朱巖 王紅 代寧 鄭敏學(xué) 楊蕾 馬艷麗

摘要：為獲得大花卷丹百合的優(yōu)質(zhì)種苗，促進(jìn)其規(guī)?；a(chǎn)，以大花卷丹百合的鱗片為外植體，采用MS、N6、B5培養(yǎng)基，添加激素NAA、6-BA、GA3，進(jìn)行了大花卷丹百合的快繁技術(shù)研究。結(jié)果表明，外植體在N6培養(yǎng)基中產(chǎn)生愈傷組織最快、效果最好。愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為N6+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA;不定芽增殖最佳培養(yǎng)基為N6+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3。NAA誘導(dǎo)小鱗莖效果最佳，最適培養(yǎng)基為 N6+1.0 mg/L NAA;促進(jìn)小鱗莖膨大生根要在誘導(dǎo)鱗莖的基礎(chǔ)上加入IBA，即最適培養(yǎng)基為N6+0.1 mg/L NAA+2.0 mg/L IBA。

關(guān)鍵詞：大花卷丹百合;組織培養(yǎng);快繁技術(shù)

中圖分類號(hào)：S682.2? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：1001-1463（2022）09-0076-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2022.09.018

Study on Techniques of Rapid Propagation for the Tissue Culture of Lilium leichtlinii var. maⅹimowiczii （Regel） Baker

ZHU Yan， WANG Hong， DAI Ning， ZHENG Minxue， YANG Lei， MA Yanli

（College of Landscape Architecture， Changchun University， Changchun Jilin 130012， China）

Abstract： To obtain the premium seedlings of Lilium leichtlinii var. maximowiczii（Regel） Baker and to promote its large-scale production， using scales as the explant， MS， N6 and B5 media with the addition of NAA， 6-BA and GA3 were applied to conduct the study on techniques of rapid propagation for the tissue culture of Lilium leichtlinii var. maximowiczii（Regel） Baker. Results showed that N6 medium was the quickest and the best medium to induce the callus formation， optimum medium for the induction of callus and adventitious buds was N6 plus 1.0 mg/L 6-BA plus 0.1 mg/L NAA. The optimum medium for adventitious bud proliferation was N6 plus 0.5 mg/L 6-BA plus 0.1 mg/L NAA plus 1.0 mg/L GA3. NAA showed the best effect in inducing small bulblets and the optimum medium was N6 plus 1.0 mg/L NAA whereas IBA ought to be added to promote the rooting of bulblet enlargement with the optimum medium selected as N6 plus 1.0 mg/L NAA plus 2.0 mg/L IBA.

Key words：? Lilium leichtlinii var. maximowiczii （Regel） Baker; Tissue culture; Rapid propagation technique

大花卷丹百合[Lilium leichtlinii var. maximowiczii （Regel） Baker]是百合科百合屬球根花卉，原產(chǎn)我國(guó)秦嶺山區(qū)、華北和東北地區(qū)，是一種觀賞價(jià)值較高的花卉。由于種球自毒的原因，組培擴(kuò)繁是大花卷丹百合重要的繁殖方式，組培快繁體系有一定的基因差異性，因此，規(guī)?；a(chǎn)需要建立高效的再生體系。成海鐘等[1 ]研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L 6-BA或KT可顯著提高百合繼代培養(yǎng)中芽的增殖效果，6-BA的效果優(yōu)于KT的效果;石印等[2 ] 研究發(fā)現(xiàn)，大花卷丹組織培養(yǎng)啟動(dòng)階段添加6-BA和NAA可獲得較好的不定芽誘導(dǎo)率，其中6-BA效果較明顯。大量研究證明，植物組織培養(yǎng)是植物繁育過(guò)程中高效、安全、可推廣得最適方法，探索大花卷丹百合組織培養(yǎng)最適宜培養(yǎng)基在實(shí)際生產(chǎn)中具有重要意義。

1? ?材料和方法

1.1? ?供試材料

供試大花卷丹百合鱗莖于2020年10月采自吉林省輝南縣博碩寒地花卉基地。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ? 試驗(yàn)條件及外植體預(yù)處理? ? 組織培養(yǎng)室溫度控制在（25±1） ℃[3 ]，光周期為16 h光照/8 h黑暗，光強(qiáng)為1 500～2 000 lx，空氣相對(duì)濕度為65%。培養(yǎng)基中均添加30 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂，pH 5.8～6.2。每處理接種30個(gè)，設(shè)3次重復(fù)，下同。

將百合鱗片輕輕取下，用洗衣粉水浸泡20 min，自來(lái)水沖洗1 h。將外植體置于超凈工作臺(tái)上，用75%酒精消毒30 s后用去離子水漂洗3遍，再用0.1%升汞處理15 min，去離子水漂洗3遍，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，備用。

