張慧瑩，曾麗萍，任運(yùn)紅，杜 冰,2，黎 攀,2,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

山藥（Dioscorea oppositifoliaL.），又名薯蕷、土薯、淮山等，是我國傳統(tǒng)的藥食同源植物，味甘性平，入肺、脾、腎經(jīng)，常用于治療脾虛食少，泄瀉久痢等?，F(xiàn)代研究表明，山藥含有多糖、皂苷、糖蛋白、尿囊素等多種生物活性成分[1]，其中山藥多糖是公認(rèn)的主要活性成分之一，它具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)血糖、保護(hù)肝臟等藥理功能[2-4]。楊愷環(huán)[5]將不同濃度的山藥多糖溶液作用于結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29，發(fā)現(xiàn)山藥多糖對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29呈現(xiàn)出濃度依賴性和時(shí)間依賴性的抗增殖作用，證實(shí)了山藥多糖的體外抗結(jié)腸癌活性。本課題組前期也從山藥中分離出一種水溶性多糖CYP-1，發(fā)現(xiàn)其能顯著抑制結(jié)腸炎小鼠炎癥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平和促炎細(xì)胞因子的分泌，并能顯著調(diào)節(jié)結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群，從而改善結(jié)腸炎，證實(shí)了山藥多糖的體內(nèi)抗結(jié)腸炎活性[6]。

山藥極易發(fā)生褐變，護(hù)色處理是山藥加工過程的必要步驟。目前加工山藥時(shí)常用的護(hù)色處理是硫磺熏蒸，硫磺熏蒸不僅能抑制酶促褐變，還能抑制非酶褐變。盡管采用硫磺熏蒸能取得優(yōu)良的護(hù)色效果，但極可能引發(fā)殘硫量超標(biāo)的問題，這不僅會(huì)影響產(chǎn)品品質(zhì)，甚至?xí)鹗称钒踩珕栴}[7-8]。乳酸芽孢桿菌DU-106是一種新型益生菌，具有高產(chǎn)左旋乳酸的能力[9]。本課題組前期研究表明，利用乳酸芽孢桿菌DU-106發(fā)酵液對(duì)山藥進(jìn)行浸泡處理也能達(dá)到優(yōu)良的護(hù)色效果[8]。然而，不同的護(hù)色處理可能會(huì)影響山藥多糖的活性[10]，采用乳酸芽孢桿菌DU-106發(fā)酵液對(duì)山藥進(jìn)行護(hù)色這一新工藝會(huì)是否會(huì)影響其多糖的抗結(jié)腸炎活性目前仍不清楚。葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）能造成小鼠結(jié)腸上皮損傷、內(nèi)毒素入血、結(jié)腸水腫和過度炎癥，與臨床潰瘍性結(jié)腸炎病癥類似，是最常見用于構(gòu)建結(jié)腸炎癥模型的物質(zhì)[11]。本研究以DSS為誘導(dǎo)劑構(gòu)建小鼠急性結(jié)腸炎模型，評(píng)估乳酸芽孢桿菌DU-106發(fā)酵液護(hù)色山藥多糖的抗結(jié)腸炎活性并研究其機(jī)制，為山藥加工處理及含山藥多糖功能食品的開發(fā)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠（14～16 g，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2018-0137） 廣東質(zhì)量監(jiān)督檢察院。

飼料（標(biāo)號(hào)：2019-05073） 廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；乳酸芽孢桿菌DU-106（篩選自傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪）華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新資源食品與功能性原料評(píng)價(jià)及研究中心；山藥（由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院杜冰教授鑒定，保藏于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新資源食品與功能性原料評(píng)價(jià)及研究中心，保藏編號(hào)：2018-Du728） 廣州五山市場(chǎng)。

