李 濤，劉曉艷，王楠楠，楊紹青，韓 冬，江正強,*

（1.中國輕工業(yè)食品生物工程重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.北京工商大學食品與健康學院，北京 100048）

衰老是指器官和組織的功能隨時間變化而衰退，是導致許多疾病的最大危險因素，包括一些神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病[1]。構(gòu)成細胞和組織的大分子（如核酸、脂類、糖和蛋白質(zhì)）受到超氧化物和其他自由基不同程度的氧化會引起氧化損傷，造成機體多器官、多系統(tǒng)的功能減退，進而導致疾病和衰老[2]。因此，氧化應激被認為是衰老的一種早期現(xiàn)象。近年來，人們不斷尋求具有減緩氧化應激損傷作用的天然活性成分[3]。

益生元可被腸道微生物代謝，產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，特別是短鏈脂肪酸進入腸道會影響宿主生理健康[4]。研究表明，從果蔬、海藻、菌菇類和中藥材中提取的多糖可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)活力、提高機體保護性免疫反應、激活衰老相關蛋白信號通路等達到延緩衰老的作用[5-7]。從藻類石莼和滸苔中提取的寡糖可通過減輕氧化損傷、保護腦神經(jīng)元、降低炎癥因子水平和調(diào)節(jié)凋亡相關基因等抑制小鼠衰老[8]。牟婕等[9]研究表明褐藻膠寡糖能夠抑制p53/p21信號通路，從而上調(diào)衰老心肌細胞自噬水平延緩其衰老。

香豆（Trigonella foenum-graecumL.）屬豆科一年生草本植物，在北非、地中海國家及印度、加拿大廣泛種植。香豆中含有黃酮類化合物、生物堿、氨基酸、香豆素、維生素、皂苷等生物活性成分[10]。同時，香豆中含有約26.8%可溶性纖維，即香豆膠，化學結(jié)構(gòu)上主要為半乳甘露聚糖[11]，其中甘露糖和半乳糖的質(zhì)量比為1∶1[12]。半乳甘露聚糖是直線狀(1,4)-β-D型甘露糖骨干于6-連接點連接到α-D型半乳糖的多糖。動物實驗證實攝入香豆膠中的半乳甘露聚糖可改善脂質(zhì)、降低血壓及血清膽固醇水平，促進腸道內(nèi)雙歧桿菌增殖、維持腸內(nèi)菌群平衡[13]。與香豆膠相比，利用甘露聚糖酶水解香豆膠制備鏈長較短、溶液黏度較低的甘露聚糖水解物可提升其益生功效。研究表明β-甘露聚糖酶水解槐豆膠、田菁膠和魔芋膠等制備的甘露寡糖能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)活力、抑制慢性炎癥和氧化應激、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和腸道菌群等[14-16]。甘露聚糖酶部分水解瓜爾豆膠的產(chǎn)物可通過調(diào)節(jié)氧化應激和恢復腸道微生物群改善D-半乳糖誘導的大鼠衰老[17]。國內(nèi)外對香豆膠的功能研究多集中于促消化、助泌乳、抗菌、抗氧化、抗糖尿病、抗癌、保肝、護神經(jīng)等藥理作用[18-20]，鮮見部分水解香豆膠抗衰老作用的報道。

本研究利用β-甘露聚糖酶水解香豆膠制備部分水解香豆膠[21]，建立自然衰老模型觀察其抗衰老作用，并初步探討其抗衰老機理，旨在為研發(fā)天然抗衰老食品配料提供新資源和研究參考，為進一步開發(fā)和利用香豆膠提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

60只7～8 月齡雄性SPF級C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量為27～35 g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011。普通維持飼料，含有碳水化合物50%（質(zhì)量分數(shù)，后同）、脂肪10%、蛋白質(zhì)20%，由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0003。

香豆膠 北京瓜爾潤科技股份有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒 南京建成生物科技公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）、乳酸、晚期糖基化終末產(chǎn)物、端粒酶酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 北京華英生物技術研究所；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗體、神經(jīng)元標志物（neuronal nuclei，NeuN）抗體、腫瘤抑制蛋白p53、腫瘤抑制蛋白p16 英國Abcam公司；山羊抗兔IgG抗體 艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；RNA 9767提取試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix RR036A和TB Green Premix ExTaqII試劑盒日本Takara公司； BCA蛋白檢測試劑盒 北京拜爾迪生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

