勞景茂 韋小波 劉廣 鄧偉

摘要：目的：對結(jié)直腸癌中聯(lián)合檢測Kras、Braf基因突變的意義和價(jià)值進(jìn)行研究分析。方法：收集在我院行結(jié)直腸癌手術(shù)患者切除標(biāo)本80例，對DNA進(jìn)行提取后采用突變擴(kuò)增阻滯技術(shù)檢測Kras、Braf基因突變的狀態(tài)，并對基因突變和臨床特征的相關(guān)性加以分析。結(jié)果：KRAS基因突變率為 50.00%（40/80）， BRAF基 因 突 變 率 為5.00%（4/80），BRAF基因突變共4例，與 KRAS 存在共同突變情況;突變最多的是2號外顯子，占比為80.00%（32/40），12 密碼子G12S/G12D在KRAS基因2號外顯子中的突變最為常見，共17例，占比為53.13%（17/32）;KRAS基因突變合并BRAF的突變類型中，2號外顯子上G12S、G12D的合并BRAF例數(shù)是最多的;與KRAS基因突變率存在顯著正相關(guān)的是腫瘤部位、腫瘤浸潤深度;近端結(jié)腸患者KRAS 突變率明顯高于遠(yuǎn)端結(jié)腸癌和直腸患者（P<0.05）;浸潤深度為T4的患者KRAS基因突變率顯著高于浸潤深度為T1～3患者（P<0.05）;BRAF基因突變與腫瘤浸程度、分化程度有顯著相關(guān)性;浸潤深度為T4的患者BRAF基因突變率顯著高于浸潤深度為T1～3的患者（P<0.05）;低分化腫瘤患者BRAF基因突變率顯著高于中、高分化組（P<0.05）。結(jié)論：結(jié)直腸癌患者的Kras基因突變率高，其Braf基因突變均與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展之間存在相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：結(jié)直腸癌;Kras基因;Braf基因;突變;價(jià)值

結(jié)直腸癌 （Colorectal Cancer， CRC） 發(fā)生于結(jié)腸和直腸中，是一種常見的消化道惡性腫瘤。作為結(jié)直腸癌常規(guī)治療方法之一的化療已經(jīng)遇到了一定的困境和瓶頸，且越晚治療預(yù)后越差，但是結(jié)直腸癌目前還沒有確切的腫瘤標(biāo)志物來進(jìn)行早篩，腸鏡篩查又因?yàn)槟褪苄詥栴}而無法普及，因此找到結(jié)直腸癌的腫瘤標(biāo)直腸已經(jīng)成為了醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注的研究熱點(diǎn)之一。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，某些基因突變是導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的根本原因，認(rèn)為KRAS和BRAF基因突變與抗EGFR靶向治療之間的效果存在緊密相關(guān)性，抗EGFR靶向治療得到較好效果的患者大部分是KRAS和BRAF基因野生型[1～3]?；诖耍狙芯繉Y(jié)直腸癌中聯(lián)合檢測Kras、Braf基因突變的意義和價(jià)值進(jìn)行研究分析。

1一般資料和方法

1.1 一般資料

收集2018年9月～2021年9月在我院行結(jié)直腸癌手術(shù)患者切除標(biāo)本80例，其中男56例、女24例，年齡34～78歲，平均（63.24±10.34）歲。所收集的標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢驗(yàn)確診，且資料完整。

1.2 試劑與儀器

采購自廈門艾德的試劑盒，包含了石蠟包埋組織 DNA提取試劑盒及人類 KRAS/ BRAF基因突變檢測試劑盒;采購自美國Thermo fisher scientific公司的 Thermo Nano Drop 2000c超微量紫外分光光度計(jì);采購自德國安捷倫的Mx3 000P熒光定量PCR儀。

1.3 方法

1.3.1 石蠟切片樣品病理評估

對組織樣本進(jìn)行連續(xù)切片。選擇一塊較為清晰的組織切面進(jìn)行觀察，利用蘇木精和伊紅試劑進(jìn)行染色和評估，將切片放在顯微鏡下，用不同倍數(shù)進(jìn)行觀察。

以低倍鏡視野下對該切片的觀察情況作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析，標(biāo)記還沒有腫瘤侵犯部分出現(xiàn)的部分;細(xì)胞計(jì)數(shù)可以在高倍鏡視野下完成，原則上要對每個標(biāo)本中的五個視野左、右、中、上、下加以保證。然后在每個視野中對30個完整細(xì)胞加以連續(xù)計(jì)數(shù)，取其中的總和和平均數(shù)，如果平均腫瘤細(xì)胞達(dá)到超10%百分之十，則表示病理學(xué)承認(rèn)該樣本可用。