葡聚糖硫酸鈉 美國MP公司；糞便隱血試劑盒、蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE） 上海源葉生物科技有限公司；乙醇 天津富宇精細(xì)化工有限公司；二甲苯 廣州化學(xué)試劑廠；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒 深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HistoStar組織包埋機(jī)、HM340E石蠟切片機(jī)、Gemini AS自動(dòng)染片機(jī)、CTM 6自動(dòng)封片機(jī) 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Lab.A1光學(xué)生物顯微鏡 德國卡爾·蔡司股份公司；DHP-600電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；FA2004A分析天平 上海精天電子儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 山藥處理及多糖提取

挑選大小一致、無創(chuàng)傷、無病蟲斑的山藥塊莖，用清水洗凈、切成2 mm左右厚的薄片，參考本課題組前期開發(fā)的護(hù)色方法[8]，將山藥分別浸泡于清水和體積分?jǐn)?shù)10%的乳酸芽孢桿菌DU-106發(fā)酵液中護(hù)色處理1 h，再置于70 ℃烘箱中烘干，得干山藥片。采用水提醇沉法[8]提取干山藥片中的粗多糖，粗多糖中清水護(hù)色的山藥多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為79.63%，乳酸芽孢桿菌DU-106發(fā)酵液護(hù)色的山藥多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為79.50%。

1.3.2 構(gòu)建DSS誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心管理制度執(zhí)行。40只雄性C57BL/6J小鼠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境（（20f4）℃、12 h的光照/黑暗循環(huán)交替）中適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)抽取10只為對(duì)照組，剩余30只為模型組。所有實(shí)驗(yàn)小鼠給予充足的飼料，對(duì)照組小鼠自由飲用蒸餾水，模型組小鼠自由飲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3% DSS溶液，蒸餾水及溶液每2 d更換一次，連續(xù)7 d。每天對(duì)小鼠稱質(zhì)量，并在第7天（造模后）參考張金玲等[12]的方法對(duì)小鼠進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）測(cè)定，DAI由小鼠體質(zhì)量變化程度、小鼠糞便性狀及糞便隱血評(píng)分3 項(xiàng)組成，其中糞便隱血評(píng)分由糞便隱血試劑盒測(cè)定，具體方法參照試劑盒說明書。

1.3.3 干預(yù)結(jié)腸炎小鼠及樣本采集

造模成功的小鼠隨機(jī)分為3 組：自然恢復(fù)組（DSS）、清水護(hù)色多糖組（CYH）、發(fā)酵液護(hù)色多糖組（CYF），每組10只，分別灌胃0.2 mL的蒸餾水、0.2 mL 300 mg/kgmb清水護(hù)色的山藥多糖溶液、0.2 mL 300 mg/kgmb乳酸芽孢桿菌DU-106發(fā)酵液護(hù)色的山藥多糖溶液，劑量設(shè)置參考課題組前期研究[6]；對(duì)照組（CD）灌胃蒸餾水0.2 mL，連續(xù)7 d，期間自由飲用蒸餾水和食用飼料。每天灌胃前稱量小鼠體質(zhì)量，觀察小鼠大便特征等，在第7天對(duì)小鼠進(jìn)行眼球取血、離心，吸取上層的血清，－80 ℃保存、備用；小鼠腹部消毒后，取出完整結(jié)腸組織，用預(yù)冷（4 ℃）的生理鹽水沖洗2～3 遍，濾紙吸干水分后對(duì)結(jié)腸組織進(jìn)行稱質(zhì)量和長(zhǎng)度測(cè)量。取距離肛門2 cm處的結(jié)腸組織6～10 mm放入體積分?jǐn)?shù)10%中性福爾馬林溶液中，用于結(jié)腸組織病理學(xué)分析；沖洗出的結(jié)腸內(nèi)容物置于－80 ℃保存，用于結(jié)腸內(nèi)容物菌群分析。

1.3.4 小鼠血清促炎因子TNF-α水平的測(cè)定

用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒測(cè)定小鼠血清中的促炎因子TNF-α水平。

1.3.5 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)分析

參考景亞萍[13]的方法制作病理切片，采用HE染色法對(duì)切片進(jìn)行染色，采用樹膠封存，在顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理學(xué)變化并參考Dieleman等[14]的方法進(jìn)行組織學(xué)損傷病理評(píng)分。

