朱潔 張斌 王英英 陳勇 褚以文 倪彩霞

摘要：目的 采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討地榆抗菌活性成分，并結(jié)合抗菌藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。方法 基于TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取地榆化學(xué)成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，通過Gene cards和OMIM數(shù)據(jù)庫獲取細(xì)菌感染靶點(diǎn)。通過Cytoscape構(gòu)建藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，采用DAVID數(shù)據(jù)庫開展預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的GO和KEGG分析。采用瓊脂二倍稀釋法對(duì)預(yù)測(cè)的活性成分進(jìn)行體外最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定，進(jìn)一步利用臨床分離菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa， PA）建立秀麗隱桿線蟲感染和藥物救治模型，觀察線蟲的存活情況，計(jì)算存活率。結(jié)果 共篩選出8個(gè)潛在活性成分，其中山奈酚和槲皮素Degree值高于平均Degree值，得到17個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)；GO和KEGG富集分析顯示地榆抗細(xì)菌感染主要涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答等生物學(xué)過程，主要作用與調(diào)控Toll樣受體、TNF、MAPK等信號(hào)通路相關(guān)。山奈酚對(duì)革蘭陽性菌MRSA和MSSA的MIC50和MIC90均為128 μg/mL。山奈酚、槲皮素對(duì)革蘭陰性菌銅綠假單胞菌的MIC50和MIC90均為128 μg/mL。與菌對(duì)照組比較，山奈酚（2.56 mg/mL）對(duì)MRSA和銅綠假單胞菌感染的秀麗隱桿線蟲存活率明顯升高（P<0.05），槲皮素（5.12 mg/mL）可明顯提高銅綠假單胞菌感染線蟲的存活率（P<0.05）。結(jié)論 該研究初步揭示了山奈酚和槲皮素可能是地榆抗菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，其作用機(jī)制可能與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)等有關(guān)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定一定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：地榆；抗菌活性成分；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；初步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

中圖分類號(hào)：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Study on the Antibacterial active ingredients of Sanguisorba officinalis based

on network pharmacology and preliminary experimental verification

Zhu Jie， Zhang Bin， Wang Ying-ying， Chen Yong， Chu Yi-wen， and Ni Cai-xia

（Antibiotics Research and Re-evaluation Key Laboratory of Sichuan Province， Sichuan Industrial Institute of Antibiotics， School of Pharmacy， Chengdu University， Chengdu 610106）

Abstract Objective Based on the results of preliminary research in the laboratory， network pharmacology methods were used to explore the antibacterial active components and verified it with antibacterial pharmacodynamic experiments. Methods? ? Based on the TCMSP database to obtain the chemical constituents and corresponding targets of Sanguisorba officinalis， obtain bacterial infection targets through Gene cards and OMIM database， and map the drugs and disease targets to obtain the predicted targets of the chemical composition of Sanguisorba officinalis. The Cytoscape software was used to construct a component-target-disease network diagram， STRING database was used to build a protein interaction network， GO and KEGG analysis was constructed by DAVID database. The agar double dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration （MIC） of the predicted active ingredients. The clinical isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA） and Pseudomonas aeruginosa （PA） were used to infect Caenorhabditis elegans （C. elegans）. Established infection and drug treatment models under solid conditions， and verified the antibacterial activity of the predicted ingredients by observing the survivals of Caenorhabditis elegans. Results? ? Sanguisorba officinalis could have eight potential active ingredients， the degree values of kaempferol and quercetin were higher than the average degree value. There were 88 targets that may be related to the anti-drug resistant bacteria， while 17 key targets were obtained; GO and KEGG enrichment analysis showed that the resistance to bacterial infection of Sanguisorba officinalis was mainly involved in biological processes such as cell proliferation， cell apoptosis， and immune response， and the main effects were related to the regulation of Toll-like receptor， TNF， MAPK， and other signaling pathways. The results of MIC determination showed that the MIC50 and MIC90 of kaempferol against Gram-positive bacteria MRSA and MSSA were both 128 μg/mL. The MIC50 and MIC90 of kaempferol and quercetin against the Gram-negative bacteria PA were both 128 μg/mL. In addition， after C. elegans ware infected with clinical isolates， the lethalities of different strains to C. elegans were different. After treatment with drugs， the survival rates of infected C. elegans were significantly improved. Compared with the bacterial control group， the survival rates of kaempferol （2.56 mg/mL） against C. elegans infected by MRSA and PA were significantly increased （P<0.05）. Quercetin （5.12 mg/mL） could significantly increase the survival rate of C. elegans infected by PA （P<0.05）. Conclusion? ?The study initially reveals that kaempferol and quercetin may be one of the material bases for the antibacterial activity of Sanguis elmoides， and their mechanism of action may be related to the regulation of immunity and inflammation. This study lays a certain foundation for further experimental research.

