董雷超，王紅磊，陳炫宏，南希駿，嵇威，厲佳怡，盛桂華，周泉城

（山東理工大學農業(yè)工程與食品科學學院，農產品功能化技術山東省高校重點實驗室，山東淄博 255049）

綠原酸（CGA）是一種分布廣泛，具有顯著酚結構的抗氧化物質，是咖啡酸和奎尼酸的結合物[1]，分布于各類水果和蔬菜中，尤其是咖啡中富含綠原酸[2]。研究表明，綠原酸具有抗氧化性[3]、抗癌活性[4]、抗炎活性[5]、抗病毒活性[6]等，已被廣泛應用于保健、醫(yī)療和食品加工等行業(yè)[7-9]。由于綠原酸重要的功能特性，近年來對綠原酸的檢測分析也越發(fā)引起人們的關注。目前對綠原酸的常見檢測方法有比色法[10]、高效液相色譜法[11]、聯(lián)用法[12]、熒光傳感器法[13]及電化學分析法[14]等。其中，電化學分析方法操作簡便，成本低、準確度高，是一種具有良好前景的檢測方法。

金屬有機框架材料（MOFs），是一類新型多孔晶體材料，具有眾多優(yōu)勢，如大比表面積、高孔隙度、化學穩(wěn)定性、可調節(jié)孔徑、結構靈活可調節(jié)等[15,16]?；谶@些獨特的特征，MOF在分離[17]、儲氣[18]、催化[19]、藥物遞送[20]、傳感器[21]等領域得到了廣泛的應用。ZIF-8（沸石咪唑酯骨架-8）是一種由Zn2+和2-甲基咪唑構建的一種MOFs，易于制備，且具有良好的水熱穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性[22]。ZIF-8也被應用于電化學傳感領域，但是由于MOFs的弱導電性，一般將高導電性和催化活性物質引入ZIF-8中，進一步提高改性電極的靈敏度。其中，金屬納米顆粒常用于修飾MOFs，如Au、Ag、Pt等貴金屬是常見的修飾用材料，能夠使復合材料表現(xiàn)出顯著增強的電化學性能，促進電子轉移率的增加。

本研究通過ZIF-8與Ag納米顆粒復合，與羧基化的碳納米管共同修飾到電化學傳感器的工作電極表面，改善其導電性及電催化性能，以獲得電化學傳感器在檢測綠原酸時的靈敏信號。實驗結果表明，修飾行為可以有效的提高電化學傳感器對綠原酸的檢測能力。在優(yōu)化條件下，可以簡單高效的測定綠咖啡豆中的綠原酸含量。

1 材料與方法

1.1 原料

2-甲基咪唑、乙酸鋅（純度≥99%），上海愛純生物科技有限公司；氧化鋁拋光粉，上海辰華儀器有限公司；AgNO3（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；MWCNTs（羧基化多壁碳納米管），江蘇先豐納米材料科技有限公司；殼聚糖，上海愛純生物科技有限公司；綠原酸（5-CQA），上海源葉生物科技有限公司；其他實驗試劑均為分析純；試驗用水為二次蒸餾水；綠咖啡豆購自當?shù)爻小?/p>

1.2 主要儀器設備

CHI760E電化學工作站，上海辰華儀器有限公司；玻碳電極，上海辰華儀器有限公司；Ag/AgCl電極，上海辰華儀器有限公司；鉑絲電極，上海辰華儀器有限公司；quanta 250場發(fā)射掃描電子顯微鏡，美國FEI，用于查看所制備樣品的形態(tài)特征，使用配套的X射線能譜儀獲得樣品的能量色散X射線光譜圖；WJGS-009X射線衍射儀，德國BrukerAXS，用于獲得粉末X射線衍射圖譜；Nicolet 5700傅里葉變化紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet，用于獲得樣品的紅外光譜圖；ASAP 2460比表面積及孔徑分析儀，美國Micromeritics，用于獲取樣品的比表面積。

