李筱雯，黃俊程，喬同，劉爽，周祖濤，肖運(yùn)才

（1.湖北華大瑞爾科技有限公司，荊州 434000；2.湖北金旭生物科技有限公司，荊門 431800；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070）

奶牛乳房炎主要是由病原微生物侵入引起的奶牛乳腺組織炎性疾病，機(jī)械因素、環(huán)境因素、用藥不當(dāng)?shù)榷伎梢鹉膛Ｈ榉垦譡1]。當(dāng)病原體突破乳頭的防御時，它會進(jìn)入乳腺并向乳池移動，此時介導(dǎo)身體炎癥反應(yīng)的主要免疫細(xì)胞——巨噬細(xì)胞會首先接觸并識別入侵的病原體，然后產(chǎn)生大量趨化因子和一些炎性細(xì)胞因子，并進(jìn)一步誘導(dǎo)大量中性粒細(xì)胞在受感染的乳腺中積聚清除病原菌，同時釋放大量炎癥介質(zhì)和ROS，從而導(dǎo)致乳腺發(fā)生炎癥反應(yīng)（圖1），即乳房炎[2]。奶牛乳房炎臨床檢出較多的致病菌主要有無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，且這四種常見病原菌均產(chǎn)生了不同程度的耐藥性[3～5]；這會導(dǎo)致常規(guī)防治手段愈發(fā)難以見效，將來可能會面臨無藥可用的情況。

圖1 病原體引起奶牛房炎的發(fā)展路線圖[2]

美國國家乳房炎委員會根據(jù)乳房及乳汁有無肉眼變化，將乳房炎分為非臨床型乳房炎（即隱性乳房炎）和臨床型乳房炎。隱性乳房炎是奶牛發(fā)病率最高的乳房炎，發(fā)病率是臨床型乳房炎的20～40倍，其會導(dǎo)致產(chǎn)奶量緩慢降低、乳品質(zhì)不斷下降，給奶牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。在奶業(yè)發(fā)達(dá)的美國，奶牛養(yǎng)殖場每年的損失中有70%～80%是由隱性乳房炎引起產(chǎn)奶量下降造成的[1]，這一情況在我國可能更加嚴(yán)峻。

1 微生態(tài)制劑對奶牛乳房炎的防治作用

臨床上奶牛乳房炎的防治主要依賴抗生素，抗生素的濫用使牧場細(xì)菌出現(xiàn)嚴(yán)重耐藥性，還造成乳制品中抗生素大量殘留，嚴(yán)重威脅人類健康和環(huán)境安全[4]。許多研究表明，微生態(tài)制劑對奶牛乳房炎能起到很好的防治效果。最早，Greene等評估了乳酸菌的乳房內(nèi)輸注是否可以治愈患有亞臨床型乳房炎的奶牛，結(jié)果表明乳酸菌治療的治愈率為21.7%[7]，相較于用抗生素頭孢阿司匹林治療的治愈率73.7%存在較大差距，但這讓后面的研究者發(fā)現(xiàn)了益生菌在治療奶牛乳房炎上的潛力。隨后學(xué)者們相繼報道了微生態(tài)制劑在降低乳房炎奶牛牛乳中體細(xì)胞數(shù)[8～12]、調(diào)控乳汁[12]和腸道[13]微生物上的優(yōu)異表現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)其能顯著提高乳品質(zhì)[11,12]和產(chǎn)奶量[9]。楊靜等發(fā)現(xiàn)通過飼喂或乳房灌注微生態(tài)活菌制劑均能對奶牛隱性乳房炎有一定的防治作用，且灌注見效快于飼喂[14]。

微生態(tài)制劑在實(shí)際使用中會受到菌種、活菌含量、使用方法和試驗(yàn)樣本量等諸多因素的影響，本文將微生態(tài)制劑在奶牛乳房炎上的一些試驗(yàn)案例從菌種、活菌數(shù)、使用方法、樣本量和實(shí)際效果等方面進(jìn)行了歸納（表1），以供奶牛乳房炎微生態(tài)制劑的研發(fā)及現(xiàn)場使用時借鑒。如表1所示：王美秀等發(fā)現(xiàn)復(fù)合型微生態(tài)制劑可降低患隱性乳房炎奶牛乳中的體細(xì)胞數(shù)[8]，雖然試驗(yàn)樣本量較少，但也能展現(xiàn)微生態(tài)制劑對乳房炎的有效性；高鵬飛等使用復(fù)合乳酸菌制劑對不同地區(qū)牧場的2 624頭奶牛進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明復(fù)合乳酸菌制劑具有改善奶牛隱性乳房炎、降低牛乳中體細(xì)胞數(shù)以及提高奶產(chǎn)量等作用[9]；與此同時，楊慧娟等也對不同地區(qū)牧場的590頭奶牛利用復(fù)合乳酸菌制劑進(jìn)行防治試驗(yàn)，飼喂5～10d后，奶牛平均體細(xì)胞數(shù)顯著降低23.8%～62.8%[10]。丁昕穎等利用嗜乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌為主要菌種配制的微生態(tài)制劑可在一定程度上改善乳品質(zhì)，能夠有效降低乳中SCC[11]。Gao等也發(fā)現(xiàn)日糧中補(bǔ)充乳酸菌和酵母菌能改善乳品質(zhì)，顯著降低牛乳中體細(xì)胞數(shù)，恢復(fù)乳脂、乳蛋白和乳糖的含量，且乳酸菌對緩解乳房炎和改變?nèi)橹⑸锏男Ч糜诮湍妇鶾12]。