華衛(wèi)德朗DR-200BS酶標儀 無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司；Ci-S倒置顯微鏡 日本尼康株式會社；ABX pentra 60全自動血細胞分析儀 堀場醫(yī)療（法國）有限公司；BM-19AY激光共聚焦顯微鏡 上海彼愛姆光學儀器制造有限公司；CFX系列實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerase chain reaction，q-PCR）儀伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；自動化學發(fā)光成像儀 上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 部分水解香豆膠的制備

稱取香豆膠100 g，加入去離子水常溫下配成質(zhì)量分數(shù)為10%的香豆膠溶液。然后加入β-甘露聚糖酶（1 000 U/g），35 ℃水解12 h，沸水浴20 min滅酶。酶解液經(jīng)10 000 r/min離心5 min，取上清液真空冷凍干燥，得到部分水解香豆膠的樣品（水解率為82.2%，純度≥90%）。其成分為聚合度在2～6之間的甘露寡糖（占35.6%）和大量聚合度大于6的甘露聚糖；平均聚合度不高于10，重均分子質(zhì)量為1.8h103Da[21]。

1.3.2 動物分組及處理

C57BL/6J小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（25f5）℃、相對濕度（50f10）%、燈光始終12 h明暗交替（7∶00至19∶00為白晝時間、19∶00至次日7∶00為黑夜時間）。所有小鼠均飼喂普通維持飼料，飲用水為蒸餾水，保持小鼠自由飲水及攝食。經(jīng)過2周適應期后，將小鼠隨機分為3 組（n＝20）：自然衰老組、陽性對照藥物干預組（二甲雙胍）、部分水解香豆膠干預組。為了最小化其他因素對小鼠壽命的影響，本實驗將樣品添加在水中，二甲雙胍添加量為0.3 g/L，部分水解香豆膠添加量為3 g/L。

飼養(yǎng)期間每周同一時間稱量小鼠體質(zhì)量，并進行衰老評分，具體評分標準為：對小鼠外觀衰老（皮毛粗糙度、脫毛程度）、組織病變（皮膚潰病、眼周損傷）、體態(tài)衰老（脊柱后凸）、反應退化（反應性）程度6 項指標進行綜合評價，每項指標打分范圍為0～10 分。根據(jù)嚴重程度不同，客觀評分，分值越高則老化度越高[22]。

實驗周期12 個月結(jié)束后小鼠禁食16 h，摘出眼球，收集血液樣品，3 500 r/min、4 ℃離心15 min后分離血清，保存于－80 ℃冰箱。快速解剖取出大腦和肝臟等組織，用生理鹽水清洗組織。用濾紙吸干后，稱質(zhì)量。部分樣品固定于體積分數(shù)10%福爾馬林溶液中，保存在4 ℃冰箱，用于形態(tài)觀察；部分樣品凍存于－80 ℃冰箱，用于后續(xù)指標分析。

1.3.3 組織形態(tài)觀察

解剖小鼠，取大腦、肝臟、腎臟和結(jié)腸組織，放入10%中性福爾馬林溶液進行固定，固定48 h后進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色切片，用倒置顯微鏡觀察HE染色組織切片。

1.3.4 代謝產(chǎn)物水平測定

利用全自動血細胞分析儀測定血清中的代謝產(chǎn)物水平，代謝產(chǎn)物具體包括肌酐、清蛋白、尿素氮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及膽固醇。

1.3.5 衰老標志物水平測定

通過ELISA試劑盒測定小鼠血清中衰老標志物水平，標志物包括一氧化氮（NO）、乳酸、晚期糖基化終末產(chǎn)物、端粒酶。

1.3.6 抗氧化能力測定

取小鼠血清，按照1∶4（V/V）的比例加入生理鹽水，混勻后2 500 r/min離心10 min，取上清液待用。T-AOC、MDA含量和CAT、GSH-Px活力的測定均嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3.7 免疫熒光檢測

小鼠大腦組織經(jīng)體積分數(shù)4%多聚甲醛溶液固定后，進行石蠟包埋、切片、脫蠟和抗原修復，用5%（質(zhì)量分數(shù)，下同）奶粉室溫封閉處理1 h。采用1∶100稀釋BDNF和NeuN抗體室溫避光處理1 h。用1%奶粉清洗3 遍，每次10 min。將山羊抗兔IgG抗體按稀釋比1∶200于5%奶粉中稀釋，室溫避光處理1 h。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）室溫避光清洗3 遍，每次10 min。用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染液處理15 min，PBS室溫避光清洗1 遍，加一滴甘油，用蓋玻片覆蓋于載玻片上，指甲油密封蓋玻片和載玻片間的縫隙，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。通過Image J軟件分析綠色熒光可分別得出大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量、海馬CA1區(qū)BDNF陽性細胞率。