Key words Sanguisorba officinalis; Antibacterial active ingredients; Network pharmacology; Preliminary experimental verification

細(xì)菌感染是致病菌或條件致病菌侵入機(jī)體并不斷增殖的病理癥狀，感染過程中產(chǎn)生的毒素和其他代謝產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)不斷被激活，臨床上常以抗生素對(duì)因治療。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在2000—2015年期間，全世界抗生素使用量較20世紀(jì)增長65%[1]。不少學(xué)者指出，抗生素濫用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥譜越來越廣，耐藥強(qiáng)度日益增強(qiáng)，甚至導(dǎo)致“超級(jí)細(xì)菌”頻繁出現(xiàn)。因此，抗生素濫用所致細(xì)菌耐藥性問題已成為全世界日益嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題[2-3]。2016年，o'Neill研究小組指出，若細(xì)菌耐藥性問題若得不到解決，預(yù)測(cè)到2050年全世界每年因此導(dǎo)致的死亡可能達(dá)1000萬人次[4]。如何解決此問題，有學(xué)者認(rèn)為一方面需制定和完善相關(guān)法律法規(guī)以加強(qiáng)對(duì)抗生素應(yīng)用的監(jiān)管，另一方面應(yīng)積極尋找抗菌譜廣，副作用小或無，對(duì)環(huán)境無污染且不易產(chǎn)生耐藥性的綠色抗生素[5]。

中藥具有多途徑，多靶點(diǎn)，毒性小，療效明確等優(yōu)點(diǎn)，其臨床應(yīng)用已有上千年歷史。近年來，不少學(xué)者致力于中藥抗菌活性成分的發(fā)掘，并發(fā)現(xiàn)某些中藥提取物或者單體化合物具有良好的抗菌活性[6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，地榆（Sanguisorba officinalis）水提取液對(duì)臨床分離菌株具有較好的抗菌活性，尤其對(duì)臨床耐藥菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus， MRSA），其MIC50和MIC90均為生藥2.1 mg/mL，口服給予劑量為10 g/kg的地榆水提取液可提高M(jìn)RSA所致急性腹腔感染模型小鼠的生存率[7]，但地榆發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)亟待進(jìn)一步探討。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（network pharmacology）是基于系統(tǒng)生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)科學(xué)、生物信息學(xué)等研究方法，通過多種數(shù)據(jù)庫構(gòu)建基因與藥物、疾病和靶標(biāo)等之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，研究中藥的“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”的系統(tǒng)性藥理機(jī)制和中醫(yī)潛在疾病的治療機(jī)制，是大數(shù)據(jù)時(shí)代藥物系統(tǒng)性和人工智能相關(guān)研究的新興學(xué)科。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)構(gòu)建多層次網(wǎng)絡(luò)模型，科學(xué)闡釋中醫(yī)藥科學(xué)性以及有效性，該方法目前已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥相關(guān)研究，但根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)手段，該方法存在一定局限性。首先，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)側(cè)重于定性研究，尚未考慮藥物劑量，中藥有效成分在體內(nèi)的實(shí)際分布和含量不明確。其次，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)尚無標(biāo)準(zhǔn)化研究方法，對(duì)于預(yù)測(cè)結(jié)果缺乏驗(yàn)證性研究。另外，部分?jǐn)?shù)據(jù)庫存在信息不全面，更新不及時(shí)等因素，使得網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果亦存在一定局限性和片面性。盡管網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)存在不可避免的局限性，但是它為中醫(yī)藥的研究提供了多維度研究策略，眾多學(xué)者以此為導(dǎo)向可對(duì)中醫(yī)藥進(jìn)行更深更廣的研究，推動(dòng)了中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究進(jìn)程。

