分別高于模型組1.58倍和2.94倍；而25 μmol/L GF2處理12 h對GULT-4 mRNA表達無顯著差異。Meng等[22]從體內(nèi)和體外說明了來自桑葉中的黃酮類化合物可以顯著增加3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型中的GLUT-4表達，并降低游離脂肪酸的表達，從而改善胰島素抵抗模型中的代謝異常。Dwiyati等[31]研究發(fā)現(xiàn)姜黃通過增加GLUT-4表達和下調(diào)PPAR-γ表達改善3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取，從而表現(xiàn)出降糖活性。

2.6 GF2對IRS-1/PI3K/Akt信號通路的影響

GF2促進了GLUT-4 mRNA相對表達量，增加了胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖的吸收。GLUT-4對葡萄糖的攝取可以通過PI3K和AMPK兩種途徑激活[32,33]，同時兩種途徑也可以激活PI3K/Akt信號通路和非典型蛋白激酶途徑。這兩種途徑均可促進細胞對葡萄糖吸收[34]。研究表明人參皂苷Rg1可激活AMPK和PI3K/Akt途徑，并誘導Akt在絲氨酸473位點磷酸化，促進GLUT-4表達，增加3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖的攝取[35]；Rb1激活胰島素信號通路中的Akt蛋白，上調(diào)脂肪組織中GLUT-1和GLUT-4促進葡萄糖的攝取和消耗，改善IR和糖代謝異常[13]；Rg3和Re通過IRS-1/PI3K途徑上調(diào)脂肪細胞中GLUT-4促進細胞對葡萄糖的攝取[14]。Rg1、Rb1、Rg3、Re等作為GF2的前體皂苷[16]，通過不同的作用機制促進脂肪細胞對葡萄糖的攝取，從而改善IR，因此我們推測GF2也具有降糖作用。另外有報道稱在糖尿病患者中IRS-1表達降低[36]，因此，為了進一步研究GF2對葡萄糖攝取的作用機制，檢測了PI3K/Akt信號通路的激活。

圖7a顯示的是GF2對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞IRS-1表達的影響。經(jīng)DEX誘導后，模型組中IRS-1基因表達水平極顯著低于正常組（p<0.01），GF2處理12 h后，增加了IRS-1基因的表達（p<0.05），隨著GF2劑量的增加，IRS-1基因表達分別高于模型0.33倍、1.66倍和2.10倍。IRS-1包含酪氨酸磷酸化位點和絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點，在未被激活的情況下，IRS-1上的絲氨酸處于磷酸化狀態(tài)，而在被胰島素激活后，酪氨酸磷酸化增強[37]。當IRS-1酪氨酸磷酸化后，PI3K和Akt被活化，胰島素信號通路被激活，活化的Akt可促進葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白向膜易位，從而增加對葡萄糖代謝[38]。

圖7b為各組p-PI3K、PI3K、p-Akt和Akt蛋白表達水平，其中RI為各組蛋白灰度與對應β-actin的比值。模型組中，DEX抑制了p-PI3K、p-Akt和Akt的表達（p<0.05）；GF2處理12 h后，增加了胰島素抵抗細胞中PI3K和Akt的磷酸化，同時也促進了Akt的表達（p<0.05）。Akt磷酸化后可進一步誘導GLUT-4易位至質(zhì)膜并促進葡萄糖吸收進入細胞[39]，從而降低高血糖[40]。結(jié)果表明，GF2可增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞中的IRS-1mRNA的表達以及增強PI3K/Akt磷酸化，激活PI3K/Akt信號通路。Jang等[41]研究表明東莨菪堿通過激活PI3K/Akt和AMPK信號通路增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖攝取。

3 結(jié)論

人參皂苷F2通過增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞GLUT-4 mRNA的表達水平，促進細胞對葡萄糖的攝取；同時提高IRS-1 mRNA和Akt的表達水平，并增加PI3K和Akt的磷酸化，激活PI3K/Akt信號通路，改善胰島素抵抗。本研究結(jié)果初步表明人參皂苷F2具有調(diào)節(jié)糖脂代謝作用，為開發(fā)預防糖尿病相關保健產(chǎn)品提供理論支撐。