1.3 實驗方法

1.3.1 室溫下制備ZIF-8

參考文獻[23]制備ZIF-8。準確稱量275 mg（1.5 mmol）乙酸鋅和985 mg（12 mmol）2-甲基咪唑，分別溶解在90 mL無水乙醇中。在磁力棒攪拌下，將后一種澄清溶液倒入前一種澄清溶液中。合并各組分溶液后攪拌1 h，停止攪拌。靜置24 h后，通過離心（4000 r/min）將固體與乳狀膠態(tài)分散體分離。用無水乙醇洗滌4次后，將產物在60 ℃真空干燥箱中干燥24 h，獲得ZIF-8粉末。

1.3.2 制備ZIF-8@Ag

參考文獻[24]并做適當調整制備ZIF-8@Ag，取20 mg ZIF-8，超聲10 min分散在30 mL乙醇中，滴加0.1 mL AgNO3（5 mg/mL）溶液，繼續(xù)攪拌6 h。加入1 mL BNaH4（0.076 g/L）堿性水溶液，持續(xù)攪拌1 h，將所得乳濁液通過離心（4000 r/min）將沉淀物分離出來，依次用用無水乙醇洗滌4次，將產物在60 ℃真空干燥箱中干燥24 h，獲得ZIF-8@Ag粉末。

1.3.3 修飾電極的制備

將裸玻碳電極（GCE）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化鋁粉末精心打磨，并在每種粉末打磨后用無水乙醇和蒸餾水各超聲清洗3 min。將打磨好的電極用高純氮氣吹干備用。取0.5 mL 3%殼聚糖溶液加4.5 mL水，溶解5 mg MWCNTs，攪拌后超聲10 min，所得溶液用移液器取4 μL用于滴涂電極，獲得MWCNTs/GCE電極，在50 ℃烘箱中烘干后備用。取20 mg ZIF-8@Ag粉末用10 mL乙醇溶解，所得乳濁液取1 mL與1 mL 3%殼聚糖溶液混合超聲分散后在上述的MWCNTs/GCE修飾電極上滴加2 μL，獲得ZIF-8@Ag/MWCNTs/GCE電極，在50 ℃烘箱中烘干后備用。取0.01 g ZIF-8添加到10 mL乙醇中，超聲分散10 min后，滴加2 μL到裸玻碳電極，再滴加2 μL 3%的殼聚糖溶液固定，獲得ZIF-8/GCE電極，在50 ℃烘箱中烘干后備用，ZIF-8@Ag處理方式同ZIF-8。

1.3.4 電化學測試

電化學測試均在電化學工作站CHI760E上完成，采用三電極系統(tǒng)：工作電極為GCE或修飾GCE，參比電極為Ag/AgCl電極，對電極為鉑絲電極。PBS緩沖液由0.1 mol/L的NaH2PO4和0.1 mol/L的Na2HPO4配制而成，調整比例獲得不同pH的緩沖液，加入0.1 mol/L的KCl為支持電解質。通過將0.3540 g的綠原酸溶解在100 mL的無水乙醇中來制備0.01 mol/L的綠原酸儲備液。工作標準溶液是通過用所需pH的PBS緩沖液逐步稀釋綠原酸儲備液到相應濃度而獲得的，綠原酸儲備液配置后放4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?。所有測量均在室溫下進行。

1.3.5 樣品處理

將購買的綠咖啡豆樣品使用多功能粉碎機粉碎5 min，將其打磨成粉末狀。精確稱取1 g粉末，將其分散在50 mL的水/乙醇混合液（體積比50:50）中，將樣品混合液置于超聲浴中5 min，然后在水?。?0 ℃）中萃取20 min，然后通過濾紙過濾，在環(huán)境溫度下冷卻，然后通過0.45 μm PTFE過濾器過濾以除去所有沉淀物。在即將測量之前，將提取液用PBS緩沖液（pH=6）稀釋50倍。向10 mL的樣品稀釋液中依次添加綠原酸標準品溶液，以計算加標回收率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本文中設計的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和繪圖均采用Origin 2018軟件完成。