1.2.2? ? 外植體切割方式篩選? ? 在N6培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，制成誘導(dǎo)培養(yǎng)基。選取生長(zhǎng)狀況良好的中部鱗片，經(jīng)消毒處理后，將整個(gè)鱗片、半個(gè)鱗片、縱向長(zhǎng)條鱗片（寬約0.10～0.15 cm）分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20 d后觀察鱗片愈傷組織形成情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3? ? 基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選? ? ?選用N6、MS、B5作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加相同濃度的6-BA（1.0 mg/L）和NAA（0.1 mg/L）。將消毒處理后的百合鱗片沿其縱軸方向切成寬0.10～0.15 cm的長(zhǎng)條形小塊，接種于培養(yǎng)基上，記錄愈傷組織形成的時(shí)間及誘導(dǎo)出愈傷組織的數(shù)量。

1.2.4? ? 愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)? ? ?以N6為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L）和6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L），制成不同配比組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將消毒處理后的百合鱗片沿其縱軸方向切成寬0.10～0.15 cm的長(zhǎng)條形小塊，接種于培養(yǎng)基中，先在黑暗條件下培養(yǎng)7 d，后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，18 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織及不定芽的誘導(dǎo)。

1.2.5? ?不定芽增殖培養(yǎng)? ? ?以N6為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0.1、0.3 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、GA3（0.5、1.0 mg/L），制成不同配比組合的增殖培養(yǎng)基。叢生芽長(zhǎng)度約為2 cm時(shí)，將其切成單叢，接種在增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)及生長(zhǎng)情況。

1.2.6? ?小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)? ? ?以N6為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0.5、1.0 mg/L）和6-BA（0、0.5 mg/L），制成不同配比組合的鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將叢生芽分割成合適的單叢，接種于鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，25 d后統(tǒng)計(jì)不定芽平均形成鱗莖數(shù)，記錄生長(zhǎng)情況[4 ]。

1.2.7? ? 小鱗莖膨大生根培養(yǎng)? ? ?以N6為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L）和IBA（1.0、1.5、2.0 mg/L），制成不同配比組合的生根培養(yǎng)基，將帶有小鱗莖的叢生芽接種于生根培養(yǎng)基中， 25 d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)并觀察記錄生長(zhǎng)情況[5? ]。

1.3? ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

誘導(dǎo)率=（出芽外植體數(shù)/接種數(shù)）×100%;

增殖倍數(shù)=增殖總芽數(shù)/接種總芽數(shù);

不定芽平均形成鱗莖數(shù)=不定芽形成的鱗莖總數(shù)/接種的不定芽總數(shù);

數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 23進(jìn)行分析。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ?外植體切割方式誘導(dǎo)篩選

比較鱗片不同切割處理方式發(fā)現(xiàn)，相比整個(gè)鱗片或半個(gè)鱗片接種，按百合鱗片縱軸方向切成寬0.10～0.15 cm的長(zhǎng)條形小塊可獲得更多的愈傷組織（表1）。

2.2? ?基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選

從表2可知，MS、N6、B5培養(yǎng)基均對(duì)愈傷組織的形成有一定的促進(jìn)作用。其中N6作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)大花卷丹百合的誘導(dǎo)培養(yǎng)效果最好;其次是MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基也可獲得較好的愈傷組織狀態(tài)，但愈傷組織形成的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng);B5作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通常用作木本植物的組織培養(yǎng)中，在本試驗(yàn)中的存活率及誘導(dǎo)愈傷組織的效果表現(xiàn)最差，不適宜大花卷丹百合快速繁育培養(yǎng)。

2.3? ?愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

在光培養(yǎng)下，外植體由白色逐漸轉(zhuǎn)為鮮綠色，經(jīng)過(guò)18 d的培養(yǎng)，鱗片創(chuàng)口出長(zhǎng)出淡黃綠色的愈傷組織，而后形成白綠色突起（圖1），28 d后突起處長(zhǎng)出不定芽，后進(jìn)行伸長(zhǎng)生長(zhǎng)（圖2）。其中N6+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)73.30%，與其他培養(yǎng)基差異顯著（表3）。即當(dāng)添加1.0 mg/L 6-BA 、0.1 mg/L NAA時(shí)，最適宜大花卷丹百合誘導(dǎo)愈傷組織及小鱗莖。

2.4? ? 不定芽增殖培養(yǎng)