1.3.2 石蠟切片組織基因DNA提取

對樣品進(jìn)行蘇木精-伊紅的染色。從其余切片中刮取腫瘤組織，放入1.5 ml的EP試管中，進(jìn)行常規(guī)的脫蠟處理后，再采用手工-柱提取法嚴(yán)格按照提取盒的說明進(jìn)行操作。用紫光分光光度計(jì)對所提取的DNA進(jìn)行純度和濃度的檢測，所需達(dá)到的要求為1.8～2.0之間的純度A280/A260比值，使?jié)舛冗_(dá)到3.0 ng/?l。

1.3.3 突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)技術(shù)（Amplification Refractory Mutation System， ARMS）-PCR反應(yīng)

操作過程嚴(yán)格按照KRAS/NRAS/BRAF/PIK3CA 基因突變檢測試劑盒說明書中的內(nèi)容進(jìn)行。

PCR 反應(yīng)參數(shù)如下：95℃ 5 min，1個循環(huán);95℃ 25 s，64℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15個循環(huán);93℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31個循環(huán)。

在第三階段操作進(jìn)行到60℃時對羥基熒光素（FAM）和5-六氯熒光素氨基磷酸酯 （HEX）通道信號加以收集，判讀和分析遵循試劑盒說明書的判讀原則，并分析結(jié)果。每次反應(yīng)都對陽性和陰性對照加以設(shè)置以確保結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用比率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 KRAS、BRAF基因突變情況

KRAS基因突變率為 50.00%（40/80）， BRAF基 因 突 變 率 為5.00%（4/80），BRAF基因突變共4例，與 KRAS 存在共同突變情況。見表1。

2.2 KRAS基因突變類型和頻率

突變最多的是2號外顯子，占突變的80.00%（32/40），12密碼子G12S/G12D在KRAS基因2號外顯子中的突變最為常見，有17例，占53.13%（17/32）。KRAS基因突變合并BRAF的突變類型中，2號外顯子上的G12S，G12D的合并BRAF的的例數(shù)是最多的。見表2。

2.3 KRAS、BRAF基因突變情況與臨床病理特征的關(guān)系

與KRAS基因突變率存在正相關(guān)是腫瘤部位、腫瘤浸潤深度，近端結(jié)腸患者的KRAS 突變率明顯高于遠(yuǎn)端結(jié)腸癌和直腸患者 （P<0.05）。在浸潤深度為T4的患者中，KRAS基因突變率顯著高于浸潤深度為T1～3的患者（P<0.05）;BRAF 基因突變與腫瘤浸程度、分化程度有顯著相關(guān)性;在浸潤深度為T4的患者中，BRAF 基因突變率顯著高于浸潤深度為T1～3的患者（P<0.05）。在低分化腫瘤患者中，BRAF基因突變率顯著高于中、高分化組（P<0.05）。見表3。

3討論

Kras是一種鼠類肉瘤病毒癌基因，ras基因家族與人類腫瘤相關(guān)的基因有3種，即H-ras、K-ras和N-ras，分別定位在11、12和1號染色體上。K-ras因編碼21kD的ras蛋白又名p21基因。在ras基因中，K-Ras對人類癌癥影響最大，它好像分子開關(guān)，當(dāng)正常時能控制調(diào)控細(xì)胞生長的路徑;發(fā)生異常時，則導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長，并阻止細(xì)胞自我毀滅;它參與細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞，當(dāng)K-ras基因突變時，該基因永久活化，不能產(chǎn)生正常的ras蛋白，使細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)紊亂，細(xì)胞增殖失控而癌變[4]。

本研究發(fā)現(xiàn)，KRAS基因突變率為50.00%（40/80），BRAF基因突變率為5.00%（4/80），BRAF基因突變共4例，與KRAS存在共同突變情況;與KRAS基因突變率存在正相關(guān)的是腫瘤部位、腫瘤浸潤深度呈現(xiàn);近端結(jié)腸患者KRAS 突變率明顯高于遠(yuǎn)端結(jié)腸癌和直腸患者 （P<0.05）;浸潤深度為T4的患者KRAS基因突變率顯著高于浸潤深度為T1～3的患者（P<0.05）。

NRAS基因是RAS基因家族的一員，其編碼的N-ras蛋白在RAS-RAF-MEK-ERK通路中扮演著非常重要的角色，主要是負(fù)責(zé)整個細(xì)胞循環(huán)周期和基因轉(zhuǎn)錄活動，和細(xì)胞增殖有著密切的關(guān)系，該基因一旦發(fā)生致病性突變就會引起細(xì)胞增殖失控，從而形成腫瘤[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，BRAF基因突變與腫瘤浸程度、分化程度顯著相關(guān)性;浸潤深度為T4的患者BRAF 基因突變率顯著高于浸潤深度為T1～3的患者（P<0.05）;低分化腫瘤患者BRAF 基因突變率顯著高于中、高分化組（P<0.05）。

綜上，結(jié)直腸癌患者Kras基因突變率高，其Braf基因突變均與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展之間存在相關(guān)性。

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