1.3.6 小鼠結(jié)腸內(nèi)容物菌群分析

采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取4 組小鼠結(jié)腸內(nèi)容物的基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度和濃度，檢測(cè)合格后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。選擇擴(kuò)增16S rRNA基因的V4區(qū)域，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行混樣和純化，構(gòu)建文庫后委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司利用Ion S5TMXL測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。使用Cutadapt軟件過濾并按barcode拆分樣本后，采用多種方法對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘和分析，分析小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2020和GraphPad Prism 8軟件作圖，采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理后小鼠體質(zhì)量和DAI變化

結(jié)腸炎可能導(dǎo)致小鼠飲食下降、皮毛松聳、活動(dòng)減少，進(jìn)而影響小鼠的體質(zhì)量和DAI，在不處死小鼠的情況下，小鼠體質(zhì)量和DAI的變化可以作為客觀指標(biāo)反映造模期間小鼠的結(jié)腸炎病變程度[15]。如圖1A、B所示，以DSS為誘導(dǎo)劑喂養(yǎng)的模型組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯受到了抑制，DAI極顯著增加（P＜0.01），說明小鼠急性結(jié)腸炎模型構(gòu)建成功，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)建模成功的結(jié)腸炎小鼠給予山藥多糖干預(yù)，結(jié)果如圖1C、D所示，DSS組小鼠體質(zhì)量極顯著低于CD組（P＜0.01），DAI極顯著高于CD組（P＜0.01），說明DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎能明顯使小鼠消瘦，影響小鼠健康狀態(tài)；經(jīng)山藥多糖干預(yù)后，CYH、CYF組與DSS組小鼠體質(zhì)量無顯著差異（P＞0.05），CYH組小鼠的DAI顯著低于DSS組（P＜0.05），CYF組小鼠的DAI極顯著低于DSS組（P＜0.01），且CYH和CYF兩組小鼠DAI沒有顯著差異，說明發(fā)酵液護(hù)色的山藥多糖與清水護(hù)色的山藥多糖效果一致，乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液護(hù)色的山藥多糖也有利于提升小鼠一般狀況，在一定程度上緩解結(jié)腸炎，但仍不能恢復(fù)至小鼠正常體質(zhì)量。這可能是因?yàn)樾∈笤诮Y(jié)腸炎緩解過程中需要消耗大量的能量用于免疫細(xì)胞的增殖，恢復(fù)體質(zhì)量仍需一段時(shí)間。

圖1 不同處理后小鼠體質(zhì)量和DAI的變化Fig. 1 Changes in body mass and DAI of mice

2.2 山藥多糖對(duì)小鼠促炎因子分泌的影響

促炎因子的過度產(chǎn)生是結(jié)腸炎患者的典型特征，其中TNF-α是結(jié)腸炎病理進(jìn)程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，會(huì)通過表達(dá)黏附分子、成纖維增殖因子、凝血因子以及啟動(dòng)細(xì)胞毒性、凋亡和急性期反應(yīng)等途徑加劇炎癥。由圖2可知，DSS組小鼠血清中的促炎因子TNF-α水平極顯著高于CD組（P＜0.01），經(jīng)山藥多糖干預(yù)后，CYH組和CYF組小鼠血清中的促炎因子TNF-α水平均極顯著低于DSS組（P＜0.01），且兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。說明乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液護(hù)色后的山藥多糖也能調(diào)節(jié)促炎因子TNF-α的分泌，從而改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，且效果與清水護(hù)色的山藥多糖相當(dāng)。

圖2 山藥多糖對(duì)小鼠促炎因子TNF-α分泌的影響Fig. 2 Effect of Chinese yam polysaccharides on the secretion of inflammatory factor TNF-α in mice