1.3.8 p53/p21/p16信號通路相關基因和蛋白表達分析

使用Takara RNA 9767提取試劑盒，從大腦、肝臟組織中提取總RNA。使用PrimeScriptTMRT Master Mix RR036A試劑盒對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。使用TB Green Premix ExTaqII試劑盒，以cDNA作為模板，分析mRNA表達水平。qPCR程序如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)；72 ℃ 30 s。55～95 ℃逐步獲得熔解曲線。在通過基因β-actin標準化后，使用2－ΔΔCt比較方法分析靶基因的表達量。靶基因的引物設計見表1。

表1 qPCR分析的靶基因引物序列Table 1 Primer sequences of target gene used for quantitative realtime polymerase chain reaction

冷凍肝臟組織使用RIPA裂解液裂解均質(zhì)，然后離心收集上層清液。采用BCA蛋白檢測試劑盒定量檢測蛋白質(zhì)量濃度。用質(zhì)量分數(shù)12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳將等量的蛋白樣品（20 μg）分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜上。然后，膜與一抗（腫瘤抑制蛋白p53、p16，1∶1 000）在4 ℃下過夜。用洗滌緩沖液（TBST）洗滌后，用二抗（1∶5 000）孵育1 h，用自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)對蛋白條帶灰度進行定量。以β-actin作為內(nèi)參。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS statistics 23.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準差。組間數(shù)據(jù)的顯著性分析采用單因素方差分析（One-way ANOVA）中的Tukey’s多重比較進行。P＜0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著差異，P＜0.01表示數(shù)據(jù)具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 部分水解香豆膠對衰老小鼠體質(zhì)量、組織質(zhì)量和存活率的影響

由圖1A可知，二甲雙胍長時間干預可引起衰老小鼠體質(zhì)量增加，但差異不顯著（P＞0.05）。部分水解香豆膠干預5 個月過程中對衰老小鼠體質(zhì)量無顯著影響，而干預6～8 個月體質(zhì)量顯著增加（P＜0.05）；超過9 個月后，隨著干預時間的延長，部分水解香豆膠干預組小鼠體質(zhì)量逐漸降低。相比自然衰老組，部分水解香豆膠和二甲雙胍干預組衰老小鼠的腎臟及脂肪組織的質(zhì)量均降低。同時，經(jīng)部分水解香豆膠處理后，大腦、心臟、肝臟和脾臟的質(zhì)量分別增加2.0%、21.4%（P＜0.01）、4.2%和11.1%（圖1B）。由圖1C可知，二甲雙胍和部分水解香豆膠干預組衰老小鼠的存活率均高于自然衰老組，在第12個月時分別提高了33.3%和25.0%。

圖1 部分水解香豆膠對衰老小鼠體質(zhì)量（A）、組織質(zhì)量（B）和存活率（C）的影響Fig. 1 Effects of partially hydrolyzed fenugreek gum on body mass (A),visceral tissue mass (B) and survival rate (C) of aging mice

2.2 部分水解香豆膠對衰老小鼠衰老評分的影響

如表2～4所示，二甲雙胍和部分水解香豆膠干預衰老小鼠9 個月的過程中，自然衰老小鼠與二甲雙胍和部分水解香豆膠干預組小鼠在反應性、皮毛粗糙度、脫毛程度、皮膚潰病、眼周損傷和脊柱后凸方面均沒有顯著變化。而干預12 個月后（表5），與自然衰老組小鼠相比，二甲雙胍和部分水解香豆膠干預均能降低衰老小鼠的衰老程度，其中部分水解香豆膠干預組小鼠的反應性、脫毛程度和脊柱后凸顯著改善（P＜0.05）。

表2 部分水解香豆膠干預3 個月對衰老小鼠衰老評分的影響Table 2 Effect of partially hydrolyzed fenugreek gum treatment for three months on aging scores of aging mice

表3 部分水解香豆膠干預6 個月對衰老小鼠衰老評分的影響Table 3 Effect of partially hydrolyzed fenugreek gum treatment for six months on aging scores of aging mice

表4 部分水解香豆膠干預9 個月對衰老小鼠衰老評分的影響Table 4 Effect of partially hydrolyzed fenugreek gum treatment for nine months on aging scores of aging mice