表1 不同微生物制劑對奶牛乳房炎的作用

2 微生態(tài)制劑在防治奶牛乳房炎上的作用機(jī)理

2.1 調(diào)節(jié)胃腸道菌群及代謝產(chǎn)物

乳房炎奶牛瘤胃中與炎癥相關(guān)的微生物群和代謝物的豐度發(fā)生了顯著變化[12]。腸道微生物群及其代謝產(chǎn)物，包括脂多糖（LPS）和短鏈脂肪酸（SCFAs），已被證明參與了乳房炎的發(fā)展[2]。Ma等通過定量PCR，比較了體細(xì)胞數(shù)低（＜3×105個細(xì)胞/mL）和高（＞1×106個細(xì)胞/mL）的奶牛的牛奶和糞便微生物特征，觀察到在乳酸菌屬和乳桿菌種水平上存在顯著差異；乳房炎奶牛乳房炎病原體（腸球菌、鏈球菌和葡萄球菌）普遍增加，乳酸桿菌屬（如L. salivarius,L. sakei,L. ruminis,L. delbrueckii,L. buchneri,L. acidophilus）匱乏；糞便中乳酸桿菌與牛奶微生物群落和 SCC 相關(guān)聯(lián)[15,16]；隨后他們通過糞菌移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)移植乳房炎患牛的糞便能夠引起小鼠乳房炎癥，益生菌干預(yù)能夠降低小鼠乳房炎癥程度[13]；LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，瘤胃中LPS過度會破壞瘤胃上皮，導(dǎo)致LPS進(jìn)入血液和肝臟功能受損，LPS經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入乳腺，增加血液屏障的通透性，導(dǎo)致乳房炎癥；而腸道微生物群產(chǎn)生的SCFAs對乳房炎癥反應(yīng)有保護(hù)作用，并有助于維持血乳屏障的功能[2]。這些結(jié)果表明益生菌能通過調(diào)節(jié)腸道菌群和代謝產(chǎn)物從而對乳房炎有一定的防治作用。

2.2 免疫調(diào)節(jié)

Beecher等將乳酸乳球菌DPC 3147的活菌注入健康牛乳腺，結(jié)果促進(jìn)了乳汁和血液中IL-1β和IL-8基因表達(dá)，刺激宿主發(fā)生免疫反應(yīng)[17]。Pellegrino等通過微生物學(xué)分析表明，在干奶期奶牛乳房內(nèi)接種乳酸菌能增加血液和牛奶中能夠識別金黃色葡萄球菌表位的IgG抗體[18]。日糧中添加乳酸菌和酵母菌能顯著降低乳汁中炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β濃度和髓過氧化物酶（MPO）及N-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性，KEGG分析發(fā)現(xiàn)乳酸菌處理組乳酸菌富集在與乳房炎和炎癥有關(guān)的免疫系統(tǒng)疾病的傳染病通路和免疫系統(tǒng)通路上[12]。鼠李糖乳桿菌能通過促進(jìn)TLR2和NOD1的協(xié)同作用和減弱不依賴于ASC的NLRP3炎癥小體激活，改善大腸桿菌引起的細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的破壞，限制有害的炎癥反應(yīng)[19]；Li等的研究證明鼠李糖乳桿菌GR-1能誘導(dǎo)PINK1/Parkin介導(dǎo)線粒體自噬，清除受損線粒體并減少ROS 產(chǎn)生和 NLRP3 炎性小體激活，減少大腸桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并能降低IL-1β、TNF-α等細(xì)胞因子水平；從而對大腸桿菌誘發(fā)的乳房炎具有預(yù)防和保護(hù)作用[20]。