2 結果與討論

2.1 修飾材料的表征

圖1給出了ZIF-8和ZIF-8@Ag的傅里葉變換紅外光譜圖。右側的421 cm-1處的峰可以歸因于Zn-N的伸縮振動，而出現(xiàn)在1586 cm-1處的峰則對應于C=N伸縮振動，1422或1458 cm-1處的峰值與環(huán)的伸縮振動有關，2930 cm-1處的峰對應環(huán)外甲基飽和C-H的伸縮振動，3134 cm-1處的峰對應環(huán)內不飽和C-H的伸縮振動，與文獻[25]一致。并且，光譜圖中ZIF-8@Ag各峰基本與ZIF-8各峰一致，表明ZIF-8@Ag的制備不會破壞ZIF-8的表面基團。

為了進一步探究形成ZIF-8@Ag復合物后，ZIF-8的結構是否被破壞，測定了ZIF-8及ZIF-8@Ag復合物的特征晶體衍射峰，如圖2所示，觀察到大約在7.5 °、10.5 °、12.5 °和18 °處的幾處主衍射峰，分別對應ZIF-8的（110）、（200）、（211）和（222）晶面，與文獻基本一致[26]。這些特征衍射峰說明成功獲得了ZIF-8晶體，并且ZIF-8具有良好的晶型。所得ZIF-8@Ag復合物的特征晶體衍射峰與ZIF-8的X射線衍射圖譜基本一致，各峰沒有明顯變化。這表明ZIF-8在形成ZIF-8@Ag復合物的過程中仍然保持本身的形態(tài)結構，與上述紅外光譜表征所得的結果相吻合。

通過氮氣吸脫附實驗測定修飾前后ZIF-8@Ag的比表面積變化，測定結果為ZIF-8的BET比表面積為1365.44 m2/g，ZIF-8@Ag的BET比表面積為1290.73 m2/g，ZIF-8@Ag復合材料的比表面積接近于純ZIF-8。這表明Ag納米粒子在ZIF-8表面成功修飾，且ZIF-8@Ag保持了純ZIF-8的高比表面積的優(yōu)良特性。

利用掃描電鏡對所制備的ZIF-8及ZIF-8@Ag進行表征，由圖3a，b可見，ZIF-8為較為規(guī)整的菱形十二面體，粒徑為250 nm左右，具有較窄的粒徑分布范圍。在ZIF-8表面使用BNaH4原位還原Ag+制備ZIF-8@Ag，所得產物如圖3c所示，ZIF-8主體結構形態(tài)保持穩(wěn)定，而Ag納米顆粒較為均勻的分散在ZIF-8表面，圖3d為能量色散x射線光譜圖中Ag的元素分布，進一步證明Ag納米顆粒較為均勻的分散在各ZIF-8表面。

如圖4a所示，一定粒徑范圍內的Ag納米顆粒相對均勻的分布在ZIF-8表面，由圖4b可得，所示納米顆粒的晶格間距為0.236 nm，與Ag(111)的晶格間距很好地吻合，對應所獲得的銀納米顆粒。

2.2 修飾材料的電化學表征

以K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]體系為探針，分別將裸玻碳電極及修飾電極置于 5×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl的混合溶液中測試了不同修飾電極的循環(huán)伏安行為（CV）和電化學阻抗（EIS）。如圖5所示，在GCE上觀察到一對可逆且明確的氧化還原峰，峰電位差（ΔEp）為80 mV左右。修飾ZIF-8后，因為ZIF-8本身的弱導電性，電流信號相對于裸電極變化不大，而GCE修飾ZIF-8@Ag后電信號有一定增強。另一方面，在羧基化多壁碳納米管的存在下修飾電極獲得了較高的峰值電流，因為與裸玻碳電極相比，羧基化多壁碳納米管的高電導率支持快速的電子轉移。ZIF-8@Ag/ MWCNTs/GCE的CV響應呈現(xiàn)最高電流信號，可能是因為Ag納米粒子在具有高比表面積的ZIF-8表面均勻分布，Ag納米粒子的優(yōu)良導電性配合羧基化多壁碳納米管的高電導率，協(xié)同提高了復合材料的電子轉移速率。循環(huán)伏安測試實驗結果表明ZIF-8@Ag/ MWCNTs修飾電極具有良好的導電性，有可能實現(xiàn)更靈敏的檢測。

