劉均，李強，譚蓉

（中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，浙江杭州 310016）

斑馬魚（Zebrafish）是一種脊椎模式生物，與人類基因具有高度相似性，同時具有個體小、發(fā)育周期短、實驗周期短、費用低、單次產(chǎn)卵數(shù)較高、實驗用藥量小等顯著優(yōu)勢，已成為生命科學(xué)研究的新寵，并廣泛用于構(gòu)建人類的各種疾病和腫瘤模型，建立藥物篩選和治療的研究平臺。利用斑馬魚構(gòu)建的人類疾病模型，屬于從事在體研究，可以作為連接非脊椎動物（細(xì)胞等）和哺乳動物（大小鼠等）實驗之間的巨大生物學(xué)斷層，完善現(xiàn)有藥物研發(fā)體系。截止目前，以斑馬魚為對象，可以成功構(gòu)建糖尿病[1,2]、高血脂[3,4]、高尿酸癥[5,6]、失眠[7,8]等生物模型，并可以有效開展靶向藥物篩選以及藥物安全與毒理評價研究。在糖尿病斑馬魚模型建立方面，目前主要以斑馬魚成魚為主，如采用腹腔注射四氧嘧啶（Alloxan，ALX）或鏈脲佐菌素[9,10]，或采用ALX與高糖溶液聯(lián)合誘導(dǎo)[11]，再或者采用過度飼喂法[12]建立糖尿病模型。Shin等[11]以斑馬魚成魚為對象，研究不同濃度ALX（1、2、3、4 mg/mL）溶液孵育不同時間（10、20、30 min），以及研究不同濃度葡萄糖（GLU，1%、2%、3%）溶液孵育不同時間（30 min，1、2、3 h）對血糖的影響，最終認(rèn)為先以3 mg/mL ALX溶液誘導(dǎo)30 min，再用1% GLU溶液孵育30 min，最后在水溶液中孵育1 h可以誘導(dǎo)建立斑馬魚高血糖模型。Zang等[12]以4～6月齡斑馬魚成魚為對象，采用過度飼喂法，探討建立2型糖尿病斑馬魚生物模型。研究發(fā)現(xiàn)，相比每天喂食1次，采用過度飼喂法每天喂食6次的魚空腹血糖水平顯著增加，并且經(jīng)腹腔和口服糖耐量試驗結(jié)果表明過度飼喂法下斑馬魚出現(xiàn)糖耐量受損，而且經(jīng)抗糖尿病治療藥物二甲雙弧和格列美脲治療具有降糖效用，表明以此方式可以建立2型糖尿病斑馬魚模型。但是，目前以斑馬魚幼魚為對象，開展糖尿病斑馬魚生物模型構(gòu)建方面的研究報道還較為鮮見。

青錢柳（Cyclocarya paliurus，CP）屬于胡桃科、青錢柳屬植物，同時也屬于古老珍稀樹種，僅存于中國，科學(xué)研究表明CP具有顯著降血糖的功能特性[13-15]。因此，本文以5 dpf（days post fertilization）斑馬魚為對象，采用單糖GLU單獨或與ALX誘導(dǎo)藥物聯(lián)合建立基于正常生理和病理生理的糖代謝異常斑馬魚生物模型，并以此模型為基礎(chǔ)開展CP降糖作用評價，為健康功能飲品開發(fā)提供基礎(chǔ)理論和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐，同時也為高通量斑馬魚降糖藥物篩選及復(fù)方產(chǎn)品開發(fā)提供多方案參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器及試劑

Multiskan SkyHigh酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；GLU檢測試劑盒（GLU氧化酶法），南京建成生物工程研究所；全自動智能型生化（霉菌）培養(yǎng)箱，天津市宏諾儀器有限公司；3K1S離心機(jī)，德國sigma離心機(jī)公司；AL-204精密電子天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；MY-20手持式高速勻漿機(jī)，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

