張偉 陳雪潔 劉蓉 肖朝江 沈磊 田新雁 姜北

【摘要】目的：運(yùn)用模型大鼠探究民族民間藥物分心木（DJF）水提物預(yù)處理對(duì)單側(cè)腎缺血-再灌注損傷（RIRI）的防護(hù)作用。方法：SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、DJF水提物高、低劑量組。DJF水提物高、低劑量組在建模前，每天分別給予不同劑量的DJF水提物，連續(xù)用藥14 d，對(duì)照組和模型組以相同方式灌胃等體積的蒸餾水。DJF水提物組和模型組進(jìn)行缺血-再灌注處理，對(duì)照組只分離腎動(dòng)脈。24 h后，取血和腎臟組織。檢測(cè)各組大鼠血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的水平，腎臟組織黃嘌呤氧化酶（XOD）的活力，H&E染色觀察各組腎組織病理結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：與模型組相比，分心木水提物高劑量組，可顯著降低Cr、BUN、MDA的含量及抑制XOD的活性，提高SOD的活力，明顯改善腎臟結(jié)構(gòu)。結(jié)論：分心木水提物具有抑制XOD活性、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的功效，且可一定程度改善腎缺血-再灌注損傷后的腎功能。

【關(guān)鍵詞】分心木;水提物;腎缺血-再灌注損傷;氧化應(yīng)激;黃嘌呤氧化酶

【中圖分類(lèi)號(hào)】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2022）04-0025-04

Protective Effect of the Aqueous Extract of Diaphragma Juglandis Fructus on Unilateral Renal Ischemia-reperfusion Injury in Rats

ZHANG Wei1CHEN Xuejie1LIU Rong1XIAO Chaojiang1SHEN Lei1TIAN Xinyan2JIANG Bei1

1.Institute of Materia Medica， Dali University， Dali 671000， China;

2. Basic Medical College， Dali University， Dali 671000， China

Abstract：Objectives To investigate protective effect of aqueous extract of the folk medicine Diaphragma Juglandis Fructus （DJF） on rat model with unilateral renal ischemia reperfusion injury （RIRI）. ?Methods SD rats were randomly divided into control group， model group， high-dose and low-dose DJF aqueous extract groups. The DJF groups were given different doses of DJF aqueous extract for 14 consecutive days before the model was constructed. The control group and the model group were given the same volume of distilled water in the same way. The groups of DJF aqueous extract and model group were treated with ischemia-reperfusion. In the control group， only the renal artery was isolated. After 24 hours， blood and kidney tissues were taken. Then detect the contents of Cr， BUN， MDA， SOD， and the activities of XOD， renal tissues were taken for H&E staining to observe renal pathological changes in each group.Results Compared with model group， high-dose group of DJF aqueous extract significantly reduces contents of Cr， BUN， MDA， inhibits XOD activity， promotes SOD activity and improves renal structure. Conclusion Aqueous extract of Diaphragma Juglandis Fructus possesses ability of suppressing XOD activity and regulating oxidative stress response， and can improve renal function after RIRI to a certain extent.

Keywords：Diaphragma Juglandis Fructus; Aqueous Extract; Renal Ischemia-Reperfusion Injury; Oxidative Stress; Xanthine Oxidase

腎缺血-再灌注損傷（Renal ischemia reperfusion injury，RIRI）是指在腎臟缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后，損傷反而加重的現(xiàn)象，是引發(fā)急性腎損傷和腎衰竭的重要因素[1]。RIRI常見(jiàn)于休克復(fù)蘇、腎臟手術(shù)、腎移植等疾患[2]。研究[3-4]認(rèn)為，缺血-再灌注后自由基大量生成引發(fā)的細(xì)胞氧化損傷，是RIRI后腎功能受損的重要機(jī)制。其中黃嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase，XOD）系統(tǒng)是RIRI時(shí)自由基增加的重要途徑。因此，干預(yù)RIRI時(shí)XOD的水平，減少自由基的生成是減輕RIRI的有效途徑。