表5 部分水解香豆膠干預12 個月對衰老小鼠衰老評分的影響Table 5 Effect of partially hydrolyzed fenugreek gum treatment for 12 months on aging scores of aging mice

2.3 部分水解香豆膠對衰老小鼠組織形態(tài)的影響

由圖2A可知，自然衰老組小鼠大腦海馬CA1區(qū)錐體細胞（黑色箭頭）排列疏松散亂，部分細胞出現(xiàn)核膜皺縮與結(jié)構(gòu)不清晰的現(xiàn)象，同時部分細胞形狀發(fā)生改變，呈現(xiàn)不規(guī)則齒狀形態(tài)。與自然衰老小鼠相比，部分水解香豆膠干預組錐體細胞有3～4 層，排列整齊，細胞形態(tài)較完整，核仁清晰；二甲雙胍干預組錐體細胞有4～5 層，排列更為整齊緊密，細胞結(jié)構(gòu)形態(tài)完整，神經(jīng)細胞數(shù)量增多，細胞凋亡及核固縮現(xiàn)象極少。肝臟組織細胞的破壞與減少是機體衰老的癥狀之一。自然衰老小鼠肝細胞排列松散，細胞質(zhì)中有不同大小的液泡，出現(xiàn)明顯的炎性細胞浸潤現(xiàn)象。然而，經(jīng)過二甲雙胍和部分水解香豆膠處理后，肝臟組織形態(tài)學明顯改善，其中肝細胞變得密集，表現(xiàn)出完整的細胞結(jié)構(gòu)和清晰的細胞邊界，未出現(xiàn)炎癥細胞浸潤。腎臟是人體的解毒器官，自然衰老小鼠腎組織病理學分析顯示腎小球明顯萎縮，腎近曲小管球囊增寬、上皮細胞脫落，同時出現(xiàn)腎水腫現(xiàn)象。與自然衰老小鼠相比，二甲雙胍處理明顯改善了腎臟組織形態(tài)；部分水解香豆膠干預抑制了腎小球萎縮和腎近曲小管球囊增寬，腎水腫現(xiàn)象減弱。

由圖2B可知，自然衰老組小鼠結(jié)腸絨毛長度縮短，出現(xiàn)明顯皺縮，且數(shù)量稀疏。與自然衰老小鼠相比，部分水解香豆膠干預組的小鼠結(jié)腸絨毛整齊、稠密，絨毛長度和肌層厚度極顯著增加（P＜0.01），分別增加了32.2%和54.1%；同時，部分水解香豆膠干預極顯著降低了自然衰老小鼠結(jié)腸組織隱窩深度（P＜0.01）（圖2C）。綜上所述，部分水解香豆膠能夠改善衰老小鼠的組織形態(tài)。

圖2 部分水解香豆膠對衰老小鼠組織形態(tài)的影響Fig. 2 Effect of partially hydrolyzed fenugreek gum on tissue morphology of aging mice

2.4 部分水解香豆膠對衰老小鼠血清指標的影響

由表6可知，與自然衰老組相比，部分水解香豆膠干預降低了小鼠血清中肌酐、尿素氮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和膽固醇水平，分別降低了40.1%、15.7%、29.5%（P＜0.01）和20.0%（P＜0.05）。同時，部分水解香豆膠干預組小鼠血清中清蛋白質(zhì)量濃度顯著增加（P＜0.05）。與自然衰老組相比，部分水解香豆膠干預組小鼠血清中一氧化氮、乳酸和晚期糖基化終末產(chǎn)物水平分別下降了26.2%、29.5%（P＜0.05）、47.8%（P＜0.01）；端粒酶活力則顯著增加了65.1%（P＜0.05）。與自然衰老組相比，部分水解香豆膠干預12 個月后，衰老小鼠血清中T-AOC、CAT活力及GSH-Px活力分別提高了78.1%（P＜0.05）、122.9%（P＜0.01）和2.7%；與自然衰老組相比，二甲雙胍和部分水解香豆膠干預組MDA濃度分別降低31.5%（P＜0.05）和40.3%（P＜0.01）。