2.3 山藥多糖對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸的影響

2.3.1 山藥多糖對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度和質(zhì)量的影響

結(jié)腸炎可能會(huì)使得小鼠的結(jié)腸萎縮[16]，結(jié)腸質(zhì)量和長(zhǎng)度降低是結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸萎縮的典型特征[17]。從圖3可知，DSS組小鼠的結(jié)腸質(zhì)量、長(zhǎng)度均極顯著低于CD組小鼠（P＜0.01），說明DSS組結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸顯著萎縮。然而，CYH、CYF組小鼠結(jié)腸質(zhì)量、長(zhǎng)度均顯著高于DSS組小鼠（P＜0.05），且CYH和CYF兩組小鼠結(jié)腸質(zhì)量、長(zhǎng)度沒有顯著差異，這說明乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液護(hù)色后的山藥多糖也能改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸萎縮，從而改善DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，且效果與清水護(hù)色的山藥多糖相當(dāng)。

圖3 山藥多糖對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸質(zhì)量（A）和長(zhǎng)度（B）的影響Fig. 3 Effect of Chinese yam polysaccharides on colon mass (A) and length (B) in mice

2.3.2 山藥多糖對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織的影響

結(jié)腸組織充血、水腫、潰瘍和壞死等病變是結(jié)腸炎的典型特征。由圖4可知，CD組小鼠結(jié)腸黏膜光滑完整，上皮細(xì)胞整齊，能看到清晰的隱窩結(jié)構(gòu)；DSS組小鼠結(jié)腸隱窩基本被破壞，炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，病變位置深達(dá)肌層；CYH組和CYF組小鼠結(jié)腸中均能觀察到完整的黏膜下層結(jié)構(gòu)，病變范圍也明顯減少。通過進(jìn)一步切片分析，發(fā)現(xiàn)CYH組和CYF組間的病理評(píng)分無顯著差異（P＞0.05），但均顯著低于DSS組（P＜0.05），這說明乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液護(hù)色后的山藥多糖干預(yù)也可明顯緩解急性結(jié)腸炎小鼠的炎癥程度，減輕結(jié)腸炎小鼠的組織學(xué)損傷。該結(jié)果與上述的DAI、結(jié)腸長(zhǎng)度和質(zhì)量的結(jié)果保持一致。

圖4 小鼠結(jié)腸切片的HE染色圖和病理評(píng)分Fig. 4 Hematoxylin-eosin staining and histopathological scores of colon tissue in mice

2.4 山藥多糖對(duì)小鼠腸道菌群的影響

2.4.1α多樣性分析

由圖5A可知，小鼠腸道菌群的稀釋曲線隨測(cè)序數(shù)目增加趨于平坦，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，測(cè)序結(jié)果可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息[18]，箱型圖（圖5B）也驗(yàn)證了該結(jié)論。由圖5C可知，在垂直方向上，4 組曲線均前端平滑程度較好，末端有部分曲折，說明物種分布較為均勻；在水平方向上，CYH組的曲線在橫軸上的跨度最大，其次為CD組、CYF組，DSS組最小，說明DSS處理降低了小鼠腸道菌群豐富度，兩種山藥多糖處理均能提高結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群豐富度。腸道菌群豐富度降低是結(jié)腸炎患者的常見特征[19]。有研究表明，DSS處理會(huì)使腸道菌群的多樣性降低，改善DSS誘導(dǎo)的腸道菌群多樣性下降是緩解結(jié)腸炎的方法之一[20]，這提示乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液護(hù)色后的山藥多糖干預(yù)也有助于提高結(jié)腸炎小鼠腸道菌群多樣性，從而改善小鼠結(jié)腸炎。

Venn圖可用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中共有及獨(dú)有的操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），能夠相對(duì)直觀地反映樣本中物種的組成相似性及重疊情況。由圖5D可知，4 組樣品共有的OTU個(gè)數(shù)為469 個(gè)，分別占各組OTU數(shù)目的60.20%～77.27%，重疊度較高，說明4 組小鼠腸道菌群種類具有較高的相似性。DSS組與CD組共有521 個(gè)OTU，CYH組與CD組共有590 個(gè)OTU，CYF組與CD組共有546 個(gè)OTU，說明CYH組和CYF組小鼠的腸道菌群組成相比于DSS組與CD組更為相似，這提示乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液護(hù)色的山藥多糖可能也可以調(diào)節(jié)DSS誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)，使結(jié)腸炎小鼠腸道菌群組成接近正常小鼠。

