張嘉琪 盤瑤

毒理學(xué)關(guān)注閾值方法是一種適合用于評估缺乏毒性資料但化學(xué)結(jié)構(gòu)明確且人體暴露量很低的化學(xué)物安全性的方法，其在歐盟已被廣泛使用于化妝品的安全評估，我國也將其納入到了2021年頒布的《化妝品安全評估技術(shù)導(dǎo)則》中。本文主要從毒理學(xué)關(guān)注閾值方法的發(fā)展歷程出發(fā)，對方法的原理、概念、數(shù)據(jù)庫的建立等內(nèi)容進行闡述，并以植物提取物和皮膚致敏閾值的建立為例，就其在化妝品安全評估中的應(yīng)用進行了探討。

關(guān)鍵詞：毒理學(xué)關(guān)注閾值；化妝品安全評估；決策樹；植物提取物；皮膚致敏閾值

01概述毒理學(xué)關(guān)注閾值（Threshold of Toxicological Concern，TTC） 方法是一種在對大量化學(xué)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征和相關(guān)毒理學(xué)數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，為不同類別化學(xué)物的人體暴露水平建立一個安全閾值的新的風(fēng)險評估工具。如果人體實際的暴露量低于該閾值，就可以預(yù)測其不會對人體健康造成危害[1]。

TTC 方法最開始應(yīng)用于食品包裝材料領(lǐng)域。1958年，美國聯(lián)邦食品、藥品和化妝品法案認為用于食品包裝材料的化學(xué)物有可能通過其包裝滲入到食品中，所以這些化學(xué)物應(yīng)當作為食品添加劑來進行安全評估[2]。但隨后人們意識到這些食品包裝材料只有極少一部分滲入到食品中，因此，1967年 Frawley 對食品包裝材料的安全管理問題作出了報告，TTC 方法的原理由此被提出，即當某種缺乏具體毒性數(shù)據(jù)的化學(xué)物對人體的暴露量低于某一閾值時，對人體健康產(chǎn)生的危害可以忽略不計[3]。

該方法符合歐盟（European Union，EU） 頒布的化妝品動物試驗禁令，因此其在歐洲率先被應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域。2007年歐洲化妝品協(xié)會（原 COLIPA） 就組織專家對其進行研討，建議可以使用 TTC 方法對化妝品成分進行安全評估[4]。2012年，歐盟消費品安全科學(xué)委員會（SCCS） 就應(yīng)用 TTC 方法對化妝品和消費品進行安全性評估發(fā)布了意見（SCCP/1171/08）[5]。我國國家藥品監(jiān)督管理局于2021年發(fā)布的《化妝品安全評估技術(shù)導(dǎo)則》中，明確指出“對于化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，且不包含嚴重致突變警告結(jié)構(gòu)的原料或風(fēng)險物質(zhì)，含量較低且缺乏系統(tǒng)毒理學(xué)研究數(shù)據(jù)時，可參考使用毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC） 方法進行評估”[6]?？梢?，TTC 方法在化妝品安全評估領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展前景十分廣闊，但在國內(nèi)只有較少文獻對該方法進行過研究。

TTC 方法經(jīng)歷了日益完善的發(fā)展過程，1984年，Gold 等基于770種化學(xué)物的3000多個長期、慢性實驗的毒性數(shù)據(jù)，建立了一個致癌潛因數(shù)據(jù)庫（Carcinogenic Potency Database，CPDB）[7]。1989年Rulis等通過分析 CPDB 中的343種嚙齒類致癌物的毒性資料，建立了慢性劑量與風(fēng)險概率分布之間的關(guān)系，按照致癌風(fēng)險為10－6外推，獲得了食品中化學(xué)物濃度的安全閾值0.15?g /（人·天）[8]。隨后，該閾值被被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA） 規(guī)定為“食品包裝材料管理閾值”[9]。在非致癌物的數(shù)據(jù)庫研究方面， Munro 等人建立了一個包含613種嚙齒類和兔類動物非致癌化學(xué)物的數(shù)據(jù)庫，通過分析這613種化學(xué)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和毒性關(guān)系，首次提出了以結(jié)構(gòu)分類為基礎(chǔ)的多層次的 TTC 方法[10]。

在上述背景下，基于概率法得出了不同化學(xué)物的 TTC 值，低于該值時可以認為出現(xiàn)不良影響的概率是很低的[11]。目前廣泛使用的 TTC 閾值來自上述兩個數(shù)據(jù)庫，即包含致癌性數(shù)據(jù)的 CPDB 和包含來自其他毒理學(xué)終點數(shù)據(jù)的 Munro 數(shù)據(jù)庫，兩者的毒性效應(yīng)都是基于口服暴露后的全身效應(yīng)[12]。