以上這些研究均有力地證明了益生菌能夠增強(qiáng)患乳房炎機(jī)體的免疫力，但值得注意的是，不同益生菌菌株對牛乳房炎的免疫調(diào)節(jié)可能存在較大的差異。例如，F(xiàn)ukuyama等發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌CRL2074調(diào)節(jié)效果較好，它降低了IL-1α、IL-1β、MCP-1、IL-8和CXCL3的表達(dá)，而鼠李糖乳桿菌CRL2084減少了IL-1β、MCP-1和IL-8表達(dá)[21]；這是由于兩株菌對LPS誘導(dǎo)引起的Toll樣受體負(fù)調(diào)控因子調(diào)控的差異性所導(dǎo)致。CRL2074菌株預(yù)刺激BME細(xì)胞導(dǎo)致Toll樣受體的三個負(fù)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)上調(diào)，包括泛素編輯酶A20（也稱為腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3，TNFAIP3）、單免疫球蛋白IL-1單受體（SIGIRR）和Toll相互作用蛋白（Tollip），而CRL2084預(yù)刺激僅上調(diào)Tollip表達(dá)[21]。

2.3 抵抗病原微生物

益生菌通過產(chǎn)生細(xì)菌素和短鏈脂肪酸[22]、修復(fù)黏膜屏障[23,24]和競爭性抑制[25,26]等方式來發(fā)揮抑菌抗炎作用的機(jī)制已被廣泛認(rèn)可。為了解決奶牛乳房炎的問題，研究人員篩選到許多能夠抑制奶牛乳房炎病原菌尤其是金黃色葡萄球菌的益生菌[27～29]；Gao等對乳汁微生物測序分析發(fā)現(xiàn)，乳酸菌能夠抑制引起乳房炎的腸球菌和鏈球菌繁殖[12]。對于大腸桿菌引起的奶牛乳房炎，Wu等證明鼠李糖乳桿菌GR-1能夠減少大腸桿菌對牛乳腺管細(xì)胞（BMECs）的黏附[19]。

3 抗奶牛乳房炎微生態(tài)制劑的研發(fā)

為設(shè)計(jì)一款綠色安全無殘留、無耐藥性的治療乳房炎的產(chǎn)品，科研人員一直在不遺余力地探索。Espeche等為了設(shè)計(jì)一種預(yù)防牛乳房炎的益生菌產(chǎn)品，從不同奶牛場的初乳樣品中分離出了117株乳酸菌（LAB），并評估了它們的益生性，例如抑制物質(zhì)的產(chǎn)生、表面特性和胞外多糖（EPS）的產(chǎn)生；最終篩到了9株抑菌性能較佳的乳酸菌；并對其進(jìn)行了抗生素耐藥性和毒力因子等安全性評估[27]。Pellegrino等對牛奶中分離的12株乳酸菌的抗菌活性、對乳房炎致病菌的共聚集及自動抑制情況、對牛乳腺管上皮細(xì)胞（BTCEC）的黏附和生長動力學(xué)曲線進(jìn)行了評估，篩選到Lactococcus lactis subsp. lactisCRL 1655和Lactobacillus perolensCRL 1724兩株獨(dú)特的乳酸菌，能夠用于預(yù)防奶牛干奶期乳房炎的益生菌制劑中[28]。陳宏偉等從鮮奶和乳制品樣品中篩選獲得 5 株能夠抑制金黃色葡萄球菌生長的乳酸菌，并從菌株上清液中提取到細(xì)菌素，經(jīng)檢測其具有抑菌活性，抑菌效價分別為457IU/mL、1 023IU/mL、676IU/mL、1 862IU/mL和1 023IU/mL[29]。

抗奶牛乳房炎微生態(tài)制劑的研發(fā)不僅僅限于飼料添加劑。在擠奶前后對奶頭進(jìn)行消毒是控制奶牛群乳房炎的關(guān)鍵一環(huán)，目前該消毒通常用的是化學(xué)消毒劑，會存在殘留風(fēng)險[27]；研究人員為了解決這一問題，另辟蹊徑，嘗試用乳酸菌乳頭噴霧劑來替代化藥消毒劑。Alawneh等研究表明乳酸菌噴霧劑與碘噴霧劑對奶牛乳汁體細(xì)胞數(shù)的影響遵循類似的趨勢，且與碘噴霧劑處理的奶牛相比，用乳酸菌產(chǎn)品處理的奶牛乳頭末端評分和平均體細(xì)胞數(shù)增加的幾率更低[30]。

4 展望

目前，飼料端禁抗、養(yǎng)殖端減抗等政策一步步落地實(shí)施，2021年10月21日，為切實(shí)加強(qiáng)獸用抗菌藥綜合治理，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)牧發(fā)（2021）31號文件制定了《全國獸用抗菌藥使用減量化行動方案（2021—2025年）》，這一政策將極大限制奶牛乳房炎抗菌素用藥量，致使奶牛場的生產(chǎn)特別是針對奶牛乳房炎的替抗已迫在眉睫。微生態(tài)制劑在奶牛乳房炎防治上具有巨大的潛力，無疑是替代抗生素防治奶牛乳房炎的有效選擇之一。對于微生態(tài)添加劑生產(chǎn)企業(yè)來說，如何研制出更能角逐抗奶牛乳房炎的微生態(tài)制劑愈加重要。