本研究基于前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從整體性角度對(duì)地榆抗菌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制進(jìn)行探討，并結(jié)合抗菌藥效學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步驗(yàn)證，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究方向奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

受試藥物：地榆購自四川德仁堂藥業(yè)連鎖有限公司，經(jīng)鑒定符合2020年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。山奈酚和槲皮素均購自源葉生物科技有限公司，批號(hào)分別為G11A11L110978，C28J11Y6820。地榆水提液（含生藥1 g/mL）參照文獻(xiàn)制備[7]。

1.2 線蟲和菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213、銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922購自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。臨床菌株：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin sensitive Staphylococcus aureus， MSSA）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa， PA）、產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，來自于近2～3年成都地區(qū)醫(yī)院收集的臨床分離致病菌。標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株由本實(shí)驗(yàn)室保藏。野生型秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans， C. elegans）N2和大腸埃希菌OP50（Escherichia coli OP50）由本學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.3 主要培養(yǎng)基和試劑

LB液體培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20200616），線蟲生長培養(yǎng)基（NGM培養(yǎng)基[8]），PGS培養(yǎng)基[9]，MHA培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)20200730）。5-氟-2'-脫氧尿苷（5-fluoro-2'-deoxyuridine，F(xiàn)UDR）（源葉生物科技有限公司，批號(hào)M29GS150283）。蛋白胨（上海泰坦科技股份有限公司，批號(hào)P1857310）。膽固醇（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)111M033）。

1.4 主要儀器

Denley A400型多點(diǎn)接種儀（England）、BioTek光吸收酶標(biāo)儀、體式顯微鏡（SMZ-168，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司），恒溫恒濕培養(yǎng)箱（HWS型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司），立式高壓蒸汽滅菌器（LDZX-75L，上海申安醫(yī)療器械廠），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GNP-9080，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 地榆抗菌活性研究的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

（1）地榆潛在活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)：利用TCMSP數(shù)據(jù)庫[10]以生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，檢索地榆的潛在活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn)。利用PubChem和Chemical Book確定地榆活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)。

（2）地榆抗菌作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析：通過Gene cards[11]數(shù)據(jù)庫和OMIM以“bacterial infections”，“resistance gene”，“bacterial resistance”為關(guān)鍵詞，收集細(xì)菌感染相關(guān)基因，并與上述活性成分靶點(diǎn)取交集，所得靶點(diǎn)即為地榆抗菌的潛在作用靶點(diǎn)。將地榆活性成分、成分靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建“潛在活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

（3）蛋白間相互作用關(guān)系：將地榆抗細(xì)菌感染潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）。將PPI結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行相關(guān)拓?fù)鋵W(xué)分析。

（4）富集分析：將地榆抗細(xì)菌感染的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，以P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，限定物種為人類“Homo sapiens”進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。以Count值降序排列，選取前10位進(jìn)行可視化。

（5）地榆抗菌化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路可視化互作網(wǎng)絡(luò)：將成分、靶點(diǎn)以及KEGG富集分析所得前10條通路匯導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行可視化分析。

1.5.2 地榆預(yù)測(cè)活性成分對(duì)臨床菌株的體外抗菌作用

選擇MSSA、MRSA、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌產(chǎn)Esbls（Esbls+）和大腸埃希菌非產(chǎn)Esbls（Esbls-）各5株，采用瓊脂二倍稀釋法，進(jìn)行最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定。

1.5.3 地榆預(yù)測(cè)活性成分對(duì)秀麗隱桿線蟲感染模型的實(shí)驗(yàn)研究

（1）菌懸液的制備：將MRSA菌株、銅綠假單胞菌菌株復(fù)蘇，挑取單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)16 h。將菌懸液離心去上清后，用NS稀釋到所需濃度（A600約為1），備用。

（2）線蟲同期化處理：將5只懷孕成蟲接種到含E. coli OP50NGM平板上，20℃培養(yǎng)，過夜產(chǎn)卵后挑出所有成蟲，剩余卵繼續(xù)培養(yǎng)48～56 h后成L4期成蟲。