GLU（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）：10 mg/mL溶液制備，稱取1.00 g GLU于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙獠⒍ㄈ葜?00 mL容量瓶中，冷藏備用。

ALX（CAS號：2244-11-3，純度≥98.0%）：144 μg/mL ALX母液制備，稱量0.0144 g ALX于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙獠⒍ㄈ萦?00 mL容量瓶中，冷藏備用。準(zhǔn)確量取0、1.25、2.50、5.00、10.00、12.50、25.00、50.00 mL上述144 μg/mL ALX母液，加蒸餾水定容至50 mL，分別制成0、3.60、7.20、14.40、28.80、36.00、72.00 μg/mL的ALX溶液，用于斑馬魚對ALX藥物耐受性的影響研究。

青錢柳（CP，文成縣泉山中藥材種植有限公司）：50 mg/mL CP（以生藥量計）貯備液制備，稱取5 g CP于燒杯中，在80 ℃恒溫水浴鍋中浸提3次，每次浸提30 min，合并濾液并定容至100 mL制得50 mg/mL CP（以生藥量計）儲備液，保存于4 ℃冷藏備用。準(zhǔn)確量取0、0.025、0.050、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00、2.00、4.00、8.00和10.00 mL上述CP儲備液，加蒸餾水定容至50 mL，分別制成0、25、50、100、200、400、800、1000、2000、4000、8000、10000 μg/mL的CP溶液，用于開展斑馬魚對不同濃度CP溶液耐受性的影響研究。

阿卡波糖（Acarbose，ACA，拜耳醫(yī)藥保健有限公司）：50 mg/mL ACA（以生藥量計）貯備液制備，稱取5 g ACA于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙膺^濾后定容至100 mL制得50 mg/mL ACA（以生藥量計）儲備液，保存于4 ℃冷藏備用。準(zhǔn)確量取0.20、0.40、0.80 mL上述ACA儲備液，加蒸餾水定容至50 mL，分別制成200、400、800 μg/mL的ACA溶液，用于開展降糖功效評價研究。三卡因甲磺酸（CAS號：886-86-2），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（pH 7.02），南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實驗動物

斑馬魚（3月齡，AB型），上海費曦生物科技有限公司。斑馬魚胚胎的繁殖以自然交配方式進(jìn)行。每個產(chǎn)卵盒中按1:1放入公魚和母魚，放入28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，光照設(shè)置為14 h光照和10 h黑暗，于第二天上午收集胚胎，去除死卵和糞便，清洗后換孵育水（60 μg/mL海鹽水），置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，每24 h換水一次，去掉卵膜和死卵。實驗完成后，用0.017%三卡因甲磺酸暴露將斑馬魚麻醉處死。

1.2 實驗方法

1.2.1 斑馬魚對GLU和ALX的耐受性分析研究

本研究擬以GLU單獨或者與ALX聯(lián)用建立糖代謝異常斑馬魚（幼魚）模型，因幼魚對GLU與ALX的耐藥性的影響尚無參考依據(jù)，故開展斑馬魚幼魚對GLU與ALX耐受性的影響研究，為下一步建模方案提供基礎(chǔ)信息。（1）斑馬魚幼魚對GLU耐受性影響：將5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機(jī)分為6組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30條，分別給予0、10、20、40、80、100 mg/mL GLU溶液；（2）斑馬魚幼魚對ALX耐受性影響：將5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機(jī)分為為7組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)45條，分別給予0、3.60、7.20、14.40、28.80、36.00、72.00 μg/mL溶液。培養(yǎng)24 h記錄死亡數(shù)量計算死亡率，探討斑馬魚對GLU和ALX耐受性的影響并指導(dǎo)開展糖尿病斑馬魚建模方案研究。