從圖3可以看出，接種20 d后，叢生芽可見到明顯增殖，不同濃度及配比的6-BA、NAA、GA3對(duì)大花卷丹百合叢生芽增殖的影響差異顯著（表4）。其中N6+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3增殖倍數(shù)最高，為2.73倍，且與其他處理差異均顯著。即N6+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+ 1.0 mg/L GA3為大花卷丹百合最適宜的增殖培養(yǎng)基。

2.5? ? 小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)

叢生芽分株后的單芽，經(jīng)小鱗莖培養(yǎng)基培養(yǎng)25 d左右膨大并形成小鱗莖，其中N6 + 1.0 mg/L NAA處理誘導(dǎo)小鱗莖數(shù)個(gè)數(shù)最多，為5.56個(gè)，且與其他處理差異均顯著。即基礎(chǔ)培養(yǎng)基中只添加1.0 mg/L NAA，可獲得最好的小鱗莖增殖效果（圖4、表5）。

2.6? ?小鱗莖膨大生根培養(yǎng)

小鱗莖在膨大及生根培養(yǎng)基中12 d左右開始生根，21 d生根完成，對(duì)表6數(shù)據(jù)分析可知，NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，隨著IBA濃度不斷增加，小鱗莖膨大效果逐漸變好，且根系生長(zhǎng)狀態(tài)也轉(zhuǎn)好（圖5）。即當(dāng)IBA濃度為2.0 mg/L、NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，最適宜大花卷丹百合小鱗莖膨大及生根培育。

2.7? ?組培苗移栽

對(duì)組培苗進(jìn)行煉苗移栽，約8 d后開始長(zhǎng)出新葉（圖6），成活率達(dá)90%以上。

3? ?結(jié)論與討論

快速繁殖體系的建立對(duì)規(guī)范百合工廠化繁育流程、脫毒材料及種質(zhì)資源保存都具有重大意義。不同種類百合的形態(tài)特征、生理特性、器官的發(fā)生發(fā)育都存在著極大差異，這也直接導(dǎo)致了不同百合快速繁殖體系的建立擁有不同的培育方式及配方。如潘佑找等[6 ]研究發(fā)現(xiàn)百合外植體不同部位分化能力存在差異，其差異由強(qiáng)到弱為：鱗片、根、葉片。樊敏等[7 ]用蘭州百合不同外植體進(jìn)行了組織培養(yǎng)試驗(yàn)，獲得了較完善的數(shù)據(jù)。而本試驗(yàn)僅以鱗片為外植體，重點(diǎn)研究大花卷丹組織培養(yǎng)不同階段的最佳培養(yǎng)基，而不同外植體對(duì)其影響，有待進(jìn)一步試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，在激素種類含量相同的條件下，將大花卷丹鱗莖處理后分別接入MS、B5和N6的培養(yǎng)基中，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，外植體在N6培養(yǎng)基中產(chǎn)生愈傷組織最快、效果最好。愈傷組織及不定芽的誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為N6+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，不定芽增殖效果最佳的培養(yǎng)基為N6+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3，誘導(dǎo)小鱗莖最佳培養(yǎng)基為 N6+1.0 mg/L NAA，小鱗莖膨大生根培養(yǎng)時(shí)要在誘導(dǎo)鱗莖的基礎(chǔ)上加入IBA以促進(jìn)生根，最適培養(yǎng)基為N6+0.1 mg/L NAA+2.0 mg/L IBA。在以百合鱗莖為外植體建立快繁體系時(shí)，對(duì)于鱗片外植體的切割方式并沒有過(guò)于嚴(yán)格的要求，一般將鱗片消毒處理后一分為二接種到相應(yīng)培養(yǎng)基中。在本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將鱗片按照其縱軸方向切割成寬約0.10～0.15 cm的長(zhǎng)條形外植體材料，可獲得更好的愈傷組織增殖效果，且愈傷組織極易形成叢生芽，這在實(shí)際生產(chǎn)中可極大地減少原材料的成本。

大花卷丹百合自外植體接入培養(yǎng)基后，先是產(chǎn)生愈傷組織，而后在愈傷組織處，形成不定芽，不定芽經(jīng)擴(kuò)增繁殖后，在小鱗莖膨大培養(yǎng)基的作用下[8 ]，基部逐漸膨大，進(jìn)而形成籽球，經(jīng)過(guò)生根培養(yǎng)，小籽球產(chǎn)生一定的根系后，便可進(jìn)行煉苗移栽，直至形成完整植株。

本研究以大花卷丹百合的鱗片為外植體，經(jīng)過(guò)約120 d培養(yǎng)，最終建立了大花卷丹百合的快繁體系。使用最佳配方的繁殖系數(shù)最高可達(dá)25.49，這相對(duì)于自然繁殖，繁殖率大大提高，同時(shí)也縮短了培育時(shí)間。

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