需要特別注意的是，TTC 方法適用于評估化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、能夠有效估計人體暴露量、濃度較低且缺乏毒性數(shù)據(jù)的化學(xué)物，但該方法不適用于金屬或金屬化合物、有很強生物蓄積性物質(zhì)（如多鹵化二噁英、二苯并呋喃或聯(lián)苯）、強致癌物（如黃曲霉毒素、亞硝基化合物、氧化偶氮類等）、類固醇、蛋白質(zhì)、高分子質(zhì)量的物質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)未知的混合物等[13]，其具體的排除原因見表1。

Cramer 決策樹是 TTC 方法建立和應(yīng)用的化學(xué)基礎(chǔ)，它是一種化學(xué)物分類方法，基于化學(xué)物的結(jié)構(gòu)及其毒性的關(guān)系，根據(jù)33個與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)的問題，將化學(xué)物分為 Cramer I 類、II 類和 III 類[14]，具體見表2。因此，許多化學(xué)物的安全暴露水平可以根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和具有相似結(jié)構(gòu)特征的化學(xué)物的已知毒性來確定。

隨著科技的進步，越來越多的計算機軟件或程序可用于對化學(xué)物及化妝品成分進行 Cramer 分類。例如，ToxTree軟件可提供對化學(xué)物的 Cramer 分類的評估[15]，Cosmos NG 和SpheraCosmolife可提供對某一特定暴露量是否會超過其對應(yīng)的 TTC 值的評估[16]，這些工具同時也促進 Cramer 分類方法的不斷更新[17]。

02TTC 方法在化妝品領(lǐng)域的發(fā)展Kroes等人分析表明，根據(jù)化學(xué)物不同的吸收和代謝方式，可以實現(xiàn)將外部劑量外推到內(nèi)部劑量，因此 TTC 方法能夠用于化妝品的局部暴露[18]。但是，目前將 TTC 方法應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域遇到的挑戰(zhàn)主要有兩方面，一方面需要建立一個對口服毒性研究期間產(chǎn)生的內(nèi)部劑量進行相關(guān)評估的數(shù)據(jù)庫，另一方面來自于暴露途徑。

首先，建立 TTC 數(shù)據(jù)庫一直受到極大關(guān)注，這些數(shù)據(jù)庫為 TTC 方法在不同領(lǐng)域的應(yīng)用提供了閾值計算的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。由于 Munro 數(shù)據(jù)庫中納入的化妝品相關(guān)化合物較少[19]，而數(shù)據(jù)庫的完整性對于 TTC 閾值的確定非常關(guān)鍵。針對化妝品原料，歐盟 SEURAT-1 COSMOS 項目對用于化妝品相關(guān)的化學(xué)物進行了非致癌 TTC 的深入研究。該項目獲得的 Cosmos-TTC 數(shù)據(jù)庫包含552種化學(xué)物（495種化妝品成分），為化妝品相關(guān)物質(zhì)提供了更可靠的閾值[20]。為了擴大數(shù)據(jù)庫的化合物覆蓋范圍，同時對重復(fù)劑量毒性數(shù)據(jù)進行匯總，以獲得實用且保守的閾值，2017年 Yang 等人將 Cosmos-TTC 和 Munro 兩個數(shù)據(jù)庫聯(lián)合起來建立了新的“聯(lián)合集”（Federated DB）[21]。隨后，2020年 Patel 等人將日用香料研究所（Research Institute for Fragrance Materials，RIFM）TTC 數(shù)據(jù)庫中 Cramer 類別 I、II 和 III 中的238、76和162種香料化學(xué)物整合到 Federated DB 中，得出了對應(yīng)的 TTC 值[22]。這四種不同數(shù)據(jù)集的 TTC 值概述，具體見表3。

Cosmos-TTC 數(shù)據(jù)集中的 Cramer II 類沒有提出 TTC 值，是因為 Cramer II 類和 III 類化學(xué)物的分布在該數(shù)據(jù)集中有重疊[23]。SCCS 認為，目前 Federated DB 數(shù)據(jù)集提

出的 Cramer III 類和 I 類分別為2.3、46μg/kg bw/day 的

閾值適用于化妝品相關(guān)物質(zhì)的安全評估[24]

其次，人體對大多數(shù)化妝品的接觸都是通過皮膚暴露進行的，但對于大多數(shù)物質(zhì)來說，目前進行的重復(fù)劑量口服研究要比重復(fù)劑量皮膚研究多得多。因此，可用的皮膚重復(fù)劑量研究數(shù)據(jù)庫太小，無法得出有意義的概率分布和閾值。除此之外，許多物質(zhì)通過口服的暴露量是高于通過皮膚的暴露量的，使用基于口服重復(fù)劑量數(shù)據(jù)的閾值來評估應(yīng)用于皮膚的成分還有很多有待解決的問題[24]。