（3）感染平板及感染致死實(shí)驗(yàn)：根據(jù)文獻(xiàn)[12]改良感染模型，在PGS平板上均勻涂抹一定量的FUDR，防止線蟲繁殖，再涂抹上述制備好的菌懸液。按MRSA 100 μL/皿，PA50 μL/皿均勻涂布在PGS平板上，晾干倒置于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后挑取10條L4期未孕成蟲置于平板上，于20℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察線蟲生長情況，記錄線蟲死亡只數(shù)，連續(xù)觀察10 d。正常對(duì)照組加入等量的E. coli OP50菌液。所有組均重復(fù)3次。

（4）感染救治實(shí)驗(yàn)：分別吸取180 μL地榆水提液（含生藥1 g/mL），山奈酚（2.56 mg/mL）、槲皮素（5.12 mg/mL）倒入60 mm平板，再倒入PGS培養(yǎng)基，均勻搖晃至藥液完全溶解，晾干，再加入FUDR，后續(xù)步驟同上。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析方法

對(duì)MIC值，計(jì)算受試藥物MIC50和MIC90、MIC眾數(shù)及MICrange。線蟲感染實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，觀察線蟲生長情況，計(jì)算線蟲存活率，存活率=（存活只數(shù)/總只數(shù)）×100%，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，作存活率曲線圖。利用Graphpad Prism8統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析，log-rank檢驗(yàn)法用于組間差異顯著性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 地榆抗菌活性研究的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.1.1 地榆化學(xué)成分的篩選

經(jīng)過篩選獲得地榆化合物共41個(gè)，再以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件進(jìn)行篩選，最后得到地榆活性成分8個(gè)，見表1。其中鞣質(zhì)類3個(gè)，黃酮類2個(gè)，甾體類2個(gè)，有機(jī)酸類1個(gè)。其中度值較高（Degree>10）的化合物是DY2、DY3、DY8，即β-谷甾醇、山奈酚和槲皮素。

2.1.2 地榆抗耐藥菌相關(guān)靶點(diǎn)

地榆的8個(gè)活性成分在TCMSP、Drugbank數(shù)據(jù)庫中獲得并去重后，得相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)148個(gè)。將疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)對(duì)比取交集，篩選出共有靶點(diǎn)88個(gè)，繪制韋恩圖，見圖1。

2.1.3 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將活性成分與交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2所示。圖中共得到98個(gè)節(jié)點(diǎn)（8個(gè)成分，88個(gè)靶點(diǎn)）、225條邊。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析顯示，化合物的平均度值為17.125，說明地榆抗菌有多靶點(diǎn)屬性，其中度值較大（度值>10）的化合物為DY2、DY3和DY8，度值分別為15、31和78?；衔锿?fù)鋵W(xué)參數(shù)見表1。同時(shí)，許多靶點(diǎn)與多種成分相關(guān)，表明地榆發(fā)揮抗菌作用過程中其所含的不同化合物可能具有協(xié)同作用。

2.1.4共有靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將88個(gè)共有靶點(diǎn)上傳至String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，PPI網(wǎng)絡(luò)圖包含77個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)、254條相互作用連線。運(yùn)用Network analyzer分析其Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦?。選取Degree值在2倍中位數(shù)之上的靶點(diǎn)構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，共得到17個(gè)地榆抗細(xì)菌感染的關(guān)鍵靶點(diǎn)，見圖3。節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深其對(duì)應(yīng)Degree值就越大，該靶點(diǎn)的重要性也越大。邊越粗顏色越深對(duì)應(yīng)的Combine score越大，表示蛋白之間相互作用強(qiáng)度越強(qiáng)。由下圖可知，最關(guān)鍵靶點(diǎn)是JUN、TNF、RELA、MAPK1、IL6、TP53和AKT1。17個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)詳見表2。