如圖6所示，測試了裸GCE電極、ZIF-8/GCE電極、MWCNTs/GCE電極、ZIF-8@Ag/MWCNTs/GCE電極的電阻抗行為。電化學阻抗譜的奈奎斯特圖包括在高頻觀察到的半圓形部分和在低頻觀察到的線性部分，分別對應于電子轉移和物質轉移過程，半圓形的直徑對應于轉移電阻（Rct），在圖6的插圖中展示了相應的等效電路模型。裸玻碳電極的阻抗值估計為181.4 Ω，修飾了ZIF-8的玻碳電極的抗值估計為446.3 Ω，阻抗值相較于裸玻碳電極明顯增大，表明ZIF-8的不良電導率阻礙了電子的轉移，ZIF-8@Ag/GCE抗值估計為289.1 Ω，阻抗值GCE

在含5×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]體系、0.1 mol/L的KCl的電解液中使用CV測試裸GCE、ZIF-8/GCE、ZIF-8@Ag/GCE、MWCNTs/GCE和ZIF-8@Ag/MWCNTs/GCE，并據(jù)此計算各電極的電活性面積。準可逆反應的電極活性面積采用Randles-Sevcik方程[27]計算，如下所示：

式中：

n——參與氧化還原反應的電子數(shù)，n=1；

A——電極電活性表面積，cm2；

D——鐵氰化物的擴散系數(shù)，cm2/s；

C——鐵氰化物在本體溶液中的濃度，mol/cm3；

v——掃描速，V/s。

計算出的裸GCE、ZIF-8/GCE、MWCNTs/GCE、ZIF-8@Ag/GCE和ZIF-8@Ag/MWCNTs/GCE電活性面積分別估計為0.06、0.08、0.10、0.22、0.36 cm2。上述電化學表征結果表明，ZIF-8@Ag/MWCNTs復合材料可以擴大電活性表面積，加速分析物和電極之間的電子轉移，從而ZIF-8@Ag/MWCNTs/GCE可用于綠原酸的靈敏測定。

為測試電極修飾對綠原酸檢測的影響，分別用GCE和ZIF-8@Ag/MWCNTs/GCE對1×10-5mol/L濃度的綠原酸緩沖液（pH=7）進行CV掃描，發(fā)現(xiàn)相對于裸電極，ZIF-8@Ag/MWCNTs/GCE的CV曲線中電流信號顯著增強，修飾的碳納米管和ZIF-8@Ag使得電極具有較大的活性表面作用于綠原酸的氧化還原過程，復合材料對于這一過程具有良好的電催化作用，最終促使電流響應增強。

2.3 實驗條件的優(yōu)化

2.3.1 pH的影響

在圖8中給出了不同pH條件（pH=5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）對1.00×10-3mol/L綠原酸在ZIF-8@Ag/ MWCNTs/GCE上CV掃描的影響?？梢园l(fā)現(xiàn)綠原酸的峰電位隨溶液pH的變化而變化，隨pH增大電位逐漸左移。各pH條件下的CV結果表明在緩沖液pH為6.0時，ZIF-8@Ag/MWCNTs/ GCE測定綠原酸時有最高的峰電流信號，因此在后續(xù)的測試中也使用pH為6.0的PBS緩沖液進行測試。

2.3.2 掃描速率的影響

研究了ZIF-8@Ag/MWCNTs/GCE在不同掃描速率（0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.03、0.07、0.08、0.09、0.10 V/s）下對1.00×10-4mol/L綠原酸CV掃描的影響。如圖9a所示，陽極峰值電流隨著掃描速率從0.01到0.10 V/s的增加而增加。同時，氧化峰電流（Ipa）與掃描速率的平方根（v1/2）呈良好線性關系。線性回歸方程可表示為：

