黃金耒，李斌，賈楠，郎沖沖，孫文，姜林

（北京市農(nóng)林科學(xué)院智能裝備技術(shù)研究中心，北京 100097）

霉菌毒素，又名真菌毒素，是霉菌在生長成熟過程中產(chǎn)生的一系列有毒有害物質(zhì)。霉菌毒素對飼料的污染較為普遍和嚴(yán)重，美國食品和藥物管理局（FDA）調(diào)查研究顯示，全球約有25%的飼料及其原料受到霉菌毒素的污染[1]。霉菌毒素的產(chǎn)生與溫度和濕度有關(guān)，可發(fā)生在生產(chǎn)加工、儲存和運輸?shù)蕊暳仙a(chǎn)的任一環(huán)節(jié)。攝入含有霉菌毒素的飼料會降低畜禽免疫機能，引起多種疾病，影響畜禽正常生長及生產(chǎn)性能，并最終通過畜牧產(chǎn)品食物鏈危害人類健康；且研究顯示微量的霉菌毒素對畜禽/人就有著極大的毒害作用[2～4]。因此，快速、準(zhǔn)確地檢測飼料產(chǎn)品及原料中霉菌毒素的含量，是保障動物健康生長和人類食品安全的必要手段。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)開展了霉菌毒素的檢測方法研究，并取得一定進展。鑒于此，本文簡要介紹霉菌毒素及檢測標(biāo)準(zhǔn)，綜述了多種基于生物理化和光譜分析的檢測方法，從而為定性定量檢測霉菌毒素的應(yīng)用研究提供參考。

1 常見霉菌毒素及檢測標(biāo)準(zhǔn)

飼料中常見的霉菌毒素種類有單端孢霉烯族毒素（T-2毒素）、赭曲霉毒素、黃曲霉毒素（AFT）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和伏馬毒素（FB）等。霉菌毒素對動物和人類的危害主要表現(xiàn)為免疫抑制性、致畸性和致突變性，還會導(dǎo)致腎臟中毒、神經(jīng)系統(tǒng)異常及致癌等。同時存在多種霉菌毒素時毒性加重，如T-2毒素與赭曲霉毒素A（OTA）、嘔吐霉素（DON）與AFT、DON與ZEN之間具有協(xié)同作用[5]。

在我國國家標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，已給出幾種霉菌毒素檢測方法，包括檢測AFB1的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）方法，檢測AFT、ZEN以及T-2毒素含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，檢測DON含量的免疫親和柱凈化-高效液相色譜測定方法，檢測OTA含量的免疫親和柱凈化-高效液相色譜測定方法，檢測FB1+FB2含量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法和液相色譜測定方法。但這些檢測方法或多或少存在一定的局限性，如酶聯(lián)免疫吸附法雖操作簡便，但成本高且耗時長[6]；免疫親和柱凈化-高效液相色譜測定方法靈敏度高，但儀器昂貴且操作復(fù)雜[7]。因此，研發(fā)快速、步驟簡化、材料節(jié)省的定性定量檢測方法成為了迫切需求。

2 基于生物和理化技術(shù)的霉菌毒素檢測方法

隨著生物和理化技術(shù)的發(fā)展，一些快速檢測技術(shù)逐步應(yīng)用在霉菌毒素方面，主要有免疫層析法、薄層色譜法、超快速液相色譜法，以及核酸適配體生物傳感器法等。

免疫層析法（ICA）是基于標(biāo)記的特異性抗體與抗原的相互作用的檢測方法[8]，具有快速、準(zhǔn)確、可視化和適合大批量檢測等優(yōu)點，但敏感度較差。Urusov等[9]建立了檢測糧食中污染物OTA的免疫層析系統(tǒng)，檢測水平分別為50ng/mL和5ng/mL的粗植物提取物，檢測時間為10min。

薄層色譜法（TLC）是利用混合物中溶劑的吸附或溶解性能的不同對霉菌毒素進行提取、分離的一種檢測方法[10]，具有操作簡單、可靠，以及良好的重現(xiàn)性。由于TLC需要穩(wěn)定的溶劑和標(biāo)準(zhǔn)供應(yīng)，以及嚴(yán)格的儲存條件，檢驗過程繁瑣，一般多用于霉菌毒素的仲裁檢驗。目前，我國國標(biāo)方法針對飼料中AFB1半定量、配合飼料中T-2毒素和DON、谷物和大豆中OTA仍然采用此方法進行檢測。

超快速液相色譜法（UPLC）是一項快速的分析分離技術(shù)，具有使用方便、靈敏度高和選擇性多等優(yōu)點[11]。Liu等[12]建立了一種超快速液相色譜與混合三重四極桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-QqQLIT-MS/MS）聯(lián)用方法，用于同時檢測白術(shù)中7種真菌毒素，檢測和定量限分別達到0.025～0.25μg/kg、0.100～0.50μg/kg。該方法具有分析時間短、耗時少、溶劑消耗少、靈敏度高等顯著優(yōu)勢，是復(fù)雜基質(zhì)中多類真菌毒素經(jīng)濟分析的首選方法，但檢測儀器包括多個模塊，價格昂貴，增加了維修難度和成本。