2.1.5GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

對(duì)表2篩選出的17個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)通過David進(jìn)行富集分析，GO功能富集分析得到222個(gè)注釋信息條目（P<0.05），其中生物過程（BP）條目175個(gè)，細(xì)胞成分（CC）條目12個(gè)，分子功能（MF）條目35個(gè)，分別占78.8%、5.4%和15.8%。以Count值降序排列篩選出排名前10位的GO條目，見圖4。由圖4可發(fā)現(xiàn)，地榆抗細(xì)菌感染涉及的生物方面主要是DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子，凋亡過程負(fù)調(diào)控，炎癥反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄因子活性，基因表達(dá)正調(diào)控等；細(xì)胞方面關(guān)鍵靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞核漿、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、線粒體和溶酶體等；分子功能方面，關(guān)鍵靶點(diǎn)主要體現(xiàn)在與蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性和細(xì)胞因子活性等方面，GO功能富集分析結(jié)果提示地榆能通過多種生物學(xué)途徑發(fā)揮抗細(xì)菌活性作用。

以P<0.05為篩選條件，KEGG通路富集分析共得到90條通路，Count值降序排列可視化前10條KEGG條目，見圖5。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，17個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及的排名前10條通路包括3條信號(hào)通路（Toll樣受體、TNF、MAPK）、癌癥通路以及6條疾病通路（乙型肝炎、恰加斯病、百日咳、甲型流感、單純皰疹病毒感染、肺結(jié)核），結(jié)果提示地榆對(duì)于某些病毒引起的疾病可能有藥效作用。

2.1.6 地榆抗菌化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)可視化

將Degree大于10的化合物以及Degree在2倍中位數(shù)以上的靶點(diǎn)和前10條KEGG富集通路做可視化分析，結(jié)果見圖6。從圖中可看出，3個(gè)化合物，16個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，10條通路之間存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，提示地榆的活性成分通過不同的靶蛋白在多條通路中發(fā)揮作用。

2.2 地榆預(yù)測(cè)活性成分的抗菌藥效學(xué)研究

2.2.1 預(yù)測(cè)活性成分對(duì)臨床菌株的體外抗菌作用

肉眼觀察發(fā)現(xiàn)菌對(duì)照組正常生長。質(zhì)控菌株的MIC值在質(zhì)控范圍內(nèi)，說明本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和方法可靠。由表3可知，山奈酚對(duì)受試革蘭陽性菌MRSA和MSSA的MIC50和MIC90均為128 μg/mL。山奈酚、槲皮素對(duì)受試革蘭陰性菌銅綠假單胞菌的MIC50和MIC90均為128 μg/mL。山奈酚和槲皮素對(duì)大腸埃希菌抑菌作用較弱。

2.2.2 銅綠假單胞菌和MRSA對(duì)秀麗隱桿線蟲的感染致死判定

體式顯微鏡下觀察，線蟲感染細(xì)菌前呈曲線特征，咽部肌肉運(yùn)動(dòng)明顯，運(yùn)動(dòng)速度快，而細(xì)菌感染致死的線蟲，體長縮短，咽部無運(yùn)動(dòng)，呈透明僵直狀態(tài)，見圖7。

2.2.3 藥物對(duì)銅綠假單胞菌感染的秀麗隱桿線蟲存活率的影響

線蟲經(jīng)銅綠假單胞菌感染后，隨時(shí)間的延長，菌對(duì)照組線蟲運(yùn)動(dòng)功能逐漸降低，生長被抑制，身體越來越透明，甚至出現(xiàn)死亡，而正常對(duì)照組線蟲生長良好，身體粗長。由圖8可知，連續(xù)觀察10 d后，與菌對(duì)照組比較，地榆水提液（含生藥1 g/mL），山奈酚（2.56 mg/mL）、槲皮素（5.12 mg/mL）組線蟲存活率明顯升高，分別為60.0%、60.0%和63.3%差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2.4 藥物對(duì)MRSA感染秀麗隱桿線蟲存活率的影響

線蟲經(jīng)MRSA感染后，隨時(shí)間的延長，菌對(duì)照組線蟲運(yùn)動(dòng)功能逐漸降低，生長被抑制，身體越來越透明，甚至出現(xiàn)死亡，而正常對(duì)照組線蟲生長良好，身體亦粗長。由圖9可知，連續(xù)觀察10 d后與菌對(duì)照組比較，地榆水提液（含生藥1 g/mL），山奈酚（2.56 mg/mL）組線蟲存活率明顯升高，分別為63.3%，53.3%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；槲皮素（5.12 mg/mL）組存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