核桃（Juglans regia L.）又名胡桃，為胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans L.）植物。分心木（Diaphragma juglandis fructus，DJF），藥材拉丁名為Xeloseptum juglandis，為核桃果實(shí)子房室的木質(zhì)中隔，是漢族、白族、維吾爾族等多個(gè)民族以及民間常用藥材。民間主要用于治療腎虛遺精、遺尿、淋病、血尿、帶下、瀉痢以及失眠多夢(mèng)等多種疾病，有健脾補(bǔ)腎的功效[5];另外《山西中藥志》中明確記載：“分心木利尿清熱，治淋病尿血，暑熱瀉痢等癥。”現(xiàn)代藥理研究[6-7]結(jié)果顯示，分心木有抑制黃嘌呤氧化酶、抗氧化、抗炎、抑菌等活性。本課題組曾對(duì)云南分心木進(jìn)行了初步的研究，從中分離鑒定了齊墩果酸、柚皮素、兒茶素等近二十個(gè)成分，對(duì)分心木的化學(xué)成分有了初步的認(rèn)識(shí)[7]。鑒于分心木主要用于泌尿系統(tǒng)病癥，但目前有關(guān)分心木對(duì)腎缺血-再灌注損傷是否有保護(hù)作用以及作用機(jī)制尚不清楚，因此本研究擬通過(guò)構(gòu)建大鼠腎臟缺血-再灌注損傷模型，探討云南分心木水提物對(duì)腎臟缺血-再灌注損傷的防治作用，為深入研究開(kāi)發(fā)利用分心木的藥用價(jià)值提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重180～220 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完全依照大理大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)及大理大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2樣品和試劑實(shí)驗(yàn)用分心木（DJF）材料2019年購(gòu)于云南省大理市漾濞縣。肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、黃嘌呤氧化酶（XOD）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、BCA總蛋白定量測(cè)試盒（貨號(hào)依次為：C011-2-1、CO13-2-1、A002-1-1、A001-3-2、A045-4-2、A003-2-2）購(gòu)于南京建成生物工程研究所;羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3儀器酶標(biāo)儀（賽默飛世科爾科技有限公司）;CO2孵育箱（日本三洋電器公司）;多樣品組織研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）;BX53F正置顯微鏡（Olympus公司）;T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）;大鼠獨(dú)立通氣籠（蘇州市蘇杭科技器材有限公司）。

2方法

2.1供試樣品的制備取干燥分心木，粉碎后過(guò)120目篩，得分心木干粉。取干粉200 g置于蒸餾瓶中，加入500 mL蒸餾水，85 ℃回流提取3次，冷卻后過(guò)濾，合并濾液，濃縮凍干（每1 g凍干粉折合生藥12.5 g）得分心木水提物樣品DJF-W。

2.2建模和分組40只SD大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、模型組、DJF-W高、低劑量組，每組10只。各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行藥物干預(yù)。DJF-W凍干粉以蒸餾水溶解，高劑量組和低劑量組分別給予1 g/kg和0.5 g/kg劑量的 DJF-W 灌胃，連續(xù)用藥14 d，1次/d，灌胃體積為1 mL/100 g，對(duì)照組及模型組給予等量的蒸餾水灌胃。末次灌胃后1 h，采用切除大鼠右腎、夾閉左腎腎動(dòng)脈45 min，再灌注24 h的方法建立RIRI模型[8]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于術(shù)前禁食12 h，自由飲水。各組動(dòng)物以0.4 mL/100 g劑量的水合氯醛（10%）腹腔注射，待其充分麻醉后，仰臥位固定于加熱鼠板，備皮，消毒，沿腹白線逐層切開(kāi)，游離右側(cè)腎動(dòng)脈并永久性結(jié)扎，切除右腎并鈍性分離左側(cè)腎動(dòng)脈，將模型組及DJF-W高、低劑量組大鼠的左側(cè)腎動(dòng)脈用無(wú)損傷動(dòng)脈夾夾閉45 min;對(duì)照組不進(jìn)行夾閉，逐層縫合、關(guān)閉腹腔、消毒。術(shù)中應(yīng)用37 ℃生理鹽水使大鼠腹腔保持充分的水化。

2.3取材及生化指標(biāo)測(cè)定術(shù)后24 h，使用負(fù)壓采血管于大鼠腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置30 min后，3500 rpm離心15 min，收集上層血清，置于-20 ℃?zhèn)溆茫凑赵噭┖姓f(shuō)明書(shū)測(cè)定肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）的含量及超氧化物歧化酶（SOD）的活力;取腎組織用4 ℃生理鹽水清洗，濾紙吸干后稱重，每只大鼠取50 mg左右組織，按1∶[KG-3/5]9的比例加入0.9%生理鹽水，機(jī)械勻漿，3500 rpm，4 ℃離心10 min后取上清液得10%的腎臟組織勻漿。按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定黃嘌呤氧化酶（XOD）的活性。

2.4腎組織形態(tài)學(xué)病變檢測(cè)取相同部位腎組織，經(jīng)生理鹽水沖洗后，常規(guī)取材，脫水，包埋，制片。腎組織切片H&E染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并描述。

2.5數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)采用mean±SD在表格表示，SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVE）比較組間差異，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1RIRI模型構(gòu)建情況進(jìn)行缺血-再灌注處理的腎臟，在該過(guò)程中發(fā)生的變化如圖1，用無(wú)損傷動(dòng)脈夾阻斷腎臟血供時(shí)，腎臟由鮮紅色會(huì)逐漸變?yōu)樽虾谏?5 min后松開(kāi)動(dòng)脈夾，5 min內(nèi)腎臟顏色會(huì)逐步恢復(fù)。