1.2.2 GLU與ALX聯(lián)合建立糖尿病斑馬魚模型可行性及有效性分析

1.2.2.1 糖尿病斑馬魚建?？尚行匝芯?/p>

基于上述斑馬魚對GLU和ALX耐受性的影響結(jié)果，優(yōu)選10 mg/mL GLU與3.60或7.20 μg/mL藥物組合開展糖尿病斑馬魚（幼魚）建模方案研究。將5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機(jī)分為4組，分別記為BC1、BC2、MC1、MC2，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)20條，分別給予0 mg/mL GLU+0.00 μg/mL、10 mg/mL GLU+0.00 μg/mL、10 mg/mL GLU+3.60 μg/mL、10 mg/mL GLU+7.20 μg/mL溶液，每孔加藥物8 mL，培養(yǎng)24 h，取9條用于測定GLU含量，探究GLU與ALX聯(lián)合建立糖尿病斑馬魚模型的可行性。

1.2.2.2 糖尿病斑馬魚建模有效性分析

ACA是常見的糖尿病治療藥物，因此選用ACA干預(yù)以評價糖尿病建模方案的有效性。將5 dpf野生型AB系斑馬魚給予10 mg/mL GLU+3.60 μg/mL溶液孵育24 h以建立糖尿病模型，然后隨機(jī)分為5組，分別記為MC1、T1、T2、T3，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)20條，分別給予10 mg/mL GLU、10 mg/mL GLU+200 μg/mL ACA、10 mg/mL GLU+400 μg/mL ACA、10 mg/mL GLU+800 μg/mL ACA溶液，每孔加藥物8 mL。同步設(shè)置0 mg/mL GLU孵育48 h（孵育24 h時換水一次）作為BC1空白對照組。培養(yǎng)結(jié)束后，每個重復(fù)取10條用于測定GLU含量，探究GLU與ALX聯(lián)合建立糖尿病斑馬魚模型的有效性。

1.2.3 斑馬魚對CP的耐受性分析研究

將5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機(jī)分為12組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30條，分別給予0、25、50、100、200、400、800、1000、2000、4000、8000、10000 μg/mL CP溶液（以生藥量計），每孔加藥物10 mL，每24 h換水一次，記錄死亡數(shù)量，計算每組死亡率，優(yōu)選劑量作為降糖作用評價用劑量濃度。

1.2.4 CP對基于正常生理和病理生理的斑馬魚模型的降糖作用研究

1.2.4.1 CP對高糖誘導(dǎo)正常斑馬魚模型降糖作用的影響

根據(jù)斑馬魚對CP的耐受性分析結(jié)果，按照CP的10%～25% LC50推薦可用于降糖作用評估的劑量濃度并對劑量濃度略作調(diào)整，下限調(diào)整為200 μg/mL，并按照倍數(shù)關(guān)系設(shè)置400和800 μg/mL作為梯度設(shè)計開展CP降糖作用研究。將5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機(jī)分為5組，分別記為BC1、BC2、T1、T2、T3，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)20條，分別給予0 mg/mL GLU+0 μg/mL CP、10 mg/mL GLU+0 μg/mL CP、10 mg/mL GLU+200 μg/mL CP、10 mg/mL GLU+400 μg/mL CP、10 mg/mL GLU+800 μg/mL CP溶液，每孔加藥物8 mL，培養(yǎng)24 h，取10條用于測定GLU含量，探究CP對高糖誘導(dǎo)斑馬魚模型降糖作用的影響。

1.2.4.2 CP處理對胰島損傷糖尿病糖斑馬魚模型降糖作用的影響

將5 dpf野生型AB系斑馬魚，給予10 mg/mL GLU+3.60 μg/mL聯(lián)合孵育24 h以誘導(dǎo)建立糖尿病模型，然后隨機(jī)分成分為5組，分別記為MC1、T1、T2、T3、T4，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)20條，分別給予10 mg/mL GLU、10 mg/mL GLU+200 μg/mL CP、10 mg/mL GLU+400 μg/mL CP、10 mg/mL GLU+800μg/mL CP、10 mg/mL GLU+400 μg/mL ACA孵育24 h，每孔加藥8 mL。同步設(shè)置0 mg/mL GLU、10 mg/mL GLU孵育48 h（孵育24 h時換水一次）作為空白對照組，分別記為BC1和BC2。培養(yǎng)結(jié)束后，每個重復(fù)取10條魚用于測定GLU含量，探究CP處理對糖尿病斑馬魚模型降糖作用的影響。