圖5 小鼠腸道菌群多樣性分析Fig. 5 Diversity analysis of intestinal flora in mice

2.4.2 物種組成分析

腸道菌群失調(diào)被認(rèn)為可能是結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制之一[21-22]，使腸道菌群正?；侵委熃Y(jié)腸炎的可能途徑[23-24]。由圖6A可知，在門水平上，4 組小鼠腸道微生物的OTU主要由10 個(gè)門構(gòu)成：擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、軟壁菌門（Tenericutes）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、黑水仙菌門（Melainabacteria）及一個(gè)未定義菌門。其中擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度比值（F/B值）升高是腸道菌群失調(diào)的一個(gè)典型特征。由圖6B可知，DSS組小鼠的F/B值極顯著高于CD組（P＜0.01），說明經(jīng)DSS誘導(dǎo)后，小鼠腸道菌群顯著失調(diào)；經(jīng)多糖干預(yù)后，CYH組和CYF組小鼠的F/B值均顯著下降（P＜0.05、P＜0.01），說明經(jīng)乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液護(hù)色后的山藥多糖也有利于恢復(fù)DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群失調(diào)。

由圖6C可知，在屬水平上，4 組小鼠腸道微生物OTU主要由30 個(gè)屬構(gòu)成，比較CD組和DSS組在屬水平上物種豐度的差異發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過DSS誘導(dǎo)可降低以下益生菌的相對(duì)豐度：Lactobacillus、Blautia、Muribaculum、unidentified_Ruminococcaceae、Dubosiella、Akkermansia、Candidatus_Saccharimonas、Roseburia、Bifidobacterium、Enterorhabdus、Odoribacter、Ruminiclostridium；顯著增加以下有害菌的相對(duì)豐度：Bilophila、Parabacteroides、Alistipes、unidentified_Lachnospiraceae、Bacteroides、Parasutterella、Erysipelatoclostridium、unidentified_Enterobacteriaceae、Lachnoclostridium、unidentified_Erysipelotrichaceae、Faecalibaculum、Helicobacter、Oscillibacter、Anaerotruncus、Desulfovibrio。經(jīng)山藥多糖干預(yù)后，部分在DSS組中相對(duì)豐度顯著降低的屬會(huì)有所回升，其中在CYH組和CYF組中相對(duì)豐度均有所回升的屬有：Muribaculum、unidentified_Ruminococcaceae、Dubosiella、Roseburia、Bifidobacterium、Enterorhabdus、Odoribacter、Ruminiclostridium，僅在CYF組中相對(duì)豐度有所回升的屬有：Lactobacillus、Candidatus_Saccharimonas，Gao Ruichang等[25]在研究鱘魚水解物對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的影響中也觀察到了類似變化。

乳酸桿菌屬（Lactobacillales）和羅斯氏菌屬（Roseburia）是與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫相關(guān)的菌屬[26-27]，DSS組小鼠腸道菌群中，這兩種菌的相對(duì)豐度均低于CD組，而通過山藥多糖干預(yù)的CYH組和CYF組Roseburia的相對(duì)豐度均有所提高，CYF組的Lactobacillales相對(duì)豐度也相應(yīng)提高；擬桿菌屬（Bacteroides）和另枝菌屬（Alistipes）是常見的致病菌，它們與結(jié)腸炎的發(fā)生和惡化密切相關(guān)[28-29]，DSS組小鼠腸道菌群中，這兩種菌的相對(duì)豐度均高于CD組，而通過山藥多糖干預(yù)的CYH組和CYF組，Alistipes相對(duì)豐度有所降低，其中CYF組降低程度更大，CYF組的Bacteroides相對(duì)豐度也相應(yīng)降低。這說明經(jīng)乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液護(hù)色后的山藥多糖也能通過提高有益菌的相對(duì)豐度、降低有害菌的相對(duì)豐度，調(diào)節(jié)DSS誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂，使結(jié)腸炎小鼠腸道菌群相對(duì)豐度與正常小鼠更為相似，從而達(dá)到改善小鼠結(jié)腸炎的目的。