綜上所述，使用 TTC 方法進行安全評估時，需要考慮不同代謝途徑的差異是否會影響從口服數(shù)據(jù)得出的 TTC 值的適用性，化學(xué)物的理化特性和化妝品的使用方式都會影響用于與 TTC 值相比較的內(nèi)部暴露劑量[25]。

03TTC 方法在化妝品安全評估中的應(yīng)用

近年來，含有植物成分的化妝品、消費品逐漸增多，植物提取物的安全性也受到越來越多的關(guān)注。植物提取物是成分復(fù)雜的混合物，由于天然化學(xué)成分多數(shù)是未知的，其毒性數(shù)據(jù)也十分缺乏，TTC 方法可以很好的解決這一難題[26]。對于植物提取物，Kawamoto 等人研究得出，90?g/day 的 TTC 值是足夠保守的[27]。對于具有潛在遺傳毒性物質(zhì)的情況，Mahony 等人也提出了10?g/day 的 TTC 值用于植物提取物的安全評估[28]。

由于建立 TTC 方法所使用的數(shù)據(jù)庫中的毒性資料主要來源于動物的系統(tǒng)毒性研究，因此獲得的 TTC 閾值僅涉及口服給藥后的全身毒性[29]。而皮膚致敏等局部毒性是進行化妝品安全評估需要主要考慮的毒性效應(yīng)，因此很有必要建立針對皮膚致敏的 TTC 方法。

有研究對可用的皮膚致敏性數(shù)據(jù)進行了概率分析，建立了皮膚致敏閾值（Dermal Sensitization Threshold， DST），低于該閾值時，即使是未經(jīng)測試的化學(xué)物，也可以認為是沒有明顯致敏風(fēng)險的。首先假設(shè)所有化學(xué)物中有20%是致敏劑，以洗發(fā)水和除臭劑為示例產(chǎn)品類型計算其 DST，原因是洗發(fā)水是一種廣泛使用的淋洗產(chǎn)品，預(yù)計其暴露量較低，而除臭劑是一種廣泛使用的駐留產(chǎn)品，可提供較高的暴露量。兩者的 DST 分別為1.64和0.55μg/ cm?，不超過可接受暴露水平（Acceptable Exposure Level，AEL）的概率為95%。除此之外，它們也適用于致敏評估因子（Sensitization Assessment Factor，SAF）為100或300的任何產(chǎn)品[30]。

這與Rulis研究致癌性時采取的方法類似，但兩者的根本區(qū)別是， DST 不是單個值，應(yīng)用于不同 SAF 產(chǎn)品時會有所不同。此外，DST 的單位為μg/cm?，該值的大小取決于產(chǎn)品的使用方式（即單位皮膚表面積使用的產(chǎn)品量、淋洗與駐留等）。如果皮膚使用量足夠低，使用 DST 將不需要對其進行致敏性試驗。然而，DST 只是一種概率方法，由于數(shù)據(jù)集有限，分析中也存在不確定性，它并不能保證每一種化學(xué)物的安全性[31]。

簡而言之，DST 方法基于 TTC 原則，即使未對化學(xué)物進行致敏性測試，也可以確定化學(xué)物的皮膚致敏風(fēng)險[32]。由于在確定 TTC 的致癌性和系統(tǒng)毒性時使用了95%的概率水平，所以通常認為此概率是合適的。但是化學(xué)物的皮膚致敏效力可能很強或極強，這使得應(yīng)用 DST 方法進行化妝品安全評估時產(chǎn)生了較大的不確定性。隨后有研究對該方法進行了改進，將化學(xué)物分類為無反應(yīng)性、無代謝反應(yīng)性和反應(yīng)性化學(xué)物，同時設(shè)置無反應(yīng)性、無代謝反應(yīng)性化學(xué)物的 DST 為900μg/cm?，使用該值將有助于減少對此類化學(xué)物進行動物試驗的需要。對于反應(yīng)性化學(xué)物則需要逐個進行安全評估，通過上述改進可以提高 DST 方法的可靠性和穩(wěn)定性[33]。

04展望

TTC 方法應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域的安全評估，綜合考慮了不同化學(xué)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、不同的代謝途徑、毒性數(shù)據(jù)庫是否完善，已經(jīng)被證實是一種科學(xué)的且具有實用價值的安全評估方法。然而，目前 TTC 方法仍然在基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫和局部暴露等方面存在著一些有待解決的關(guān)鍵問題。因此，還應(yīng)當通過擴大毒理學(xué)數(shù)據(jù)庫、完善補充決策樹等不同的方式來增加該方法在化妝品領(lǐng)域應(yīng)用的準確性和可靠性，使 TTC 方法能有效保護人群健康，提高化妝品的質(zhì)量安全。

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