2.5 部分水解香豆膠對衰老小鼠腦組織神經(jīng)元數(shù)量和海馬CA1區(qū)BDNF表達的影響

如圖3A1所示，與自然衰老小鼠相比，部分水解香豆膠顯著降低了衰老小鼠大腦皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的損傷，神經(jīng)元數(shù)量分別增加了78.7%（P＜0.01）和50.0%（圖3A2）。如圖3B所示，與自然衰老小鼠相比，二甲雙胍和部分水解香豆膠干預后小鼠海馬CA1區(qū)中BDNF陽性細胞率分別增加了144.6%（P＜0.01）和85.7%（P＜0.05）。結(jié)果表明部分水解香豆膠可通過上調(diào)衰老小鼠海馬CA1區(qū)中BDNF表達促進其神經(jīng)元的生長發(fā)育。

表6 部分水解香豆膠對衰老小鼠血清指標的影響Table 6 Effect of partially hydrolyzed fenugreek gum on serum metabolite indexes of aging mice

圖3 部分水解香豆膠對衰老小鼠腦組織神經(jīng)元數(shù)量和海馬CA1區(qū)BDNF表達的影響Fig. 3 Effect of partially hydrolyzed fenugreek gum on the number of neurons in brain tissue and BDNF expression in the hippocampus CA1 area of aging mice

2.6 部分水解香豆膠對衰老小鼠衰老相關基因和蛋白表達的影響

如圖4A所示，與自然衰老小鼠相比，部分水解香豆膠抑制了大腦組織中p16、p21和p53mRNA的表達。如圖4B所示，部分水解香豆膠干預會下調(diào)衰老小鼠肝臟組織中p16、p21和p53mRNA的表達，降低量分別為16.8%（P＜0.05）、13.5%和19.1%（P＜0.05）。如圖4C所示，部分水解香豆膠干預顯著下調(diào)衰老小鼠肝臟組織中p16和p53蛋白的表達，降低量分別為24.0%（P＜0.05）和69.3%（P＜0.01）。結(jié)果表明，部分水解香豆膠抑制了衰老小鼠大腦、肝臟組織中p53/p21/p16信號通路的表達。

圖4 部分水解香豆膠對衰老相關基因和蛋白表達的影響Fig. 4 Effect of partially hydrolyzed fenugreek gum on gene and protein expression related to aging

3 討 論

大量研究表明，衰老會增加機體氧化應激與組織器官損傷，降低端粒酶活性，加劇神經(jīng)細胞老化或凋亡等[14,23]。目前已經(jīng)證明多種益生元具有抗衰老的作用[5-9]。研究表明魔芋來源的甘露寡糖具有抑制氧化應激反應、改善組織形態(tài)及調(diào)控脂代謝等作用[24]。香豆膠含有豐富的半乳甘露聚糖，本實驗利用β-甘露聚糖酶將香豆膠水解為部分甘露聚糖水解物，探討部分水解香豆膠對自然衰老小鼠的抗衰老作用及其分子機制。

老鼠在衰老過程中會逐漸表現(xiàn)出四肢無力、反應性下降、毛色發(fā)黃、無光澤甚至脫毛現(xiàn)象[25]。本研究表明，膳食補充部分水解香豆膠增加了衰老小鼠的存活率（圖1C），且明顯改善其反應性、脫毛程度和脊柱后凸（表5）。由此可知，部分水解香豆膠對于減輕小鼠衰老特征發(fā)揮了積極的干預作用，具有一定的抗衰老潛力。衰老是一個涉及器官損傷的過程[8]。部分水解香豆膠抑制了脂肪組織堆積（圖1B），改善了衰老小鼠大腦、肝臟、腎臟和結(jié)腸組織的形態(tài)（圖2）。同時，小鼠在衰老狀態(tài)下組織器官的損傷導致其血清中肌酐、尿素氮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和膽固醇水平顯著升高[26]，而經(jīng)部分水解香豆膠飲食干預后其水平均降低（表6）。這可能由于水解物中的甘露寡糖成分調(diào)節(jié)了機體內(nèi)細胞代謝和抑制了核因子（nuclear fator，NF）-κB信號通路減輕器官的炎癥反應進而保護了其組織器官[27]。研究表明魔芋來源的甘露寡糖直接和參與腸肝信號轉(zhuǎn)導的宿主細胞相互作用，間接影響膽固醇等代謝產(chǎn)物[28]。