地榆來源于薔薇科植物地榆（Sanguisorba officinalis L.）或長葉地榆（Sanguisorba officinalis L var.longifolia（Bert.）Yu et Li）的干燥根，廣泛分布于世界各地，以北半球溫帶地區(qū)居多[13]。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，地榆化學(xué)成分豐富，主要包括皂苷、黃酮、鞣質(zhì)以及有機(jī)酸、甾體及蒽醌類[14]。本研究基于前期地榆水提取液對(duì)多種臨床耐藥菌均有抑制作用的研究基礎(chǔ)，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法對(duì)地榆抗菌作用活性成分進(jìn)行篩選，靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并結(jié)合抗菌藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步驗(yàn)證。

利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對(duì)地榆活性化合物進(jìn)行分析獲得8個(gè)活性成分，其中β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素的Degree大于10，分別為15、31和78。國內(nèi)外研究資料顯示上述3種化合物在體內(nèi)外試驗(yàn)中均有一定抗菌活性。Joanda等[15]通過微量稀釋法發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇對(duì)金黃色葡萄球菌菌株ATCC25923和大腸埃希菌（E. coli）有較強(qiáng)的抗菌活性，其MIC值分別為125和500 μg/mL。

此外，將β-谷甾醇同頭孢菌素類藥物頭孢曲松鈉和頭孢唑啉，喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星和諾氟沙星聯(lián)用時(shí)均能顯著降低常規(guī)抗菌藥物的MIC，提示β-谷甾醇可能具有一定的抗菌活性并和常規(guī)抗菌藥物之間存在協(xié)同效應(yīng)。Cruz等[16]研究發(fā)現(xiàn)，濃度為128 μg/mL的山奈酚與慶大霉素聯(lián)用時(shí)亦有協(xié)同作用，將慶大霉素MIC分別從16 μg/mL降低到4 μg/mL。山奈酚與阿米卡星聯(lián)用時(shí)亦存在協(xié)同效應(yīng)，可將山奈酚MIC從

128 μg/mL降至32 μg/mL，結(jié)果表明山奈酚的發(fā)揮效應(yīng)的基礎(chǔ)可能與結(jié)構(gòu)上的羥基苯基對(duì)蛋白質(zhì)具有親和力從而干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)合成有關(guān)。Lv等[17]發(fā)現(xiàn)，以12 h的間隔皮下注射給藥25 mg/kg槲皮素72 h，96 h內(nèi)記錄肺炎鏈球菌所致鼻內(nèi)感染模型小鼠存活率，槲皮素能顯著降低模型小鼠的肺組織水腫和病理損傷，抑制炎癥反應(yīng)，提高被感染小鼠的存活率，顯示出抗感染作用。此外，體外128 μg/mL槲皮素給藥4～6 h可殺死99.95%的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，且槲皮素與美洛培南之間存在協(xié)同作用，其抗菌活性可能是通過破壞細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)和下調(diào)blaVIM和ompC表達(dá)實(shí)現(xiàn)[18]。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素有一定抗菌活性，與常規(guī)抗菌藥物之間存在協(xié)同效應(yīng)，但研究較零散，較淺，多數(shù)只通過體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定MIC來判斷有無抗菌活性，無論是地榆還是其活性成分的系統(tǒng)研究，深入研究均鮮見報(bào)道。本研究通過體外測(cè)定MIC和體內(nèi)研究（臨床致病菌致秀麗隱桿線蟲感染模型）同時(shí)進(jìn)行山奈酚和槲皮素的抗菌藥效學(xué)研究，為后續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ)。

通過靶點(diǎn)互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖，篩選地榆抗菌的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要包括IL10、MYC、FOS、MAPK1、TNF、JUN、AKT1和ESR1等17個(gè)靶點(diǎn)，其中Degree值大于15的是JUN、TNF、RELA、MAPK1、IL6、TP53和AKT1。涉及的主要通路有Toll樣受體、TNF、MAPK、NF-κB、百日咳、甲型流感和單純皰疹病毒感染等。