表明綠原酸在ZIF-8@Ag/MWCNTs/GCE上的電化學過程是受擴散控制的過程。

2.4 線性范圍及檢出限

差分脈沖伏安法（DPV）用于測定ZIF-8@Ag/MWCNTs/GCE檢測綠原酸的線性范圍和檢出限（LOD）。ZIF-8@Ag/MWCNTs/GCE修飾電極測定不同濃度綠原酸的DPV曲線在圖10a中給出，峰電流強度與CGA的濃度在以下范圍內呈線性關系：5×10-8～1×10-5mol/L。線性關系式為：

根據(jù)3Sb/S計算檢出限（LOD），其中Sb是空白測量的標準偏差（n=11），S是校準圖的斜率。發(fā)現(xiàn)LOD為1.36×10-8mol/L。本研究中獲得的LOD表明，設計的ZIF-8@Ag/MWCNTs/GCE對CGA的測定比較敏感，檢測限較低。將本研究方法與其他先前報道的綠原酸電化學傳感器方法進行比較，如表1所示。顯然，本研究方法具有較寬的檢測范圍及較低的檢測限，表明ZIF-8@Ag/MWCNTs/GCE可以作為靈敏的綠原酸電化學傳感器使用。

表1 不同綠原酸電化學傳感器的比較Table 1 Comparison of different chlorogenic acid electrochemical sensors

2.5 修飾電極的抗干擾性、重復性、再現(xiàn)性

以氧化峰信號強度的±5%范圍為允許相對誤差，DPV測試結果表明100倍濃度的Na+、Cl-、K+、NO3-、SO42-、Ca2+、肌酸、腺嘌呤、蔗糖、果糖、葡萄糖對200 μmol/L綠原酸的測定幾乎沒有影響，如圖11所示。因此，可以認為該方法具有較好的抗干擾性，可以在實際樣品中進一步應用于綠原酸的檢測。

為了驗證重復性，在制備好ZIF-8@Ag/MWCNTs/ GCE修飾電極后，在含5 μmol/L綠原酸PBS緩沖液中用同一電極連續(xù)測試9次DPV，峰值電流的相對標準偏差（RSD%）為2.04%，這一結果表明制備的修飾電極在測定一定濃度的綠原酸時具有良好的重復性，如圖12a所示。為了評估再現(xiàn)性，同時用同一流程制備的5根修飾電極進行測試，在含5 μmol/L綠原酸PBS緩沖液中通過DPV測量峰值電流的相對標準偏差（RSD）為4.25%，證明所提出的傳感器具有良好的再現(xiàn)性，如圖12b所示。

2.6 實際樣品的檢測

通過標準添加方法進行回收率實驗，以綠原酸標準品（5-CQA）的校準曲線作為定量標準，每個濃度水平測試三次。如表2所示，該傳感器具有96.34%至103.34%的較優(yōu)回收率，這表明這項工作中的綠原酸電化學傳感器可以應用于實際含綠原酸樣品的分析。

表2 真實樣品中的綠原酸的測定Table 2 Determination of the chlorogenic acid in real samples

3 結論

本研究在常溫下制備ZIF-8顆粒，并以銀納米粒子修飾，將ZIF-8@Ag與羧基化多壁碳納米管結合共同修飾玻碳電極，構建了一種新型的用于綠原酸檢測的電化學傳感器。ZIF-8顆粒具有的大比表面積負載 了均勻分布的銀納米顆粒，使用的多壁碳納米管則進一步促進了電子轉移速率。在最佳實驗條件下，該傳感器檢測綠原酸在5×10-8～1×10-5mol/L范圍內表現(xiàn)出良好的線性關系，檢出限為1.36×10-8mol/L。此外，該傳感器成功地用于實際樣品綠咖啡豆中綠原酸的檢測。