衰老過程伴隨著自由基的過量產(chǎn)生和晚期糖基化終末產(chǎn)物的緩慢形成[29]。過多的晚期糖基化終末產(chǎn)物會進一步導致NO的產(chǎn)生；NO與自由基相互作用，形成細胞毒性的“自由基-過氧化物亞硝酸鹽”復合物，引起自由基介導的神經(jīng)損傷和衰老[30]。本研究中，部分水解香豆膠組小鼠血清中NO和晚期糖基化終末產(chǎn)物水平均顯著下降（表6），這表明部分水解香豆膠可通過調(diào)節(jié)機體內(nèi)衰老標志物含量來抑制衰老。這與Pan Wenjuan等[31]研究發(fā)現(xiàn)金福菇多糖可以降低肝臟組織中晚期糖基化終末產(chǎn)物的含量進而改善小鼠的神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的結(jié)果相一致。正常機體具有一個完整的抗氧化酶系統(tǒng)，包括CAT和GSH-Px等，可保持自由基平衡[32]；在衰老狀態(tài)下，機體抗氧化酶系統(tǒng)受到破壞導致機體抗氧化能力減弱，過量自由基誘發(fā)脂質(zhì)過氧化損傷，進而促使細胞甚至器官的損傷[5]。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其含量也是細胞膜氧化損傷的指標，可以反映機體脂質(zhì)過氧化的程度[33]。本研究表明，部分水解香豆膠可以極顯著降低衰老小鼠血清中的MDA含量，而顯著增加CAT和GSH-Px活力（表6）。與Liu Xiaoyan等[17]報道部分瓜爾豆膠水解物對衰老小鼠抗氧化影響的研究結(jié)果相比，部分水解香豆膠具有更好的抗氧化作用。研究認為，魔芋來源的甘露寡糖能夠維持機體內(nèi)活性氧的動態(tài)平衡，提高免疫性能，從而提高抗氧化能力[34]。海馬體是控制學習和記憶等高級神經(jīng)活動的重要區(qū)域。與其他器官相比，大腦對氧化損傷更為敏感，氧化損傷可能導致海馬神經(jīng)元變性、DNA損傷和大腦衰老[35]。BDNF信號通路的激活可促進海馬神經(jīng)元細胞的增殖，抑制其凋亡[36]。本研究表明，部分水解香豆膠干預顯著增加衰老小鼠海馬CA1區(qū)BDNF的表達水平，降低其神經(jīng)元的損傷（圖3）。這些作用可能是通過部分水解香豆膠增強其抗氧化酶活性，減少氧化損傷來介導的。

研究表明，氧化損傷的產(chǎn)生激活了p53/p21/p16信號通路，導致細胞周期阻滯和衰老[37]。本研究中，部分水解香豆膠顯著提高衰老小鼠體內(nèi)抗氧化能力，降低體內(nèi)氧化損傷。為了進一步明確部分水解香豆膠抑制衰老的潛在機制，繼續(xù)探討了部分水解香豆膠對p53/p21/p16信號通路中p53、p21、p16基因和p53、p16蛋白表達的影響。衰老會引起p53、p21或p16信號通路的激活，進而抑制細胞周期蛋白依賴性激酶來干擾細胞周期進程[38]，并誘導腫瘤抑制功能以及與衰老相關基因的表達[39]。p53、p21和p16蛋白的過表達可導致細胞衰老[40]。本研究證明了部分水解香豆膠可顯著抑制衰老誘發(fā)的p53/p21/p16信號通路中相關基因和蛋白的過度表達（圖4）。p53蛋白受到刺激后迅速激活p21基因阻止細胞周期進程；p21蛋白間接激活p16基因的表達，協(xié)同調(diào)節(jié)細胞周期、凋亡和DNA修復[41]。這表明部分水解香豆膠對小鼠體內(nèi)p53/p21/p16信號通路的抑制降低了衰老誘發(fā)的神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)量。因此，部分水解香豆膠延緩衰老的機制可能是其通過提高抗氧化能力而抑制了衰老小鼠p53/p21/p16信號通路，進而調(diào)節(jié)腦內(nèi)具有神經(jīng)營養(yǎng)作用因子的表達和神經(jīng)元細胞凋亡，從而達到延緩機體衰老的效果。

4 結(jié) 論

本研究在行為表現(xiàn)、血清代謝及抗氧化水平、神經(jīng)元損傷和相關衰老基因和蛋白表達水平等方面對部分水解香豆膠延長小鼠壽命的潛在機制進行了初步探究。結(jié)果表明，部分水解香豆膠延緩了小鼠的衰老進程，可能與其能夠降低衰老小鼠體內(nèi)乳酸和NO的釋放、增強端粒酶活性和抗氧化能力、修復組織病理學損傷、提高腦內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達、抑制p53/p21/p16信號通路基因和蛋白的表達有關。部分水解香豆膠有望作為膳食補充劑的配料，發(fā)揮抗衰老的功能活性。