1.3 檢測方法

GLU含量檢測按如下步驟進(jìn)行：取0.1 mL PBS緩沖液于裝魚的1.5 mL離心管中，采用高速手持式勻漿機(jī)勻漿直至魚體組織裂解充分，然后于4 ℃下以2500 r/min離心10 min，結(jié)束后取上清樣2.5 μL采用GLU檢測試劑盒（GLU氧化酶法）測定GLU濃度，其測定程序和方法按照試劑盒說明書規(guī)定的步驟進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016處理后，用Graphpad Prism 6.0繪圖，并用SPSS Statistics 17.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)，差異顯著性采用Duncan分析并將進(jìn)行多重比較，p<0.05表示組間差異顯著。在藥物耐受性分析方面，利用SPSS 17.0軟件中PROBIT程序計算其半數(shù)致死濃度（Median lethal concentration，LC50）。

2 結(jié)果與討論

2.1 斑馬魚對GLU和ALX的耐受性分析

不同濃度GLU和ALX對斑馬魚死亡率的影響見圖1。從圖1中可以看出，斑馬魚幼魚對高濃度GLU和ALX具有不耐受性，當(dāng)GLU濃度大于等于40 mg/mL或ALX濃度大于等于36.00 μg/mL時死亡率達(dá)到100%。10 mg/mL GLU處理組死亡率為2.22%，3.60和7.20 μg/mL ALX處理組死亡率分別為2.22%和4.44%。研究表明，為成功構(gòu)建基于正常生理和病理生理的糖代謝異常斑馬魚模型，GLU宜選用劑量濃度為10 mg/mL，ALX的宜選用劑量濃度3.60和7.20 μg/mL。

2.2 GLU與ALX聯(lián)合建立糖尿病斑馬魚模型性及有效性分析研究

綜合斑馬魚對GLU耐受性和ALX耐受性特點，選取10 mg/mL GLU溶液為糖源，并與3.60和7.20 μg/mL ALX聯(lián)合探討建立糖尿病模型的可行性，結(jié)果見圖2a。研究發(fā)現(xiàn)，相比BC1組，BC2組斑馬魚組織GLU值顯著增加，達(dá)到50.19%（p>0.05），表明以10 mg/mL GLU處理可以構(gòu)建基于生理的糖代謝異常斑馬魚模型。此外，與BC1組相比，MC1和MC2組斑馬魚組織GLU值顯著增加，分別增加了51.52%和68.32%，且差異均顯著（p<0.05）。結(jié)果表明，以10 mg/mL GLU與3.60和7.20 μg/mL ALX作為藥物聯(lián)合可以用于構(gòu)建基于病理的糖尿病斑馬魚模型的預(yù)選方式方法。

基于上述研究，選用10 mg/mL GLU與3.60 μg/mL溶液聯(lián)合建立糖尿病模型并進(jìn)行模型有效性分析，結(jié)果見圖2b。從圖2b中可以看出，與BC1組相比，MC1組斑馬魚GLU值顯著增加，達(dá)到46.24%（p<0.05），再次驗證了前期研究結(jié)果。與此同時，從糖尿病治療藥物-ACA治療療效方面看，相比MC1組，T1、T2和T3組斑馬魚GLU值顯著降低，分別降低了27.28%、33.69%和38.75%，差異均顯著（p<0.05）。結(jié)果顯示在該模型下，ACA降糖效果顯著，表明以此方式誘導(dǎo)建立的糖尿病模型是有效性的。