Toll樣受體（Toll-like receptors， TLRs）是一類I型跨膜糖蛋白模式識(shí)別受體，其通過識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern， PAMP），激活天然免疫，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，在抗感染免疫反應(yīng)中擔(dān)任重要角色，是研究細(xì)菌性感染疾病分子機(jī)制的重要途徑之一[19]。TLR家族中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)13種受體，目前研究較多的是TLR2和TLR4，它們?cè)诩?xì)菌感染的炎癥反應(yīng)中起著重要作用，TLR2可識(shí)別革蘭陽性菌的PGN、LTA，革蘭陽性菌、革蘭陰性菌等，TLR4通過與CD4、MD-2或RP105構(gòu)成復(fù)合受體協(xié)同識(shí)別革蘭陰性菌的LPS[20-22]。NF-kB是多向性核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，由Rel蛋白家族成員以同源或者異源二聚體形式組成，位于TLRs介導(dǎo)的信號(hào)通路下游的重要位置，對(duì)應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖分化等過程的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用[23]。RELA即p56為NF-kB 5個(gè)家族成員之一，本研究結(jié)果中，該靶點(diǎn)Degree為22（表2），排第三，PPI預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其為17個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)之一（圖3），結(jié)果提示該靶點(diǎn)在地榆抗細(xì)菌感染分子機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用。MAPK是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者[24]。本研究結(jié)果中所展現(xiàn)出的JUN，CASP8，MAPK8，MAPK1，AKT1均是該通路上的重要靶點(diǎn)。NF-κB及MAPK信號(hào)通路是啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路，二者激活后通過不同途徑啟動(dòng)相關(guān)因子進(jìn)而大量上調(diào)IL-1B，IL-6，IL-8和TNF-α等促炎細(xì)胞因子以及抗炎性因子IL-10和趨化因子的表達(dá)導(dǎo)致炎癥失衡，引發(fā)一系列的細(xì)菌感染癥狀[22]。

基于現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法獲得的Degree值較大的地榆3個(gè)活性成分β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素均具有一定抗菌活性，與常規(guī)抗菌藥物之間存在協(xié)同效應(yīng)。將活性成分進(jìn)行度值評(píng)價(jià)，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析顯示，化合物平均Degree值為17.125。選取高于平均度值的化合物即山奈酚Degree為31，槲皮素Drgree為78進(jìn)行藥效學(xué)研究，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。體外MIC測(cè)定結(jié)果顯示山奈酚對(duì)受試革蘭式陽性菌MRSA和MSSA的MIC50和MIC90均為128 μg/mL。山奈酚、槲皮素對(duì)受試革蘭式陰性菌銅綠假單胞菌的MIC50和MIC90均為128 μg/mL，而對(duì)大腸埃希菌的抑菌作用較弱，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果以及已知文獻(xiàn)報(bào)道基本吻合，說明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的篩選與預(yù)測(cè)有一定準(zhǔn)確性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，地榆水提液（含生藥1 g/mL），山奈酚（2.56 mg/mL）對(duì)MRSA和銅綠假單胞菌感染的秀麗隱桿線蟲存活率明顯升高，槲皮素（5.12 mg/mL）可明顯提高銅綠假單胞菌感染線蟲的存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，山奈酚和槲皮素可能是地榆抗菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，其作用機(jī)制可能與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)以及文獻(xiàn)報(bào)道的Toll樣受體、MAPK、TNF、NF-kB和P13K-AKT等信號(hào)通路有關(guān)，通路上的關(guān)鍵靶點(diǎn)有JUN、TNF、RELA、MAPK1、IL6、TP53和AKT1等。本次研究初步證實(shí)了山奈酚和槲皮素具有一定的抗菌活性，可能是地榆抗菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。山奈酚和槲皮素同屬于黃酮類化合物，二者之間是否存在協(xié)同效應(yīng)，以及黃酮類化合物在地榆抗菌效應(yīng)中的作用程度，均有待進(jìn)一步探討。下一步課題組將通過一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選出的化合物和地榆水提取液進(jìn)行深入藥效學(xué)研究，同時(shí)結(jié)合本研究的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)的生物學(xué)過程、信號(hào)通路以及關(guān)鍵靶點(diǎn)的系統(tǒng)研究，從而闡釋地榆抗菌作用的系統(tǒng)藥理學(xué)機(jī)制，為地榆在抗感染領(lǐng)域中的應(yīng)用提供科學(xué)支撐。

參 考 文 獻(xiàn)

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