3.2各組大鼠血清及腎組織生化指標(biāo)的比較

3.2.1腎臟功能指標(biāo)變化 DJF-W對(duì)大鼠血清中Cr和BUN水平的影響情況見(jiàn)表1，與對(duì)照組比較，模型組的大鼠血清Cr和BUN水平明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，DJF-W高劑量可顯著降低Cr和BUN的水平（P<0.05），低劑量樣品效果相對(duì)較弱，樣品效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性。

3.2.2氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)變化分心木水提取物對(duì)大鼠血清中SOD與MDA以及腎組織中XOD活力水平的影響情況見(jiàn)表2，與對(duì)照組相比較，模型組大鼠血清中MDA及腎組織中XOD的水平明顯升高（P<0.01），且血清中SOD的水平明顯降低（P<0.01）;與模型組比較，DJF-W高劑量可顯著降低MDA和XOD的水平（P<0.05），并且可顯著提高SOD的水平（P<0.01），低劑量樣品效應(yīng)最弱，樣品效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性。

3.2.3腎組織形態(tài)學(xué)變化分心木水提物對(duì)大鼠腎臟形態(tài)學(xué)的影響如圖2，將腎組織切片用H&E染色，于200倍數(shù)視野下進(jìn)行圖片采集，可以明顯看出對(duì)照組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管邊界完整，上皮細(xì)胞排列整齊，緊密。與對(duì)照組相比，模型組缺血45 min再灌注24 h后的腎臟表現(xiàn)為明顯的結(jié)構(gòu)破壞，腎小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)腫脹壞死，刷狀緣脫落，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管?chē)?yán)重?cái)U(kuò)張，腎小管細(xì)胞邊界不明顯，腎小管壞死，腎小球嚴(yán)重?fù)p傷。與模型組相比，分心木水提取物有不同程度的減輕RIRI所致的腎損害作用，其中高劑量水提取物的效果最為明顯。

4討論

腎臟是高血流灌注器官，良好的血液循環(huán)是腎臟組織排除代謝產(chǎn)物和獲取養(yǎng)分的基礎(chǔ)[9]。哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在有黃嘌呤脫氫酶（Xanthine dehydrogenase，XDH），可通過(guò)翻譯后修飾轉(zhuǎn)化為XOD[10]，XDH占機(jī)體XDH和XOD總活力的90%[11]。腎缺血時(shí)，次黃嘌呤和XOD大量堆積[12]，再灌注后，次黃嘌呤在XOD和O2的共同作用下生成大量活性氧（Reactive oxygen species，ROS）[13]。ROS極易與各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分發(fā)生反應(yīng)，干擾氧化應(yīng)激系統(tǒng)引起細(xì)胞氧化損傷[14]，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)破壞及功能障礙。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一[4]，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化物反應(yīng)的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物[15]，二者的水平可間接反應(yīng)機(jī)體抗氧化能力和氧化損傷的程度。血清中BUN和Cr是反應(yīng)腎臟功能的敏感性指標(biāo)，可間接反應(yīng)機(jī)體腎功能的強(qiáng)弱。

近年來(lái)，有關(guān)分心木的研究越來(lái)越多，結(jié)果表明分心木提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性[7，16];其中的酚酸類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物均具有良好的體外XOD抑制作用[6]。本文分心木水提物對(duì)RIRI的防護(hù)作用研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組XOD、MDA、Cr和BUN的水平明顯上升，SOD的活性明顯下降，表明大鼠腎臟缺血-再灌注后，機(jī)體出現(xiàn)了氧化損傷，腎臟功能下降;與模型組相比，分心木水提物1 g/kg組的大鼠XOD、MDA、Cr和BUN的水平明顯降低，體內(nèi)SOD活性提高，表明預(yù)處理分心木水提物可通過(guò)抑制XOD的活性干預(yù)ROS的來(lái)源，提高機(jī)體的抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激的損傷，改善RIRI后的腎功能，因此對(duì)腎缺血-再灌注損傷具有一定程度的防治作用。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了分心木傳統(tǒng)上用于腎虛相關(guān)性疾病、主要治療生殖系統(tǒng)與泌尿系統(tǒng)病癥的合理性[17]，可為臨床前研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為后續(xù)分心木的開(kāi)發(fā)利用提供思路。

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（收稿日期：2021-07-03編輯：劉斌）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 81760646）;大理大學(xué)滇西特色藥用植物與白族藥開(kāi)發(fā)利用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（ZKLX2019106）。

作者簡(jiǎn)介：張偉（1996-），男，漢族，碩士，研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)研究。E-mail：1186600486@qq.com

通信作者：姜北（1963-），男，漢族，博士，教授，研究方向?yàn)樗幱弥参锱c民族醫(yī)藥研究。E-mail： jiangbei@dali.edu.cn;田新雁（1988-），女，漢族，碩士，研究方向?yàn)槊褡逅幬锼幚韺W(xué)。E-mail： txybaoshan@163.com