目前，以斑馬魚幼魚為對象構(gòu)建糖尿病模型還比較鮮見。可查閱對比的是勞喬聰?shù)萚13]的研究，他們以4 dpf斑馬魚為對象，采用40 mg/mL蔗糖作為糖源與144 μg/mL聯(lián)用，并通過二甲雙胍等4種常見糖尿病治療藥物進(jìn)行模型有效性論證，表示以此方法可以成功并有效建立的糖尿病模型。另外，勞喬聰[16]以4 dpf斑馬魚對象，先后在1.008 mg/mL ALX與36 mg/mL GLU溶液聯(lián)合下沖擊1 h，144 μg/mL ALX與36 mg/mL GLU溶液聯(lián)合下孵育48 h可以有效建立斑馬魚糖尿病模型。但與本研究相比，建模方案有明顯差異，尤其是劑量濃度選用方面差異較大。研究發(fā)現(xiàn)隨著孵育液中GLU劑量濃度的增加致死率明顯上升，可能與試驗使用的斑馬魚的品系、養(yǎng)殖體系參數(shù)、藥物品種品質(zhì)等不同有關(guān)，其具體的原因還需后續(xù)進(jìn)一步的探索研究。另外，同采用類似經(jīng)典的大小鼠糖尿病造模方式相比[11,12]，本研究以斑馬魚幼魚為對象構(gòu)建的糖尿病斑馬魚模型更具有明顯的可操作性和便捷性優(yōu)勢，并且成本更為節(jié)約。

2.3 斑馬魚對CP的耐受性分析

不同CP濃度對斑馬魚幼魚死亡率的影響見圖3。從圖3中可以看出，斑馬魚幼魚對高濃度CP溶液具有不耐受性，CP濃度大于等于4000 μg/mL時死亡率為100%。另外，從孵育時間上看，隨著孵育時間的延長死亡率不斷增加。以24 h基準(zhǔn)，采用SPSS中PROBIT程序回歸分析得出斑馬魚幼魚的CP耐受性（表1）Probit模型：Probit(p)=-1.26667+0.00049x，按該模型計算得出CP的LC50為2582.82 μg/mL，95%可信范圍為2166.95～3149.83 μg/mL。因而，若按照CP的10%～25% LC50推薦可用于降糖作用評估的劑量濃度為258.28～645.71 μg/mL。

表1 斑馬魚幼魚青錢柳耐受性影響的參數(shù)估計表Table 1 Parameter estimates of CP tolerance in zebrafish larvae

2.4 CP對基于正常生理和病理生理的斑馬魚模型的降糖作用研究

根據(jù)斑馬魚對CP耐受性的影響，按照CP的10%～25% LC50推薦略作調(diào)整，選用200、400和800 μg/mL劑量梯度組合開展CP降糖作用研究，其對基于正常生理和病理生理斑馬魚幼魚GLU值的影響見圖4。從圖4a中可以看出，相比BC1組，BC2組斑馬魚組織GLU值明顯增加，達(dá)到21.70%（p>0.05），與前期結(jié)果一致。另外，與BC2組相比，T1組對斑馬魚GLU含量影響較小，略微增加了7.77%（p>0.05），T1和T2組斑馬魚GLU值顯著降低，且降低幅度分別達(dá)到了37.59%（p<0.05）和38.57%（p<0.05），表明在正常生理模型下較高濃度的CP具有明顯的降糖效應(yīng)。

從圖4b中可以看出，相比BC1組，10 mg/mL GLU誘導(dǎo)48 h的BC2組斑馬魚GLU值顯著增加（p<0.05），MC1組斑馬魚GLU值顯著增加（p<0.05）。相比MC1組，T1、T2和T3組斑馬魚GLU值顯著降低，分別降低了27.43%、32.75%和29.20%，差異均顯著（p<0.05），表明在該病理模型下CP均表現(xiàn)出了明顯的降糖效應(yīng)（p<0.05）。