適配體是具有高特異性和靶標(biāo)結(jié)合親和力的單鏈DNA或RNA分子，可與多種目標(biāo)物質(zhì)高選擇性地結(jié)合，常用于檢測低分子量的物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域[13]。基于核酸適配體生物傳感器法具有易修飾、易合成、靈敏度高、易標(biāo)記、特異性高、分子質(zhì)量小、檢測成本低等優(yōu)勢[14]。Yue等[15]設(shè)計了一種新型光子晶體編碼懸浮陣列適配體，可同時量化和鑒定谷類樣品中的OTA和FB1，具有較廣的線性檢測范圍（OTA為0.01～1ng/mL，F(xiàn)B1為0.001～1ng/mL）和低檢測限（OTA為0.25pg/mL，F(xiàn)B1為0.16pg/mL）。在添加谷物樣品中，OTA的回收率為81.80%～116.38%，F(xiàn)B1的回收率為76.58%～114.79%，自然污染的谷物樣品中陽性檢測結(jié)果與經(jīng)典的酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果一致。

另外，還有一些正在快速發(fā)展的快檢技術(shù)，在檢測飼料中霉菌毒素方面有一定的研究潛力，表1介紹了5種新型快檢技術(shù)的檢測原理、檢測目標(biāo)物、精度及優(yōu)缺點。

表1 飼料中霉菌毒素主要快檢方法

上述介紹的方法近年來發(fā)展較快，并且在某些領(lǐng)域得到了初步應(yīng)用，有些甚至被列為國家標(biāo)準(zhǔn)，但其仍存在一定的局限性。例如，樣品制備方法復(fù)雜，測試結(jié)果取決于檢查員的經(jīng)驗和技術(shù)知識，適用性較差等。

3 基于光譜技術(shù)的霉菌毒素檢測方法

近年來，光譜分析技術(shù)應(yīng)用于霉菌毒素檢測得到越來越多的業(yè)界關(guān)注。光譜技術(shù)，包括近紅外反射（NIR）、拉曼光譜（RAM）和太赫茲時域光譜（THz-TDS）等技術(shù)，可通過單次掃描提供與真菌毒素成分及其結(jié)構(gòu)相關(guān)的定性定量信息，具有樣品制備簡單、測量快速、可原位測量等優(yōu)點。

3.1 近紅外光譜技術(shù)

現(xiàn)代光譜放大和增強技術(shù)的出現(xiàn)使近紅外和傅里葉變換紅外光譜能夠檢測和識別谷物和油籽中的真菌種類和真菌毒素。相關(guān)學(xué)者運用化學(xué)計量學(xué)方法，先后開展了小麥和玉米中真菌毒素的濃度預(yù)測研究[21,22]。

Carames等[23]掃描大麥樣品得到近紅外光譜數(shù)據(jù)，結(jié)合偏最小二乘判別分析（PLS-DA），以1 250μg/kg為閾值區(qū)分大麥的DON污染水平，并驗證了偏最小二乘回歸（PLS-R）預(yù)測大麥樣品中DON濃度的性能。結(jié)果表明，大麥中DON的校準(zhǔn)均方根誤差RMSEC=101.94μg/kg，預(yù)測均方根誤差RMSEP=160.76μg/kg。蔣雪松等[24]通過在線獲取自然感染赤霉病的小麥粉近紅外光譜數(shù)據(jù)，以1 000μg/kg為界限，分別用線性判別分析（LDA）與偏最小二乘回歸（PLS-R）建立小麥粉樣品的定性分析模型和定量分析模型，結(jié)果表明，小麥粉DON含量超標(biāo)與否的最佳識別率達87.69%，表明判別模型具有較好的精確度。但定量分析的結(jié)果不太理想，預(yù)測集相關(guān)系數(shù)只有0.688。張強等[25]采集了稻谷樣本的近紅外光譜信息，以徑向基函數(shù)（RBF）為核函數(shù)的支持向量機參數(shù)對采集到的光譜數(shù)據(jù)建模，用以測定儲存稻谷中AFB1含量。結(jié)果表明，該模型校正集決定系數(shù)為0.913，校正標(biāo)準(zhǔn)偏差和預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.186和1.267，由此可見，基于支持向量機算法建模可準(zhǔn)確檢測稻谷中AFB1；但近紅外吸收帶不能很好地分辨與其他成分重疊部分[26]。

3.2 拉曼光譜技術(shù)

拉曼光譜技術(shù)對非極性基團中共價鍵的對稱振動敏感。關(guān)于真菌毒素化合物及其衍生物的化學(xué)官能團，由于其對水的不敏感性和較少的重疊帶，拉曼光譜通過提供對真菌毒素的分子水平觀測，提供了比傳統(tǒng)光譜技術(shù)更有價值的定性定量信息。相關(guān)研究表明[27]，基于拉曼技術(shù)的谷物和油籽等產(chǎn)品中真菌毒素污染檢測準(zhǔn)確率較高。