圖6 小鼠腸道菌群物種組成分析Fig. 6 Analysis of species composition of intestinal flora in mice

圖6D是屬水平豐度聚類熱圖，該圖更加直觀地反映了各組小鼠腸道菌群相對(duì)豐度的差異，其結(jié)果與相對(duì)豐度柱形圖相似。CD組和DSS組小鼠腸道菌群相對(duì)豐度明顯不同，CYF組與CD組則較為相似，再次驗(yàn)證了經(jīng)乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液護(hù)色后的山藥多糖能夠調(diào)節(jié)DSS誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群失調(diào)，從而改善小鼠結(jié)腸炎。

2.4.3β多樣性分析

β多樣性分析是對(duì)不同樣品或不同組間樣品的微生物群落構(gòu)成的比較分析。主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和非加權(quán)組平均法（unweighted pairgroup method with arithmetic means，UPGMA）聚類分析是常見的β多樣性分析方法之一。在PCoA圖中，DSS組與CD組相距較遠(yuǎn)，說明DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道微生物群落構(gòu)成與CD組明顯不同，CYH組、CYF組與DSS組相距較遠(yuǎn)，而與CD組相距較近（圖7A），說明與清水護(hù)色的山藥多糖效果一致，乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液護(hù)色后的山藥多糖干預(yù)也能恢復(fù)由DSS誘導(dǎo)的腸道微生物組成變化；在UPGMA聚類樹圖中，CD組先與CYF組聚為一類，再與CYH組聚為一類，最后與DSS組聚為一類（圖7B），說明經(jīng)乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液護(hù)色后的山藥多糖干預(yù)后的結(jié)腸炎小鼠腸道菌群群落構(gòu)成與正常小鼠最為相似，該結(jié)果不僅再次驗(yàn)證了乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液護(hù)色后的山藥多糖干預(yù)能恢復(fù)由DSS誘導(dǎo)的腸道微生物組成變化，還提示乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液護(hù)色后的山藥多糖對(duì)于調(diào)節(jié)由DSS誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群紊亂可能效果更佳。

圖7 基于非加權(quán)Unifrac距離的PCoA分析（A）和UPGMA聚類分析（B）Fig. 7 Principal co-ordinates analysis (PCoA) (A) and unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA) cluster analysis (B)based on unweighted Unifrac distance

3 結(jié) 論

本研究從發(fā)酵液護(hù)色處理的山藥中提取了粗多糖，研究了該粗多糖的抗結(jié)腸炎活性及機(jī)制。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)論如下：1）乳酸芽孢桿菌DU-106發(fā)酵液護(hù)色的山藥多糖也能顯著降低結(jié)腸炎小鼠的DAI、結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸長(zhǎng)度和結(jié)腸組織學(xué)損傷病理評(píng)分（P＜0.05），且與清水護(hù)色處理的山藥多糖無顯著差異；2）乳酸芽孢桿菌DU-106發(fā)酵液護(hù)色的山藥多糖也能顯著降低小鼠促炎因子TNF-α的分泌水平，且與清水護(hù)色處理的山藥多糖效果相當(dāng)；3）乳酸芽孢桿菌DU-106發(fā)酵液護(hù)色的山藥多糖也能通過提高結(jié)腸炎小鼠腸道菌群多樣性和有益菌的相對(duì)豐度，降低有害菌的相對(duì)豐度以及厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的豐度比值，調(diào)節(jié)由DSS誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)。在小鼠腸道菌群物種組成聚類分析中，CYF組與CD組腸道菌群結(jié)構(gòu)更為接近。綜上，乳酸芽孢桿菌DU-106發(fā)酵液護(hù)色處理后的山藥多糖也能改善DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)促炎因子的分泌及調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)。該結(jié)果可為山藥的加工以及含山藥多糖功能食品的開發(fā)研究提供理論依據(jù)。