研究發(fā)現(xiàn)，400和800 μg/mL CP可以顯著降低10 mg/mL GLU誘導(dǎo)的斑馬魚GLU值，以及200、400和800 μg/mL可以顯著降低胰島損傷型糖尿病斑馬魚GLU值，CP的降糖作用可能與減少GLU腸道內(nèi)吸收，保護(hù)胰腺促進(jìn)胰島素分泌[14]，改善胰島素敏感性[15]，增加體內(nèi)GLU的消耗利用[17-19]，保護(hù)并改善肝臟異常代謝[20,21]，還可能與促進(jìn)血脂穩(wěn)定，增強抗氧化，保護(hù)胰腺等相關(guān)[22-24]。姚駿凱等[15]研究發(fā)現(xiàn)CP可以顯著降低糖尿病大鼠空腹血糖和胰島素抵抗指數(shù)，顯著增加肝臟磷酸化胰島素受體底物1/胰島素受體底物1蛋白比值以及胰島素受體底物1蛋白mRNA的表達(dá)。姚駿凱等[14]研究發(fā)現(xiàn)CP可以降低糖尿病大鼠胰腺可溶性細(xì)胞凋亡因子、可溶性細(xì)胞凋亡因子配體、活化半胱氨酸蛋白酶8含量以及總c-Jun氨基端激酶1和磷酸化c-Jun氨基端激酶1的表達(dá)量，表明CP降糖效應(yīng)可能與抑制胰腺β細(xì)胞凋亡有關(guān)。肝臟在糖脂代謝中發(fā)揮重要作用。栗靜等[20,21]研究發(fā)現(xiàn)CP可以通過改善肝臟異常代謝來預(yù)防糖尿病[14,15]。另外，勞喬聰[13]等利用斑馬魚模型開展CP降糖作用研究時表明1000和2000 μg/mL CP可以顯著降低血糖值，且降糖效果呈濃度依賴性。因此，下一步將基于正常生理和病理生理生理的糖代謝異常模型，開展CP毒理學(xué)安全性評價和劑量學(xué)估算研究，尤其是借助斑馬魚幼體透明和可以進(jìn)行活體染色的顯著優(yōu)勢開展器官毒理損傷作用研究，靶器官損傷的保護(hù)和治療作用研究，以及開展復(fù)方配伍降糖增效作用研究，為健康功能食品或飲品開發(fā)提供基礎(chǔ)理論和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

3 結(jié)論

5 dpf斑馬魚對高濃度的GLU、ALX和CP具有不耐受性。相比0 mg/mL GLU組，以10 mg/mL GLU與3.60或7.20 μg/mL ALX聯(lián)合誘導(dǎo)造模24 h，可顯著增加斑馬魚GLU值，分別增加了51.52%（p<0.05）和68.32%（p<0.05）。與模型對照組相比，經(jīng)200、400和800 μg/mL ACA治療評價斑馬魚GLU值分別降低了27.28%、33.69%和38.75%，差異均顯著（p<0.05），表明以10 mg/mL GLU與3.60 μg/mL ALX聯(lián)合孵育24 h可以有效建立糖尿病斑馬魚模型。另外，研究發(fā)現(xiàn)，400和800 μg/mL CP可以顯著降低10 mg/mL GLU溶液誘導(dǎo)的斑馬魚GLU值，分別降低了37.59%（p<0.05）和38.57%（p<0.05）；200、400和800 μg/mL CP可以顯著降低糖尿病斑馬魚GLU值，分別降低了27.43%、32.75%和29.20%，差異均顯著（p<0.05）。結(jié)果表明，基于正常生理和病理生理的斑馬魚生物模型評價，CP具有明顯的降糖效應(yīng)，其在輔助降糖功能飲品開發(fā)上具有廣闊的應(yīng)用前景。