楊雪倩等[28]以6個不同霉變等級的玉米樣品為研究對象，開展了拉曼光譜檢測研究，通過對原始拉曼光譜數(shù)據(jù)進行預(yù)處理和特征波長的提取，建立了玉米ZEN和AFB1含量的定量預(yù)測模型。結(jié)果表明，基于篩選的特征波長光譜信息所建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（BPNN）模型預(yù)測效果最佳。這為拉曼光譜技術(shù)用于霉變玉米真菌毒素的快速、準(zhǔn)確檢測提供了方法借鑒。目前，在拉曼光譜方面，特征提取建模方法有待進行深入研究，從而建立更加穩(wěn)定的定量預(yù)測模型。

3.3 太赫茲光譜技術(shù)

太赫茲光譜是20世紀(jì)80年代以來發(fā)展迅速的一項新的光譜技術(shù)，由于具有低能性、高分辨率和強穿透性等優(yōu)點被認(rèn)為是最有前途的檢測方法之一[29,30]。

廉飛宇等[31]從污染的玉米樣品中提取AFB1，然后利用太赫茲時域光譜系統(tǒng)采集信息，利用一種改進的多重D-S（Dempster-Shafer）證據(jù)理論對AFB1溶液的含量進行了識別，正確識別率達到94%。Ge等[32]將AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液配置在濃度范圍為1～50μg/mL和1～50μg/L的乙腈溶液中，用太赫茲光譜獲取數(shù)據(jù)，利用160個樣品的吸收光譜和線性/非線性濃度建立了回歸模型，對AFB1溶液定量分析，結(jié)果表明，偏最小二乘法（PLS）和主成分回歸（PCR）模型在1～50μg/mL的濃度范圍內(nèi)更為準(zhǔn)確，而支持向量機（SVM）和主成分分析-支持向量機（PCA-SVM）方法在1～50μg/L的濃度范圍內(nèi)更為準(zhǔn)確。Liu等[33]對大豆油中AFB1的濃度進行了定量預(yù)測，研究了檢測限，構(gòu)建了相關(guān)檢測模型，結(jié)果表明，模型能較好地區(qū)分2μg/kg以上AFB1濃度的大豆油和純大豆油，預(yù)測準(zhǔn)確率達90%以上。張成等[34]設(shè)計加工了圓形陣列的雙開口環(huán)超材料生物傳感器，并對AFB1和AFB2進行檢測，通過THz-TDS實驗和有限元模擬仿真，研究了AFB1和AFB2的透過圖譜在超材料結(jié)構(gòu)共振頻率下相對透過強度的偏移和中心共振頻率的偏移，結(jié)果模擬結(jié)果與實驗數(shù)據(jù)較為吻合，較好地揭示了沉積黃曲霉毒素膜的傳感響應(yīng)機理，該研究表明太赫茲超材料生物傳感器能夠以10～8mol量級實現(xiàn)AFB1和AFB2的高靈敏度、無標(biāo)記、無損檢測。太赫茲檢測方法在快速、準(zhǔn)確、無損實現(xiàn)AFB1定性定量檢測方面呈現(xiàn)出良好潛力。

4 總結(jié)與展望

本文介紹了飼料中霉菌毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)、傳統(tǒng)檢測方法和基于生物理化技術(shù)和光譜分析技術(shù)等新型檢測方法。通過分析各檢測方法特點，指出光譜分析技術(shù)以速度快、靈敏度高、安全無損等優(yōu)點迅速發(fā)展，未來具有更好的研究和應(yīng)用潛力。在未來的光譜檢測研究探索中，可以從下列幾點進行突破和完善：

（1）提高靈敏度。靈敏度是影響檢測結(jié)果的重要目標(biāo)，要實現(xiàn)精準(zhǔn)檢測，必須提高檢測靈敏度。除了提高檢測儀器本身性能之外，還要發(fā)展標(biāo)準(zhǔn)化樣品制備、數(shù)據(jù)采集、噪聲去除和數(shù)據(jù)分析建模方法，從全流程、多維度進行優(yōu)化，實現(xiàn)檢測靈敏度的提高。

（2）發(fā)展數(shù)據(jù)解析技術(shù)。實際的測試環(huán)境復(fù)雜多變，各種污染并存，實驗不確定性以及背景噪聲都會帶來數(shù)據(jù)的冗余，需要借助深度學(xué)習(xí)、人工智能等算法，開展大量測試數(shù)據(jù)的解析，構(gòu)建穩(wěn)定的數(shù)學(xué)模型，實現(xiàn)檢測穩(wěn)定性的提高。

（3）開發(fā)便攜式儀器。目前大多數(shù)霉菌毒素檢測是在實驗室進行的，飼料中霉菌毒素便攜式檢測設(shè)備還比較欠缺，未來實現(xiàn)實時檢測成為一種需求。研制便攜、高效、低價的小型光譜檢測儀是需要解決的一個關(guān)鍵問題。隨著霉菌毒素特定光譜數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建、算法提升和硬件設(shè)備成本的降低，檢測設(shè)備的便攜化已成為可能，應(yīng)加快研制。